KONSTRUKSI PUSTAKA GENOM

Tibouchina langsdorffiana Baill

YASINTA RATNA ESTI WULANDARI

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2009

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN

SUMBER INFORMASI

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Konstruksi Pustaka Genom

Tibouchina langsdorffiana Baill adalah karya saya dengan arahan dari komisi

pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi

mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan

maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan

dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.

Bogor, Juli 2009

Yasinta Ratna Esti Wulandari

NIM G351040131

ABSTRACT

YASINTA RATNA ESTI WULANDARI. Construction of Genomic Libraries of

Tibouchina langsdorffiana Baill. Under direction of SUHARSONO and UTUT

WIDYASTUTI.

Tibouchina langsdorffiana Baill is tolerant plant to low pH and high

aluminum (Al). Due its tolerance, this plant may be used as source of Al tolerant

genes and model for tolerant plant to Al. Therefore genetic material of this plant

must be kept in genomic library. Genomic library plays a crucial role in

maintaining all genetic information belonging to an organism. This research aim

to construct the genomic library of Tibouchina langsdorffiana using BlueSTAR-

1 phage as a vector. The big fragments of plant DNA were obtained by partial

digestion of total DNA using 0.01 unit Sau3AI per g DNA at 37ºC for 30

minutes. By using 0.5 g insert DNA and the molarity ratio between insert DNA :

vector = 2.9 : 1, the titer of 1.7 x 105

plaque forming unit (pfu) per ml was

obtained. Analysis of the recombinant rate by blue-white screening showed that T.

langsdorffiana genomic library contains 8% phage recombinant. To determine the

size of insert DNA, pBlueSTAR-1 recombinant plasmid was digested by EcoRI.

This digestion resulted two DNA fragment, one is 2.1 kb fragment corresponding

to pBlueSTAR-1 plasmid, and the other is 10 kb fragment corresponding to insert

DNA. Since the genom size of T. langsdorffiana is unknown, Dissotis canescens

was used as reference, because both species belong to Melastomataceae family.

By using formula N = (ln (1-P))/( ln (1-f)), N = number of phage recombinant, f =

insert DNA length ratio against genom length, so the probability (P) of all T.

langsdorffiana genom found in genomic library is 17%.

Keywords: Tibouchina langsdorffiana, DNA, libraries, genomic, phage

RINGKASAN

YASINTA RATNA ESTI WULANDARI. Konstruksi Pustaka Genom

Tibouchina langsdorffiana Baill. Dibimbing oleh SUHARSONO dan UTUT

WIDYASTUTI.

T. langsdorffiana adalah tumbuhan yang toleran terhadap pH rendah dan

aluminium (Al) tinggi. Oleh sebab itu tumbuhan ini dapat digunakan sebagai

sumber gen dan tumbuhan model toleransi terhadap pH rendah dan Al tinggi.

Untuk memanfaatkan toleransi T. langsdorffiana terhadap pH rendah dan Al

tinggi dan kemampuannya dalam mengakumulasi Al, maka bahan genetik

tumbuhan ini harus disimpan di dalam pustaka genom. Pustaka genom sangat

penting untuk menyimpan seluruh informasi genetik yang dimiliki oleh suatu

spesies.

Penelitian ini bertujuan untuk melakukan konstruksi pustaka genom T.

langsdorffiana. Konstruksi pustaka genom dilakukan melalui beberapa tahapan

yaitu: isolasi DNA total tanaman, pemotongan parsial DNA tanaman, penyisipan

DNA T. langsdorffiana ke dalam fage , pengemasan DNA rekombinan,

transveksi fage rekombinan ke E. coli dan analisis pustaka genom. Analisis

pustaka genom meliputi eksisi dari fage menjadi plasmid, isolasi DNA plasmid,

transformasi genetik dan pemotongan DNA plasmid dengan enzim restriksi.

Ukuran 7-20 kb DNA T. langsdorffiana didapat dari pemotongan 1 g

DNA dengan 0.01 unit Sau3AI (Takara) pada 37ºC selama 30 menit. Pengemasan

hasil ligasi 0.5 g DNA T. langsdorffiana dengan BlueSTAR-1 dengan rasio

molaritas 2.9 : 1 menghasilkan titer sebesar 1.7 x 105

plaque forming unit (pfu)

tiap ml.

Hasil seleksi biru-putih menunjukkan bahwa pustaka genom T.

langsdorffiana yang dikonstruksi mengandung rata-rata 8% fage rekombinan.

Untuk mengetahui ukuran sisipan, plasmid pBlueSTAR-1 rekombinan dipotong

dengan enzim restriksi EcoRI yang menghasilkan dua fragmen DNA yaitu vektor

plasmid pBlueSTAR-1 yang berukuran 2.1 kb dan DNA T. langsdorffiana yang

tersisip yang berukuran 10 kb. Untuk mengetahui derajat kelengkapan suatu

pustaka genom, maka informasi ukuran genom dari suatu organisme harus

diketahui. Karena ukuran genom T. langsdorffiana belum diketahui, maka ukuran

genom Dissotis canescens digunakan sebagai dasar perhitungan karena kedua

spesies tersebut termasuk dalam famili Melastomataceae. Pada penelitian ini,

volume fage yang disintesis adalah 500 µl, sedangkan titer fage rekombinannya

adalah 8% sehingga jumlah total fage rekombinan adalah 6.8 x 103 pfu. Dengan

menggunakan rumus N = (ln (1-P))/( ln (1-f)), N = jumlah fage rekombinan, f =

rasio ukuran DNA sisipan terhadap ukuran genom, maka peluang (P) seluruh

genom T. langsdorffiana terdapat dalam pustaka genom adalah 17%. Hal ini

berarti bahwa peluang untuk mendapatkan sembarang potongan DNA di dalam

pustaka genom adalah 17%.

Kata kunci: Tibouchina langsdorffiana, DNA, pustaka, genom, fage

© Hak Cipta milik IPB, tahun 2009

Hak Cipta dilindungi Undang-Undang

Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa

mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk

kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan

laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan

tidak merugikan kepentingan yang wajar bagi IPB

Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya

tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB

KONSTRUKSI PUSTAKA GENOM

Tibouchina langsdorffiana Baill

YASINTA RATNA ESTI WULANDARI

Tesis

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Magister Sains pada

Program Studi Biologi

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2009

Judul Tesis : Konstruksi Pustaka Genom Tibouchina langsdorffiana

Baill

Nama : Yasinta Ratna Esti Wulandari

NIM : G351040131

Disetujui

Komisi Pembimbing

Dr. Ir. Suharsono, DEA. Dr. Ir. Utut Widyastuti, M.Si.

Ketua Anggota

Diketahui

Ketua Program Studi Biologi Dekan Sekolah Pascasarjana

Dr. Ir. Dedy Duryadi Solihin, DEA. Prof. Dr. Ir. Khairil A. Notodiputro, M.S.

Tanggal Ujian: 27 Juli 2009 Tanggal Lulus:

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr. Ir. Aris Tjahjoleksono, DEA

“Allah turut bekerja dalam segala sesuatu untuk mendatangkan kebaikan bagi mereka yang mengasihi Dia” Roma 8:28

Setitik usaha dan upaya kupersembahkan kepada...........

Suamiku Herdamon Budianto dengan segenap pengorbanan waktu dan kesabarannya, Buah hatiku Dimas dan Michelle dengan segala keluguan dan kepolosannya, Papa dan Mama serta Dek’ Aris yang tidak lelah mendampingi dan memberiku semangat.

Segala jerih payahku takkan pernah terwujud tanpa andil karya Maha Agung Allah Bapa. Puji dan syukur ke Hadirat-Mu..........Amin.

PRAKATA

Puji dan syukur penulis haturkan kepada „Bapa‟ oleh karena kasih dan

anugerah-Nya maka penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini. Judul yang

dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Maret 2006 sampai

Desember 2008 adalah Konstruksi Pustaka Genom Tibouchina langsdorffiana

Baill. Penelitian ini bertempat di Laboratorium Pusat Kerjasama Bioteknologi

Indonesia-Belanda (BIORIN) dan Laboratorium Genetika Molekuler dan Seluler

Tanaman, Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB) IPB,

Bogor.

Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr. Ir. Suharsono, DEA

selaku ketua komisi pembimbing dan Ibu Dr. Ir. Utut Widyastuti, M.Si. selaku

anggota komisi pembimbing yang telah banyak memberikan bimbingan dan saran

selama pelaksanaan penelitian dan penyusunan karya ilmiah, serta Dr. Ir. Aris

Tjahjoleksono, DEA selaku penguji yang telah banyak memberikan masukan

yang berguna dalam penyelesaian penulisan karya ilmiah ini.

Terima kasih atas dana penelitian Proyek DIPA BIOTROP Tahun 2005

dengan judul “Construction of genomic Library and Isolation of Gene Involved in

the Plant Tolerant to Low pH and High Solubility of Aluminium from Melastoma”

dengan contract agreement No. 13.1/PSRP/SP-PEN/IV/2005 atas nama Dr. Ir.

Suharsono, DEA. Terima kasih pula kepada rekan satu tim penulis yaitu Bapak Ir.

Hadisunarso yang telah bersama-sama melakukan penelitian dari awal hingga

berakhirnya penelitian ini. Terima kasih kepada Laboratorium BIORIN dan

Laboratorium PPSHB IPB yang telah menyediakan tempat dan fasilitas dalam

pelaksanaan penelitian. Terima kasih penulis sampaikan juga kepada Bapak

Abdul Mulya dan Mbak Pepi Elvavina, serta Bapak Adi atas kerjasama dan

bantuannya di laboratorium dan di rumah kaca.

Dalam kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih yang mendalam

kepada suami tercinta Herdamon Budianto atas pengertian dan kesabarannya

memperhatikan anak-anak saat penulis berada di laboratorium dan atas

bantuannya dalam membantu mengedit tulisan karya ilmiah ini, Papa & Mama,

Enpa & Enma atas dukungan semangat dan doanya, dek Aris yang telah

memudahkan transportasi penulis pada masa-masa penulisan, serta seluruh

keluarga dan kerabat atas doa, semangat dan kasih sayangnya, juga buat rekan-

rekan yang berjuang bersama di Laboratorium BIORIN yaitu Ibu Sri Listyowati,

Bu Ratna Yuniati, Pak Ulung, Pak Muzuni, Mbak Hanum, Bu Yohana, Niken,

Pak Azis, Pak Neo, Rizky, Mbak Emma, Goto, dan Lulu.

Semoga Allah Bapa membalas kebaikan mereka dan semoga karya ilmiah

ini dapat bermanfaat.

Bogor, Juli 2009

Yasinta Ratna Esti Wulandari

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Jayapura pada tanggal 2 Januari 1981 dari ayah Drs.

F.X. Soewarto Citrotaruno, M.S. dan ibu M.G. Soewarti Pujirahayu, S.E., M.M.

Penulis merupakan putri pertama dari dua bersaudara. Pada tahun 2005, penulis

menikah dengan Hugo Herdamon Budianto, SP. dan saat ini telah dikaruniai dua

orang buah hati yaitu Alexander Dimas Raditya dan Brigita Michelle Radisti.

Tahun 1999 penulis lulus dari SMU Stella Duce I Yogyakarta dan pada

tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur undangan seleksi masuk

IPB (USMI). Penulis memilih Program Studi Biologi, Departemen Biologi,

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.

Selama menjadi mahasiswa IPB, penulis pernah menjadi panitia Biologi

Interaktif dalam rangka Dies Natalis IPB ke-36, dan menjadi pengurus Organisasi

Himpunan Mahasiswa Biologi (HIMABIO) periode 2001/2002 dan 2002/2003.

Penulis juga menjadi asisten praktikum mata kuliah Biologi Dasar pada semester

ganjil tahun ajaran 2002/2003 dan semester genap tahun ajaran 2002/2003, mata

kuliah Taksonomi Tumbuhan Berpembuluh pada semester ganjil tahun ajaran

2002/2003, serta mata kuliah Fisiologi Tumbuhan pada semester genap tahun

ajaran 2002/2003. Pada bulan Juni hingga Juli 2002, penulis melaksanakan

praktik lapangan di Balai Penelitian Bioteknologi dan Sumber Daya Genetik

Pertanian (BB-BIOGEN) Cimanggu, Bogor. Makalah penulis yang merupakan

bagian dari skripsi yang berjudul Growth and Development of Plant Studies in

Mango using Paclobutrazol and KNO3 Application menjadi Supporting Paper

pada Seminar Nasional X PERSADA di Jakarta pada bulan Juli 2003. Pada tahun

2004, penulis melanjutkan pendidikan strata-2 pada Program Studi Biologi, Sub

Program Studi Fisiologi, Genetika dan Biologi Molekuler Tanaman, Sekolah

Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Selama menjadi mahasiswa pascasarjana,

penulis juga aktif mengikuti simposium-simposium dan seminar-seminar yang

berkaitan dengan bioteknologi.

x

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR GAMBAR...............................................................................................

PENDAHULUAN

Latar Belakang.................................................................................................

Tujuan...........................................................................................................

KAJIAN PUSTAKA

Karakter Tibouchina......................................................................................

Pustaka Genom.............................................................................................

Bakteriofage Lambda.....................................................................................

Vektor Pengklonan Bakteriofage Lambda ...................................................

Pengemasan DNA Lambda...........................................................................

BAHAN DAN METODE

Waktu dan Tempat Penelitian...................................................................... 3

Bahan Penelitian........................................................................................... 3

Metode Penelitian............................................................................................

Isolasi DNA total tanaman..................................................................... 3

Pemotongan parsial DNA...................................................................... 4

Penyisipan nukleotida pada ujung fragmen DNA.................................. 4

Penyisipan fragmen DNA ke dalam vektor............................................ 4

Pengemasan fage rekombinan............................................................. 12

Transveksi fage ke dalam E. coli…………......................................... 12

Eksisi plasmid dari fage ......................................................................

Isolasi DNA plasmid rekombinan…...................................................... 12

Transformasi bakteri.............................................................................. 4

Pemotongan plasmid dengan enzim restriksi EcoRI.............................

HASIL DAN PEMBAHASAN

Pemotongan Parsial dan Penyisipan Nukleotida pada Ujung Fragmen

DNA............................................................................................................ 19

Konstruksi Fage Rekombinan...................................................................... 20

Ukuran DNA Sisipan................................................................................... 23

Ukuran Pustaka Genom............................................................................... 25

SIMPULAN DAN SARAN..............................................................................

DAFTAR PUSTAKA.........................................................................................

xi

1

2

3

6

7

9

11

12

12

13

14

15

15

15

16

16

16

17

17

18

27

28

xi

DAFTAR GAMBAR

Halaman

1 Morfologi tanaman T. langsdorffiana…….....................................................

2 Peta genetik bakteriofage .............................................................................

3 Penyusunan virus bakteriofage λ....................................................................

4 Vektor pengklonan fage BlueSTAR-1.........................................................

5 BlueSTAR-1 (Novagen) yang dipotong dengan XhoI dan mengalami

pengisian dengan dCTP dan dTTP pada situs pengklonan…………...........

6 Tahapan konstruksi pustaka genom..............................................................

7 Fragmen DNA T. langsdorffiana hasil pemotongan parsial dengan

Sau3AI...........................................................................................................

8 Seleksi biru-putih terhadap plak....................................................................

9 DNA T. langsdorffiana menggantikan daerah lacZ, lambda, EMC, lambda,

EMC dari vektor fage ..................................................................................

10 Plasmid rekombinan yang dipotong dengan EcoRI......................................

5

8

10

12

12

13

19

21

23

24

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Tibouchina langsdorffiana Baill termasuk ke dalam famili

Melastomataceae. Tumbuhan ini berbunga ungu cerah dan merupakan tumbuhan

hutan hujan di Mexico, Hindia barat dan Amerika Selatan (Faravani & Bakar

2007).

T. langsdorffiana toleran terhadap pH rendah dan aluminium (Al) tinggi.

Tumbuhan ini dapat tumbuh dengan baik pada pH 3. Tumbuhan ini juga toleran

terhadap Al hingga konsentrasi 0.8 mM baik pada pH 4 maupun pada pH 3. Pada

1.6 mM Al atau lebih dalam lingkungan pH 4, pertumbuhan panjang akar T.

langsdorffiana terhambat walaupun batang dan tunas tidak terhambat

pertumbuhannya (Muhaemin 2008). Tumbuhan ini memiliki toleransi terhadap

pH rendah dan Al tinggi sehingga tumbuhan ini dapat digunakan sebagai sumber

gen toleransi tumbuhan terhadap pH rendah dan Al tinggi. Selain sebagai sumber

gen, tumbuhan ini juga dapat digunakan sebagai model toleransi terhadap pH

rendah dan Al tinggi. Gen yang diduga bertanggungjawab terhadap toleransi

terhadap pH rendah dan Al tinggi dapat diuji di tumbuhan ini dengan metode gene

silencing.

Analisis akumulasi Al menunjukkan bahwa tumbuhan ini mampu

mengakumulasi 4.5 mg Al tiap gram bobot kering daun dan akar setelah mendapat

perlakuan 3.2 mM Al selama dua bulan (Mutiasari 2008). Kemampuannya dalam

mengakumulasi Al memungkinkan tumbuhan ini dapat digunakan sebagai

fitoremediasi terutama pada lahan yang mempunyai kandungan Al tinggi.

Untuk memanfaatkan gen-gen yang mengendalikan toleransi T.

langsdorffiana terhadap pH rendah dan Al tinggi dan kemampuannya dalam

mengakumulasi Al, maka bahan genetik tumbuhan ini harus disimpan di dalam

pustaka genom. Pustaka genom adalah sekumpulan klon yang mengandung DNA

genom total dari suatu organisme. Pustaka genom seharusnya mengandung

seluruh sekuen DNA dari suatu organisme (Lodish et al. 2000). Pustaka genom

sangat penting untuk menyimpan seluruh informasi genetik yang dimiliki oleh

suatu spesies. Selain sebagai penyimpan bahan genetik, pustaka genom juga

2

sangat bermanfaat untuk mengisolasi gen utuh yang mengandung promoter,

terminator dan intron untuk mengetahui regulasi ekspresi gen. Peta fisik suatu

genom juga membutuhkan pustaka genom, sehingga pustaka genom merupakan

bagian yang sangat penting dalam perbaikan genetika tanaman, baik melalui

teknologi DNA rekombinan maupun melalui pemuliaan konvensional (Suharsono

2002).

Pustaka genom manusia dan beberapa hewan mamalia, ikan, dan

tumbuhan sudah dikonstruksi. Beberapa pustaka genom telah dikonstruksi, seperti

pustaka genom kedelai kultivar Slamet yang toleran Al (Suharsono 2002) dan

kultivar Lumut yang peka terhadap Al (Suharsono 2007) dalam rangka

menyimpan seluruh informasi genetik yang dimiliki oleh kedelai lokal Indonesia.

Dari pustaka genom kedelai kultivar Lumut, penapisan dengan pelacak gen

penyandi peroksidase dari Arabidopsis telah dilakukan untuk mendapatkan gen

utuh penyandi peroksidase dari kedelai (Suharsono et al. 2003). Miftahudin et al.

(1998) telah mengkonstruksi pustaka cDNA dari kedelai (MLG3474) melalui

mRNA yang diisolasi dari tanaman yang mendapat cekaman kekeringan. Elvawati

(1999) telah mengkonstruksi pustaka cDNA tanaman kedelai yang diinduksi

cekaman Al. Kurnia (2005) juga telah berhasil mengisolasi gen penyandi

glutathione S-transferase dari pustaka genom kedelai kultivar Slamet. Dari

pustaka genom varietas tanaman yang sama, fragmen DNA yang mengandung

gen penyandi peroksidase juga telah berhasil diisolasi oleh Rachman (2005).

Kurniawan (2005), telah berhasil mengisolasi fragmen DNA yang mengandung

gen penyandi glutathione S-transferase dari pustaka genom kedelai kultivar

Lumut. Dari pustaka genom varietas tanaman yang sama, fragmen DNA yang

mengandung gen penyandi peroksidase juga telah berhasil diisolasi oleh

Rahmawati (2005).

Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk melakukan konstruksi pustaka genom T.

langsdorffiana.

KAJIAN PUSTAKA

Karakter Tibouchina

Genus Tibouchina (sinonim dengan Chaetogastra, Hephestionia, Itatiaia,

Lasiandra, Micranthella, Oreocosmus, Pleroma, Purpurella) terdiri dari 300

spesies (Faravani & Bakar 2007). Tibouchina biasa dikenal dengan nama

“princess flower”, “glory bushes” atau kadang-kadang “glory trees” (Judd et al.

2005; Faravani & Bakar 2007). Tanaman ini merupakan tanaman asli di hutan

hujan Mexico, Hindia barat dan Amerika Selatan, terutama Brazil. Namanya

berasal dari adaptasi tempat asalnya yaitu “Guiana” (Faravani & Bakar 2007).

Tibouchina merupakan anggota famili Melastomaceae (di dalam literatur

biasa ditulis Melastomataceae), merupakan tanaman dikotil berbunga, berbiji

tertutup (angiospermae). Famili melastomataceae terdiri dari 3000 spesies di

neotropika, 1000 di Asia tropis, 240 di Afrika, 225 di Madagaskar (150-166

genus), dan 70 di Thailand (15 genus) (Renner et al. 2001). Melastomataceae

kemudian menyebar di India, Australia, Sri Lanka, Asia Tenggara termasuk

Filipina dan Taiwan, sampai Papua New Guinea, Pulau Pasifik, Mauritius,

Jamaica, dan Amerika Serikat (Renner 1993).

T. langsdorffiana digunakan sebagai tanaman hias karena nilai estetikanya

yaitu warna bunga ungu cerah yang sangat menarik. Sebagian besar

Melastomataceae dan Memecylaceae memiliki warna bunga ungu, bervariasi dari

merah muda sampai magenta. Sebagai contoh, warna bunga ungu umumnya

ditemui pada Dichaetanthera, Meriania, Mouriri, Rhynchanthera dan Tibouchina,

dimana kebanyakan merupakan akumulator Al (Jansen et al. 2002).

Tanaman ini tumbuh dengan baik pada tanah yang bersifat asam. Jika

tanah tidak cukup asam, ujung daun akan seperti terbakar, kemudian menjadi

coklat atau bahkan daun akan mati. Jika hal itu terjadi, keasaman tanah dibuat

dengan menambahkan sulfur ke tanah di sekitar akar, atau menggunakan pupuk

yang bersifat asam. Tanaman ini tidak perlu dipangkas, karena dapat tumbuh

menjadi pohon besar (http://www.abc.net.au/gardening/stories/s2040246.htm).

Tibouchina yang berupa semak cantik yang banyak tumbuh di daerah

tropis Amerika latin mirip sekali dengan Dissotis canescens yang masih sekerabat

4

yaitu memiliki ciri-ciri semak berkayu lembut, mencapai tinggi 1.5 m dengan

lebar tajuk 1 m, bunganya yang besar dan berwarna magenta muncul di bulan

Desember sampai April, bunganya unik karena memiliki dua set benang sari yang

berbeda satu dengan yang lain, lima di antaranya panjang berwarna ungu dengan

ujung melengkung sementara lima lainnya lebih pendek dan berwarna kuning

(http://www.plantzafrica.com/plantcd/dissotiscanes.htm).

Perbanyakan T. langsdorffiana ini melalui stek secara vegetatif karena

tanaman ini tidak menghasilkan biji. Berbunga melimpah antara bulan Mei

sampai Januari. Spesies T. langsdorffiana biasanya memiliki daun yang berbulu

halus dengan tulang daun yang menonjol dan memperlihatkan warna bunga ungu

menarik sehingga ditanam sebagai hiasan. Nama lokal tanaman ini di kalangan

penjual tanaman hias, dikenal dengan nama violet, tibocina/tebocina (Sunda).

Kedudukan T. langsdorffiana dalam taksonomi adalah sebagai berikut:

Domain : Eukariota

Kingdom : Plantae

Subkingdom : Viridaeplantae

Filum : Magnoliophyta

Kelas : Magnoliopsida

Subkelas : Rosidae

Ordo : Myrtales

Famili : Melastomataceae

Genus : Tibouchina

Spesies : Tibouchina langsdorffiana Baill

T. langsdorffiana merupakan tanaman perennial, termasuk herba, semak,

atau pohon, tegak, dengan tinggi 0.5 m sampai 25 m (Gambar 1a), daun tunggal

(Gambar 1b), bertangkai, duduk daun berhadapan, pertulangan daun menyirip,

ujung runcing, pangkal tumpul, tepi rata, bentuk lanset, permukaan bersisik.

Bunga T. langsdorffiana merupakan bunga terbatas tipe malai rata (corymbiform

cyme) dengan jumlah bunga 5-25 kuntum bunga (Gambar 1c), kelopak (sepal)

berjumlah 5 saling bebas, mahkota (petal) berjumlah 5 saling bebas (Gambar 1d),

simetri bunga beraturan (actinomorph), benang sari berjumlah 10 saling bebas

5

(polyandrous) dengan panjang sama, tipe perlekatan tangkai sari dengan kepala

sari yaitu versatile, tipe putik syncarp karena memiliki 5 buah karpel yang

dipisahkan oleh sekat (septum), tipe kepala putik clavate, sedangkan tipe tangkai

putik geneculate (Gambar 1e). Tipe plasentasi bakal buah axial (Gambar 1f), dan

merupakan bakal buah tenggelam (inferior), tetapi dalam perkembangannya,

bakal buah beserta biji di dalamnya akan gugur sehingga tanaman ini tidak

menghasilkan buah dan biji.

Gambar 1 Morfologi tanaman T. langsdorffiana: a. tanaman berupa semak

berkayu; b. daun tunggal; c. tipe malai cabang bunga; d. tipe kelopak

dan mahkota bunga; e. tipe benang sari dan putik bunga; f. plasentasi

bakal buah.

d 2 cm e 1 mm f 1 mm

a 20 cm b 2 cm c 2 cm

6

Pustaka Genom

Suatu pustaka gen dapat diartikan sebagai sekumpulan sekuen (urutan)

DNA dari suatu organisme yang masing-masing telah di klon ke dalam vektor

tertentu untuk memudahkan pemurnian, penyimpanan dan analisisnya. Pada

dasarnya terdapat dua macam pustaka gen yang dapat dikonstruksi, tergantung

sumber DNA yang digunakan. Jika DNA yang digunakan adalah DNA

genomik/kromosom, maka perpustakaan yang dihasilkan disebut pustaka genom.

Sementara itu, jika DNA yang digunakan merupakan hasil transkripsi balik suatu

populasi mRNA, maka pustaka yang diperoleh dinamakan pustaka

complementary DNA (cDNA).

Hasil pengklonan seluruh DNA total dari spesies tertentu disebut dengan

pustaka genom. Pustaka genom sangat bermanfaat dalam usaha isolasi dan

karakterisasi suatu gen (Cross et al. 1999; Suharsono et al. 2003), dan juga untuk

pemetaan gen secara fisik.

Pustaka genom dapat dibuat melalui sintesis cDNA dari mRNA atau DNA

genom. Vektor yang diperlukan dalam pembuatan pustaka genom dapat berupa

bakteriofage, P1 artificial chromosome (PAC), yeast artificial chromosome

(YAC), bacterial artificial chromosome (BAC), atau kosmid, bergantung pada

ukuran panjang fragmen DNA (Wahyudi 2001). Pada penelitian ini dipakai vektor

pengklonan yaitu fage lambda ( BlueSTAR-1 (Novagen 1997). Fage

BlueSTAR-1 adalah vektor yang didesain untuk membuat pustaka genom DNA

dengan efisiensi kloning fragmen DNA berukuran 7-20 kb. Vektor mengandung

gen untuk seleksi biru/putih yang unik dan cre-loxP yang digunakan untuk

autosubkloning (Novagen 1997).

Konstruksi pustaka genom diawali dengan isolasi DNA total. DNA total

biasanya dipotong secara parsial menggunakan enzim restriksi Sau3AI atau enzim

lain disesuaikan dengan situs yang terdapat pada vektor yang akan digunakan

dalam konstruksi pustaka agar mendapatkan fragmen DNA yang berukuran besar.

Pemotongan parsial ini menghasilkan fragmen berukuran besar karena tidak

semua situs pengenalan suatu enzim restriksi dalam rantai DNA genom terpotong

oleh enzim restriksi yang bersangkutan. Fragmen DNA berukuran besar ini

kemudian disisipkan ke dalam vektor yang telah dipotong dengan enzim restriksi

7

tertentu sehingga hasil potongannya cocok dengan fragmen DNA. Untuk

menghindari adanya penyatuan kembali (religasi) ujung-ujung potongan biasanya

dimodifikasi dengan penambahan nukleotida tertentu (fill-in).

Dalam mengkonstruksi pustaka genom DNA, DNA umumnya dipotong

dengan enzim restriksi yang mengenali situs yang terdiri dari 4 pasang basa (pb)

(contohnya Sau3AI). Pengenalan dan pemotongan sekuen 4 pb yang spesifik ini

akan terjadi rata-rata sekali setiap 44 = 256 pb. Untuk meningkatkan kemungkinan

semua daerah genom berhasil diklonkan dan terkandung dalam pustaka genom,

DNA genom biasanya dipotong secara parsial untuk menghasilkan fragmen

restriksi yang saling tumpang tindih (overlapping) yang berukuran besar, sekitar

20 kb. Vektor fage dapat menampung sekitar 20 kb.

Bakteriofage Lambda

Bakteriofage (atau fage) adalah virus yang menginfeksi bakteri. Satuan

dasar virus disebut virion. Virion fage memiliki kepala, yang mengandung

genom DNA virus, dan sebuah ekor, yang berfungsi menginfeksi sel inang

Escherichia coli (E. coli). Virus hanya dapat memperbanyak diri jika berada di

dalam suatu sel inang yang sesuai. Jika berada di luar suatu sistem selular, virus

tidak mampu memperbanyak diri karena tidak mempunyai sistem enzim yang

dapat digunakan untuk mensintesis partikel virus baru. Diameter virus bervariasi

dari 20-300 nm sehingga ukurannya lebih kecil dari sel prokariot yang paling

kecil (Yuwono 2008). Bahan genetik virus ada yang berupa molekul DNA dan

ada yang berupa RNA. Molekul DNA dan RNA tersebut ada yang berupa

molekul untai tunggal dan ada yang berupa molekul untai ganda. Ekspresi genetik

virus dilakukan dengan menggunakan sistem enzim yang ada di dalam sel inang.

Salah satu jenis bakteriofage yang biasa digunakan sebagai vektor

pengklonan adalah bakteriofage . Bakteriofage merupakan virus bakterial yang

telah banyak diteliti, dan telah diketahui secara luas mengenai genetika dan

biologi molekulernya. Urutan lengkap basa nukleotida bakteriofage ini sudah

diketahui. Genom bakteriofage berupa DNA untai ganda linier yang terdiri atas

48502 pb (Chauthaiwale et al. 1992). Molekul DNA bakteriofage ini mempunyai

8

struktur yang unik karena pada kedua ujungnya terdapat 12 basa tambahan berupa

molekul DNA untai tunggal. Kedua ujung molekul DNA tersebut dapat

membentuk ikatan komplementer jika terjadi pelingkaran DNA, sehingga ujung-

ujung DNA tersebut disebut sebagai ujung kohesif (cohesive ends, disingkat COS)

(Chauthaiwale et al. 1992).

Fage mempunyai gen-gen penyandi protein yang diperlukan dalam

penyusunan kepala dan ekor dan gen-gen yang menyandikan protein yang

diperlukan dalam siklus litik yang terdapat di bagian kedua ujung genomnya

(Gambar 2). Beberapa daerah di bagian tengah dari genom dapat digantikan oleh

DNA eksogen atau dihilangkan tanpa mempengaruhi kemampuan fage λ dalam

menginfeksi sel inang dan menyusun virus baru. DNA eksogen yang menyisip

diantara gen J dan N bisa berukuran lebih dari 25 kb. Terdapat sekitar 60 gen

yang ada di dalam genom λ (Lodish et al. 2000).

Gambar 2 Peta genetik bakteriofage (Lodish et al. 2000).

Bakteriofage menginfeksi E. coli dengan cara menempel pada suatu

reseptor spesifik yang terdapat pada permukaan sel E. coli, kemudian

menginjeksikan DNAnya (Dale 1994). DNA linier utas ganda diubah menjadi

bentuk sirkuler segera setelah terjadi infeksi. Setelah memasuki sel bakteri, ujung

kohesif mengalami perpasangan basa membentuk molekul DNA sirkuler, dimana

masih terdapat 2 buah nick pada tempat perpasangan basa tersebut. Kedua nick ini

ditutup oleh DNA ligase inang sehingga dihasilkan molekul DNA sirkuler

seutuhnya. DNA sirkuler ini berfungsi sebagai cetakan dalam proses transkripsi

selama fase infeksi awal (Sambrook et al. 1989).

Ketika DNA memasuki sitoplasma sel inang setelah menginfeksi,

selanjutnya DNA fage akan mengalami pertumbuhan siklus litik atau lisogenik.

Siklus litik menyebabkan lisisnya sel inang dan menghasilkan partikel fage baru,

sedangkan siklus lisogenik terjadi karena genom bakteriofage terintegrasi dengan

9

genom sel inang sebagai profage. Dalam kondisi cekaman nutrisi dan lingkungan,

DNA yang terintegrasi dapat dikeluarkan dari kromosom inang dan selanjutnya

memasuki siklus litik (Glick & Pasternak 1994). Ketika bakteriofage digunakan

sebagai vektor pengklonan, dia mampu mengalami pertumbuhan litik, tetapi

fungsi virus lainnya menjadi tidak relevan. Sebagai akibatnya, gen-gen yang

terlibat dalam jalur lisogenik dan gen-gen virus lainnya yang tidak penting bagi

jalur litik akan dihilangkan dari DNA virus dan digantikan dengan DNA yang

akan diklonkan. Bakteriofage ini memiliki efisiensi pengemasan sebesar 78-

108% dari ukuran DNA lambda tipe liar (Chauthaiwale et al. 1992). DNA asing

yang berukuran di atas 25 kb dapat disisipkan ke dalam genom , menghasilkan

DNA rekombinan yang dapat dikemas secara in vitro untuk membentuk virus-

virus yang mampu bereplikasi dan membentuk plak di dalam sel inang E. coli

(Lodish et al. 2000).

Vektor Pengklonan Bakteriofage Lambda

Bakteriofage merupakan salah satu vektor untuk konstruksi pustaka

genom. Replikasi DNA di dalam sel inang menghasilkan molekul DNA

multimerik, yang disebut concatomers, yang terdiri dari kopi-kopi ganda genom

virus yang bersambungan dari ujung hingga ujung yang dibatasi oleh sekuen

nukleotida spesifik yang disebut situs COS. Dua protein , yaitu Nu 1 dan A,

terikat dengan situs COS dan menyisip secara langsung ke DNA di antara dua

situs COS yang berdekatan kemudian masuk ke dalam kepala yang akan disusun

(Lodish et al. 2000).

Setiap kepala fage mengemas genom tunggal sebesar 50 kb dari

concatomers multimerik. DNA kromosom sel inang tidak menyisip ke dalam

kepala karena tidak mengandung kopi dari sekuen COS. Kepala dan ekor yang

kosong disusun dari kopi-kopi ganda dari beberapa protein λ yang berbeda.

Selama fase akhir, membentuk molekul DNA yang panjang yang disebut

concatomers. Molekul multimerik ini terdiri dari kopi-kopi genom yang

bersambungan dari ujung ke ujung dan dipisahkan oleh situs COS yang

merupakan sebuah sekuen nukleotida yang dapat mengikat protein. Setiap kopi

10

dari genom λ mengandung COS. Protein λ Nu1 dan A yang menempel pada situs

COS memicu penyisipan DNA diantara dua situs COS yang berdekatan ke dalam

kepala yang kosong. Setelah kepala-kepala terisi DNA, ekor yang siap disusun

akan menempel, menghasilkan virus λ lengkap yang mampu menginfeksi sel-sel

E. coli (Gambar 3).

Gambar 3 Penyusunan virus bakteriofage λ (Lodish et al. 2000).

Berbagai vektor pengklonan turunan dari fage telah dikonstruksi untuk

berbagai tujuan berdasarkan ukuran fragmen DNA sisipan dan situs penyisipan

(Singer & Berg 1991).

Fage BlueSTAR-1 merupakan vektor yang didesain untuk membuat

pustaka genom DNA dengan ukuran sisipan sebesar 7-20 kb. Vektor ini

mengandung gen untuk seleksi biru/putih yang unik dan cre-loxP yang digunakan

untuk autosubkloning (Novagen 1997). Seleksi biru-putih diperoleh karena

adanya gen lacZ E. coli lengkap dan daerah kontrol yang terdapat dalam lengan

11

fragmen yang berukuran 13 kb. Lengan vektor akan bereligasi dengan lengan

DNA genom, menghasilkan fage yang dapat menghasilkan β-galaktosidase aktif

di dalam sel-sel yang terinfeksi. Virus rekombinan yang diinfeksikan ke bakteri

ini, yang kemudian ditumbuhkan di cawan petri akan menghasilkan plak-plak

rekombinan dalam jumlah besar. Setiap plak yang muncul dari virus rekombinan

tunggal akan menghasilkan turunan fage yang jika ditumbuhkan akan identik

secara genetik dimana klon yang dibentuk telah membawa insert DNA genomik

khusus. Plak yang berbeda berhubungan dengan klon fage yang dibentuk, setiap

plak membawa DNA insert yang berbeda, dan secara kolektif mereka menyusun

pustaka genom .

Pengemasan DNA Lambda

Untuk menyiapkan virus yang infektif yang membawa DNA

rekombinan, perakitan fage dilakukan secara in vitro dengan melakukan

pengemasan molekul DNA fage . Salah satu metode untuk memproduksi protein

pengemas fage adalah dengan menumbuhkan dua macam fage mutan secara

terpisah. Kedua macam mutan ini hasil dari mutasi pada gen yang berbeda. Mutan

yang satu tidak dapat mensintesis protein kepala A, dan mutan yang lain tidak

mampu mensintesis protein kepala Nu 1. Dengan mencampur kedua ekstrak ini,

fragmen DNA akan dikemas dalam kepala dan ekor fage akan ditempelkan pada

kepala yang sudah mengandung DNA.

Pengemasan dengan ekstrak protein ini menghasilkan virus-virus

rekombinan dalam jumlah besar yang sangat infektif dan secara efisien dapat

menginfeksi sel-sel E. coli. Setiap partikel virus berikatan dengan reseptor pada

permukaan sel inang dan menginjeksikan DNA rekombinan yang telah dikemas

ke dalam sel (Lodish et al. 2000).

BAHAN DAN METODE

Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilaksanakan dari bulan Maret 2006 sampai dengan Desember

2008 di Laboratorium Kerjasama Bioteknologi Indonesia-Belanda (BIORIN) dan

Laboratorium Biologi Molekuler dan Seluler Tanaman (BMST), Pusat Penelitian

Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB) IPB.

Bahan Penelitian

Daun muda T. langsdorffiana digunakan sebagai bahan tanaman. Fage

BlueSTAR-1 (Novagen) digunakan sebagai vektor pengklonan (Gambar 4).

Gambar 4 Vektor pengklonan fage BlueSTAR-1.

Fage ini telah dipotong dengan XhoI dan telah mengalami penyisipan (fill-in)

dengan nukleotida dCTP dan dTTP sehingga menghasilkan potongan vektor

dengan ujung menggantung (overhang) TC pada situs penyisipan (Gambar 5).

Gambar 5 BlueSTAR-1 (Novagen) yang dipotong dengan XhoI dan mengalami

pengisian dengan dCTP dan dTTP pada situs pengklonan.

Kedua lengan dan pengisi tidak cocok

Pengisi lac

Sa

l I

Sfi

I

loxP

No

t I

Ea

g I

Sa

c II

Ba

mH

I

Sm

a I

Eco

R I

Xh

o I

Sa

l I

Hin

d I

II

Xb

a I

Avr

I

Sa

c I

Sa

c I

Avr

II

Xb

a I

Hin

d I

II

Sa

l I

Xh

o I

Eco

R I

Sm

a I

Ba

mH

I

Sa

c II

Ea

g I

No

t I

Ap

Ori

loxP

Sfi

I

Sa

l I

BlueSTAR-1

Pemotongan dengan Xho I

Penambahan dCTP dan dTTP

13

E. coli galur ER1647 digunakan sebagai inang untuk mengamplifikasi fage

rekombinan. E. coli galur BM25.8 digunakan sebagai inang untuk memproses

eksisi dari fage rekombinan menjadi plasmid rekombinan. E. coli galur DH5

digunakan sebagai inang untuk mendukung replikasi plasmid.

Metode Penelitian

Konstruksi pustaka genom dilakukan melalui beberapa tahapan yaitu:

isolasi DNA total tanaman, pemotongan parsial DNA tanaman, penyisipan DNA

T. langsdorffiana ke dalam fage , pengemasan DNA rekombinan, transveksi

fage rekombinan ke E. coli dan analisis pustaka genom. Analisis pustaka genom

meliputi eksisi dari fage menjadi plasmid, isolasi DNA plasmid, transformasi

genetik dan pemotongan DNA plasmid dengan enzim restriksi. Tahapan

penelitian ini disajikan pada Gambar 6.

Gambar 6 Tahapan konstruksi pustaka genom.

Isolasi DNA total

T. langsdorffiana

Pemotongan

parsial DNA Fragmen DNA

T. langsdorffiana Vektor fage

terpotong

Penyisipan DNA T. langsdorffiana ke

dalam fage

DNA fage rekombinan

Pengemasan fage rekombinan

Transveksi fage rekombinan ke

E. coli

Analisis pustaka genom:

Transformasi bakteri

Isolasi DNA plasmid

rekombinan

14

Isolasi DNA total tanaman

Isolasi DNA total tanaman dilakukan dengan mengikuti prosedur Chang et

al. (1993) yang dimodifikasi yaitu dengan penggantian LiCl dengan

isopropranol/etanol absolut. Sampel diambil dari daun segar yang masih muda.

Daun muda tersebut dibuang bagian tulang daunnya, dipotong-potong, dan

ditimbang sebanyak 2 g. Selanjutnya potongan daun tersebut ditambah nitrogen

cair secukupnya, dan digerus dengan mortar hingga halus. Bubuk ini kemudian

dilarutkan dalam 6 ml 2x larutan penyangga cetyltrimethyl-ammonium bromide

(CTAB) (2% CTAB, 0.1 M Tris-HCl pH 9.5, 20 mM EDTA, 1.4 M NaCl, 2%

PVP) lalu ditambahkan 0.2% merkaptoetanol. Larutan dibolak-balik sampai rata,

kemudian diinkubasikan dalam pemanas bergoyang pada suhu 65oC selama 60

menit. Ke dalam larutan tersebut ditambahkan 6 ml larutan

kloroform:isoamilalkohol (CI) (24:1), dibolak-balik selama 1.5 menit, kemudian

disentrifugasi pada kecepatan 4000 rpm dengan swing-out rotor (Jouan, BR4i)

pada suhu 4°C selama 10 menit. Setelah terpisah, cairan di bagian atas

dipindahkan ke tabung baru dan ditambah isopropanol sebanyak 0.7x volume

awal, kemudian campuran ini diinkubasi pada suhu -20 C selama 2 jam.

Campuran disentrifugasi pada 4000 rpm, 4 C, selama 20 menit. Setelah

sentrifugasi, endapan kemudian dibilas dengan alkohol 70% lalu disentrifugasi

kembali pada kecepatan 3000 rpm, 4 C, 10 menit. Endapan yang diperoleh lalu

dikeringkan dengan vakum dan disuspensikan dalam TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM

EDTA, pH 8.0). Suspensi DNA kemudian ditambah RNAse dengan konsentrasi

akhir 100 g/ml dan diinkubasikan pada suhu 37oC selama minimal dua jam

untuk menghilangkan RNA. Suspensi DNA dicampur secara merata dengan 1x

volume fenol:kloroform:isoamilalkohol (PCI) (25:24:1), dan disentrifugasi pada

kecepatan 12000 rpm dengan fix-angle rotor (Jouan, BR4i) pada suhu ruang

selama 10 menit. Cairan bagian atas diendapkan dengan menambahkan 0.1x

volume 3 M Na-asetat pH 5.2 dan 2x volume etanol absolut dingin, dibolak-balik

pelan lalu diinkubasi pada suhu -20 C selama 2 jam. Setelah inkubasi lalu

disentrifugasi kembali pada kecepatan 14000 rpm, suhu 4oC selama 10 menit.

Endapan DNA dibilas dengan etanol 70% dingin dan disentrifugasi kembali pada

15

kecepatan 14000 rpm, 4 C, 30 menit. Endapan DNA tersebut dikeringkan,

kemudian disuspensikan di dalam TE pH 8.

Pemotongan parsial DNA

DNA total tanaman dipotong dengan enzim Sau3AI (Takara) pada suhu

37ºC selama 30 menit dengan berbagai konsentrasi yaitu: 0.01, 0.015, 0.02 dan

0.04 unit tiap µg DNA.

Penyisipan nukleotida pada ujung fragmen DNA

Setelah dipotong secara parsial kedua ujung fragmen DNA disisipi

terlebih dahulu dengan dua nukleotida untuk mencegah terjadinya penyambungan

kembali di antara fragmen-fragmen tersebut sesuai dengan prosedur Novagen

(1997). Sebanyak 20 g fragmen DNA dicampur dengan larutan penyangga yang

mengandung 50 mM Tris-HCl pH 7.3, 10 mM MgCl2, 50 g/ml bovin serum

albumin (BSA), 1 mM deoksiadenosina trifosfat (dATP), 1 mM deoksiguanosina

trifosfat (dGTP) (Novagen), 4 µl 100 mM ditiotreitol (DTT), dan 20 unit Klenow

DNA polimerase (Takara) dalam volume total 400 l. Campuran tersebut

diinkubasikan pada suhu 30oC selama 30 menit. Campuran dipanaskan pada 70

oC

selama 10 menit untuk menghentikan reaksi tersebut. Fragmen DNA yang

berukuran 7-20 kb diisolasi dengan menggunakan kolom Chroma Spin 1000

(Clontech 1999).

Penyisipan fragmen DNA ke dalam vektor

Fragmen DNA hasil isolasi disisipkan ke dalam vektor fage dengan cara

mencampur 0.5 g fragmen DNA yang ujungnya telah disisipi (fill-in) nukleotida

dengan 0.5 g BlueSTAR-1 (Novagen), 4.5 unit T4 DNA ligase (Takara), dan

bufer ligasi (30 mM Tris-HCl pH 7.8, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP,

5% polietilen glikol (PEG) 8000), dalam volume total 10 l. Campuran

diinkubasi pada suhu 4oC selama 24 jam.

16

Pengemasan fage rekombinan

Setelah ligasi, DNA fage rekombinan yang dihasilkan selanjutnya

dikemas dalam protein mantel. Sebanyak 10 l hasil reaksi ligasi dicampur

dengan 50 l protein ekstrak pengemas (Gigapack III, Stratagene) sesuai prosedur

Stratagene (2003). Campuran diinkubasikan pada suhu 22oC selama dua jam.

Reaksi dihentikan dengan menambahkan 440 l bufer SM (5.8 g/l NaCl, 2 g/l

MgSO4 7H2O, 0.01% gelatin, dan 50 mM Tris-HCl, pH 7.5). Jumlah titer

ditentukan dengan melakukan transveksi ke E. coli galur ER1647.

Transveksi fage ke dalam E. coli

Transveksi fage ke dalam E. coli dilakukan mengikuti prosedur

Suharsono (2002). Fage hasil pengemasan diencerkan 100 kali dan 1000 kali

agar memudahkan penghitungan. Sebanyak 100 l E. coli galur ER1647

(OD600=1) dicampur dengan 100 l fage . Campuran diinkubasi dalam balok

pemanas (heat block) pada suhu 37oC selama 30 menit, kemudian ditambah 4 ml

molten top agarose (10 g/l bacto-tryptone, 5 g/l NaCl, 6 g/l agarosa) bersuhu

47oC dan telah ditambah X-gal dengan konsentrasi akhir 500 ppm untuk

mengidentifikasi rekombinan. Campuran tersebut disebar dalam cawan petri

yang mengandung 15 ml media luria bertani (LB) padat (10 g/l bacto-tryptone, 5

g/l ekstrak khamir, 10 g/l NaCl, 15 g/l bacto-agar) sesuai prosedur Novagen

(1997). Setelah agarosa yang berada di atas media LB padat tersebut membeku,

cawan ditutup, kemudian diinkubasikan pada suhu 37oC selama satu malam.

Eksisi plasmid dari fage

Transveksi fage juga dilakukan ke dalam E. coli galur BM25.8

(OD600=1) untuk melakukan eksisi dari bentuk fage rekombinan menjadi plasmid

rekombinan. Eksisi dilakukan dengan mencampurkan 100 l E. coli galur

BM25.8 (OD600=1) dengan 100 l fage . Campuran diinkubasikan di dalam

balok pemanas pada suhu 37oC selama 30 menit. Sebanyak 100 l campuran

disebar di atas media LB padat yang mengandung ampisilin 100 ppm dengan

menggunakan batang kaca bengkok.

17

Isolasi DNA plasmid rekombinan

Isolasi DNA plasmid dilakukan dengan menumbuhkan satu koloni bakteri

E. coli galur BM25.8 dan DH5 di dalam 2 ml media LB cair yang mengandung

100 mg/l ampisilin yang diletakkan dalam inkubator bergoyang dengan kecepatan

250 rpm, pada suhu 37oC selama semalam. Bakteri diendapkan dengan

sentrifugasi pada kecepatan 14000 rpm (Jouan, BR4i), pada suhu 4oC selama 10

menit. Endapan bakteri selanjutnya disuspensikan dalam 300 l larutan

penyangga suspensi sel (10 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 7.5), kemudian

ditambah 300 l larutan penyangga lisis (0.2 M NaOH, 1% SDS). Setelah bakteri

tersebut mengalami lisis, ditambah 300 l larutan penyangga netralisasi (1.32 M

Na-asetat pH 4.8). Campuran tersebut disentrifugasi pada kecepatan 14000 rpm

pada suhu 4oC selama 20 menit. Cairan yang mengandung DNA plasmid

diekstraksi dengan larutan PCI, kemudian divorteks dan disentrifugasi pada

kecepatan 14000 rpm pada suhu 4ºC selama 20 menit. Supernatan diambil dan

diperlakukan dengan RNAse (100 µg/ml) pada suhu 37oC selama semalam.

Protein RNAse dipisahkan dari DNA plasmid dengan menambahkan larutan PCI.

Cairan kemudian dipresipitasikan dengan penambahan 0.1x volume 3 M Na-

asetat pH 5.2 dan 2x volume etanol absolut, diinkubasikan pada suhu -20oC

selama dua jam. DNA plasmid selanjutnya diendapkan dengan sentrifugasi pada

kecepatan 14000 rpm pada suhu 4oC selama 20 menit. Endapan DNA plasmid

dibilas dengan etanol 70% dan dikeringkan dengan vakum. DNA plasmid tersebut

disuspensikan di dalam H2O.

Transformasi bakteri

Bakteri kompeten dibuat dengan mengikuti prosedur Nakayama dan

Nishikata (1995) dalam Suharsono (2002). Satu koloni bakteri E. coli galur

DH5 dikulturkan dalam 2 ml media LB cair pada inkubator bergoyang dengan

kecepatan 250 rpm, pada suhu 37oC selama semalam. Kemudian bakteri tersebut

disubkultur dalam 100 ml media LB cair dengan kondisi yang sama hingga

OD600=0.6. Bakteri diendapkan dengan disentrifugasikan pada kecepatan 4000

rpm pada suhu 4oC selama 10 menit. Endapan bakteri disuspensikan dalam 3.3

ml larutan penyangga transformasi (TFB) (10 mM MES pH 6.3, 45 mM

18

MnCl2.4H2O, 10 mM CaCl2.2H2O, 3 mM [Co(NH3)6]Cl3, 100 mM KCl, gliserol

10%, pH 7.5) dan diinkubasikan di dalam es selama 10 menit. Kemudian

suspensi tersebut disentrifugasi pada kecepatan 4000 rpm. Endapan bakteri

disuspensikan dalam 0.83 ml TFB dan ditambah 58.1 µl DMSO 99.9%, lalu

diinkubasikan di dalam es selama 10 menit sehingga didapat bakteri kompeten.

Sebanyak 50 l bakteri kompeten dicampur dengan 10 l (50-100 ng) DNA

plasmid dan diinkubasikan di dalam es selama 25 menit. Campuran ini kemudian

diinkubasi pada suhu 42oC selama 45 detik, dimasukkan kembali ke dalam es

selama 5 menit. Campuran ini ditambah 100 l media 2x YT (16 g/l tripton, 10

g/l ekstrak khamir, 5 g/l NaCl, pH 7.0) dan diinkubasikan pada inkubator

bergoyang 250 rpm, 37oC selama 20 menit. Selanjutnya bakteri disebar pada

media LB padat yang mengandung ampisilin 100 ppm dan diinkubasikan pada

suhu 37oC selama semalam.

Pemotongan plasmid dengan enzim restriksi EcoRI

Plasmid hasil isolasi dipotong menggunakan enzim restriksi EcoRI pada

suhu 37ºC selama semalam. Komponen restriksi dengan EcoRI adalah 0.5 µl

(5 unit) enzim EcoRI (Fermentas), 1.0 µl (50 ng) DNA, 2.0 µl (10x) bufer

EcoRI (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.02% Triton

X-100, 0.1 mg/ml BSA), 16.5 µl ddH2O sehingga total volume menjadi 20 µl.

Plasmid yang sudah dipotong dengan enzim restriksi dimigrasikan pada

gel agarosa 1% dalam 1x TAE (40 mM Tris-asetat, 1 mM EDTA pH 8.0)

bersama dengan penanda 1 kb ladder (Promega).

1500

2000 2000

3000

2000

3000

5000 5000 5000

4000

3000

5000

4000

3000

2000

HASIL DAN PEMBAHASAN

Pemotongan Parsial dan Penyisipan Nukleotida pada Ujung Fragmen DNA

Konstruksi pustaka genom membutuhkan potongan DNA yang besar.

Untuk mendapatkan fragmen-fragmen dengan ukuran relatif besar dilakukan

pemotongan parsial dengan cara mengurangi jumlah enzim restriksi atau waktu

pemotongan yang digunakan. Dengan menggunakan jumlah enzim restriksi yang

sedikit, enzim restriksi tidak akan memotong DNA genom pada seluruh situs

pengenalan yang ada dan hanya memotong pada beberapa situs saja sehingga

menghasilkan fragmen-fragmen DNA genom yang relatif panjang.

Ukuran 7-20 kb DNA T. langsdorffiana didapat dari pemotongan 1 g

DNA dengan 0.01 unit Sau3AI (Takara) pada 37ºC selama 30 menit. Pada

konsentrasi 0.015, 0.02 dan 0.04 U/µg DNA, DNA genom terpotong menjadi

fragmen DNA yang lebih kecil (Gambar 7). Pada kedelai, pemotongan 1 g

Gambar 7 Fragmen DNA T. langsdorffiana hasil pemotongan parsial dengan

Sau3AI. Lajur 1 = marker 1 kb ladder (Bexel Biotechnology); lajur 2

= DNA/Sau3AI 0.01 U; lajur 3 = DNA/Sau3AI 0.015 U; lajur 4 =

DNA/Sau3AI 0.02 U; lajur 5 = DNA/Sau3AI 0.04 U.

DNA selama 30 menit pada 37oC dengan 0.01 U Sau3AI menghasilkan fragmen

yang berukuran besar (Suharsono 2002, 2007). Hal ini menunjukkan bahwa

pemotongan DNA genom tumbuhan dengan konsentrasi sekitar 0.01 U/µg DNA

pada suhu 37oC selama 30 menit dapat digunakan sebagai acuan untuk

mendapatkan fragmen DNA yang berukuran besar walaupun hasil pemotongan

sangat ditentukan oleh beberapa faktor seperti kemurnian DNA, spesies asal DNA,

15000

10000

9416

pb

1000

1 2 3 4 5

20

keadaan (kemurnian) enzim restriksi (Sau3AI), lama dan suhu inkubasi

(Suharsono 2002, 2007).

DNA genom yang telah dipotong menggunakan enzim restriksi Sau3AI

tervisualisasi sebagai usapan (smear). Usapan ini merupakan kumpulan fragmen-

fragmen DNA hasil potongan tersebut yang sangat bervariasi ukurannya.

Enzim Sau3AI mengenali situs spesifik 5 -GATC-3 dan memotong situs

tersebut sebelum nukleotida G sehingga pemotongan DNA T. langsdorffiana

menggunakan enzim Sau3AI menghasilkan ujung menggantung GATC. Untuk

menghindari terjadinya penyambungan antarpotongan DNA, ujung-ujungnya telah

diperlakukan dengan penambahan nukleotida dGTP dan dATP sehingga ujung

menggantungnya menjadi GA. Ujung GA dari satu fragmen DNA T.

langsdorffiana tidak dapat menyambung dengan ujung GA dari fragmen DNA T.

langsdorffiana lainnya. Vektor fage yang dipotong dengan XhoI yang mengenali

situs spesifik 5 -CTCGAG-3 dan memotong diantara C dan T pada situs tersebut,

menghasilkan ujung menggantung TCGA. Penambahan nukleotida dCTP dan

dTTP pada ujung situs sisipan (TCGA) dari vektor fage menghasilkan ujung

menggantung TC sehingga tidak akan terjadi penyambungan antar vektor. Ujung

menggantung GA dari fragmen DNA T. langsdorffiana hanya cocok dengan ujung

menggantung TC dari vektor sehingga proses penyambungan akan terjadi antara

DNA T. langsdorffiana dan vektor. Spesifikasi kecocokan antara ujung DNA T.

langsdorffiana dan vektor fage menyebabkan efisiensi perakitan vektor

rekombinan menjadi tinggi.

Konstruksi Fage Rekombinan

Terbentuknya plak pada hamparan putih bakteri menunjukkan bahwa

proses transveksi fage ke dalam E. coli berhasil dengan baik. Ini juga berarti

bahwa proses pengemasan hasil ligasi DNA fage berhasil dengan baik. Jika

bakteriofage menginfeksi suatu biakan cair bakteri, maka suspensi biakan

berwarna jernih. Sedangkan pada bakteri yang disebar di atas permukaan media

padat, fage tidak bisa menginfeksi seluruh bakteri karena tidak dapat berdifusi

secara bebas. Partikel fage yang dibebaskan dari sel bakteri yang sudah lisis hanya

bisa menginfeksi sel bakteri lain yang berdekatan. Akibatnya akan terlihat daerah

21

bening yang disebut dengan plak pada sebaran bakteri. Menurut Dale (1994),

jumlah plak berkorelasi dengan jumlah partikel fage yang ditransveksikan pertama

kali. Oleh sebab itu, agar penghitungan jumlah fage tidak salah maka jumlah

bakteri yang diinfeksi harus sama dengan atau lebih besar daripada jumlah fage.

Pengemasan hasil ligasi 0.5 g DNA T. langsdorffiana dengan

BlueSTAR-1 dengan rasio molaritas 2.9 : 1 menghasilkan titer sebesar 1.7 x 105

plaque forming unit (pfu) tiap ml. Fage yang terbentuk pada penelitian ini relatif

tinggi. Hal ini menunjukkan bahwa proses pengemasan DNA ke dalam protein

mantel berjalan dengan baik.

Untuk mengetahui jumlah klon rekombinan, pustaka genom yang terbentuk

diambil 10 µl dan diencerkan 100 kali dan 1000 kali, kemudian ditransveksikan ke

E. coli galur ER1647 dan diseleksi biru-putih (Gambar 8).

Gambar 8 Seleksi biru-putih terhadap plak.

Terbentuknya plak jernih menunjukkan bahwa bakteriofage mengandung

DNA sisipan untuk membentuk lambda rekombinan. Penggunaan X-gal pada

penelitian ini bertujuan untuk membedakan lambda rekombinan dan bukan

rekombinan. Plasmid pBlueSTAR-1 mengandung gen lacZ yang menyandikan β-

galaktosidase. Pada lacZ terdapat daerah yang disebut daerah pengklonan ganda.

Pada daerah pengklonan ini, terdapat banyak situs restriksi dari berbagai enzim

restriksi. Bila gen lacZ tersisipi DNA asing, gen lacZ tidak diekspresikan sehingga

β-galaktosidase tidak disintesis. Tidak adanya β-galaktosidase menyebabkan X-gal

tidak dapat dihidrolisis. X-gal bersifat kromogen yang akan menghasilkan warna

biru bila dihidrolisis menjadi glukosa dan galaktosa. Warna biru itu sendiri terikat

Plak

rekombinan

plak non

rekombinan

22

pada galaktosa, dan hanya akan kelihatan jika galaktosa terlepas dari X-gal. Plak

yang berwarna jernih menunjukkan bahwa plak tersebut tersusun dari fage

rekombinan karena adanya DNA sisipan pada gen lacZ.

Hasil seleksi biru-putih menunjukkan bahwa pustaka genom T.

langsdorffiana yang dikonstruksi pada penelitian ini mengandung rata-rata 8%

fage rekombinan (Tabel 1).

Tabel 1 Hasil seleksi biru-putih terhadap pustaka genom T. langsdorffiana

Perco-

baan

Pengen-

ceran

Jumlah plak (pfu) Konsentrasi

(pfu/ml)

% Plak

rekombi-

nan Biru (non

rekom-

binan)

Jernih

(rekom-

binan)

Total

I 100 x

1000 x

171

14

6

2

177

16

1.77 x 105

1.6 x 105

3.4

12.5

Rata-rata percobaan I 1.7 x 105 8

II 100 x 249 11 260 2.6 x 105 4

Rata-rata percobaan I dan II 2.2 x 105 6

Walaupun proses pengemasan fage berjalan dengan baik, jumlah fage

rekombinan yang terbentuk relatif kecil dibandingkan dengan pustaka genom

kedelai kultivar Slamet dan Lumut (Suharsono 2002, 2007). Rendahnya jumlah

fage rekombinan yang terbentuk dapat disebabkan oleh proses ligasi yang tidak

berlangsung dengan baik sehingga tidak semua fragmen DNA T. langsdorffiana

dapat menyambung dengan DNA vektor.

Rendahnya efisiensi ligasi ini dapat disebabkan oleh tidak sempurnanya

proses fill-in pada saat pembentukan ujung-ujung fragmen DNA T. langsdorffiana.

Rendahnya efisiensi ligasi dan fill-in sangat dipengaruhi oleh kemurnian DNA.

Isolasi DNA T. langsdorffiana tidak mudah karena mengandung polisakarida.

Polisakarida ini sangat mengganggu dalam isolasi DNA karena mempunyai sifat

fisik yang mirip DNA. Proses isolasi DNA memerlukan pemanasan dalam melisis

sel, dan dalam keadaan panas, polisakarida berbentuk seperti lendir yang

menyerupai DNA. Pada saat DNA diendapkan dengan sentrifugasi, polisakarida

juga mengendap bersama-sama dengan DNA. Meskipun telah diberikan PVP

untuk mengikat polisakarida seperti prosedur Chang et al. (1993), polisakarida

23

yang berbentuk gel tetap terbentuk dan bercampur dengan DNA. Menurut Renner

(2001), ekstraksi dalam proses isolasi DNA seringkali diulang beberapa kali

karena daun melastomataceae mengandung produk sekunder yang menyebabkan

DNA sangat sulit untuk diisolasi. Kemurnian dan keutuhan DNA sangat

menentukan keberhasilan percobaan pada tahap-tahap selanjutnya.

Ukuran DNA Sisipan

Untuk mengetahui ukuran DNA T. langsdorffiana yang tersisip di dalam

vektor, satu plak yang berwarna jernih diambil dengan ujung pipet mikro

berukuran 200 µl yang telah dipotong ujungnya sehingga berukuran sedikit lebih

besar dari ukuran plak. Fage yang terdapat di gel dielusi dalam 500 l bufer SM

selama semalam. Fage ini ditransveksikan ke E. coli galur BM25.8 yang dapat

mensintesis rekombinase cre. Rekombinase cre menginduksi terjadinya proses

rekombinasi pada situs loxP yang dimiliki vektor BlueSTAR-1 (Suharsono

2007) sehingga membentuk plasmid pBlueSTAR-1 rekombinan yang mengandung

DNA T. langsdorffiana. Proses rekombinasi pada dua situs loxP pada

rekombinan menghasilkan plasmid pBlueSTAR-1 dan DNA T. langsdorffiana

sebagai sisipan (Gambar 9).

Gambar 9 DNA T. langsdorffiana menggantikan daerah lacZ, lambda, EMC,

lambda, EMC dari vektor fage .

24

10000 10000

Proses eksisi terbaik terjadi bila suspensi fage hasil elusi diencerkan 100

kali sebelum dilakukan transveksi pada E. coli galur BM25.8 seperti pada hasil

Suharsono (2002, 2007). Pengenceran ini dimaksudkan agar terbentuk plak yang

menyebar dan terpisah satu dengan lainnya. Plasmid yang berada di dalam E. coli

galur BM25.8 tidak efisien dalam melakukan perbanyakan sehingga setelah

diisolasi, plasmid tersebut diintroduksikan ke dalam E. coli galur DH5 .

Keberadaan plasmid di dalam E. coli DH5 diseleksi dengan ampisilin,

sehingga hanya bakteri yang mengandung plasmid rekombinan adalah yang

tumbuh di media tersebut. Adanya gen resistensi terhadap antibiotik di dalam

plasmid rekombinan memudahkan proses seleksi terhadap klon bakteri yang

membawa plasmid rekombinan. E. coli DH5 yang tidak mengandung plasmid

rekombinan mengalami kematian pada media yang mengandung ampisilin.

Untuk mengetahui ukuran sisipan, plasmid pBlueSTAR-1 rekombinan

dipotong dengan enzim restriksi EcoRI. EcoRI adalah suatu enzim restriksi yang

berasal dari E. coli RY 13 yang mengenali dan memotong rangkaian spesifik 6 pb

yaitu 5 -GAATTC-3 dan secara teoritis memotong DNA pada sekuen spesifik

tersebut sekali setiap 4096 pb (46). Ujung potongan yang dihasilkan enzim restriksi

ini adalah ujung kohesif/“sticky” ends (Old & Primrose 1989; Murray et al. 1996).

Pemotongan plasmid pBlueSTAR-1 rekombinan dengan EcoRI menghasilkan dua

fragmen DNA yang masing-masing berukuran sekitar 2.1 kb dan 10 kb (Gambar

10). Fragmen DNA berukuran 2.1 kb adalah vektor plasmid pBlueSTAR-1 dan

fragmen yang berukuran 10 kb adalah DNA T. langsdorffiana yang tersisip di

dalam plasmid pBlueSTAR-1.

Gambar 10 Plasmid rekombinan yang dipotong dengan EcoRI. Lajur 1 = marker 1

kb ladder (Promega); lajur 2 = vektor rekombinan/EcoRI.

6000

4000

3000 2500

2000

1500

Vektor berukuran

2.1 kb

pb 1 2

Insert berukuran

10000 pb

25

Ukuran DNA sisipan yang relatif besar yaitu 10 kb ini sangat bermanfaat

dalam konstruksi pustaka genom karena pustaka genom hanya membutuhkan titer

rekombinan yang relatif sedikit untuk memuat semua informasi genetik yang

dimiliki oleh suatu organisme. Ukuran yang besar juga sangat bermanfaat dalam

isolasi gen utuh dan pemetaan fisik karena dapat mengandung lebih dari satu gen

(Suharsono 2002, 2007). Gen pada eukariot rata-rata berukuran 1346 pb (Xu et al.

2006). Vektor lain yang dapat digunakan untuk mengklon fragmen-fragmen yang

besar adalah BAC dan YAC, sehingga kedua vektor ini sering digunakan untuk

konstruksi pustaka genom, tetapi kedua vektor ini lebih sulit untuk direkayasa

dibandingkan dengan fage.

Ukuran Pustaka Genom

Konstruksi pustaka genom bertujuan untuk mengoleksi genom dari suatu

organisme di dalam klon-klon rekombinan. Setiap klon rekombinan adalah turunan

yang berasal dari sel tunggal hasil introduksi fage yang membawa molekul DNA

rekombinan yang sama ke sel E. coli.

Untuk mengetahui derajat kelengkapan suatu pustaka genom, maka

informasi ukuran genom dari suatu organisme harus diketahui. Ukuran pustaka

genom dari suatu organisme tergantung dari jumlah DNA dari genom haploid

organisme tersebut. Karena ukuran genom T. langsdorffiana belum diketahui,

maka ukuran genom Dissotis canescens digunakan sebagai dasar perhitungan

derajat kelengkapan pustaka genom karena kedua spesies tersebut termasuk dalam

famili Melastomataceae. Menurut Hanson et al. (2001), genom haploid Dissotis

canescens berukuran 1.81 x 105 kb sehingga dalam keadaan diploid menjadi 3.62 x

105 kb. Untuk memuat seluruh genom ini dengan ukuran sisipan 10 kb, maka

pustaka genom memerlukan 3.62 x 104 klon rekombinan bila fragmen DNA

sisipan tidak saling tumpang tindih. Bila potongan DNA sisipan merupakan daerah

yang tumpang tindih letaknya di dalam genom, maka pustaka genom ini

memerlukan jumlah klon rekombinan lebih besar daripada 3.62 x 104.

Pada penelitian ini, volume fage yang disintesis adalah 500 µl, sedangkan

titer fage rekombinannya adalah 8% sehingga jumlah total fage rekombinan adalah

6.8 x 103 pfu. Dengan menggunakan rumus N = (ln (1-P))/( ln (1-f)), N = jumlah

SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan

Potongan besar DNA T. langsdorffiana dihasilkan dari pemotongan DNA

secara parsial dengan menggunakan 0.01 U Sau3AI tiap µg DNA pada suhu 37ºC

selama 30 menit. Potongan besar ini telah berhasil disisipkan ke dalam fage

BlueSTAR-1. Pengemasan hasil ligasi 0.5 µg DNA T. langsdorffiana dengan

BlueSTAR-1 dengan rasio molaritas 2.9 : 1 menghasilkan titer yang cukup tinggi

yaitu 1.7 x 105 pfu/ml dan 8% diantaranya adalah rekombinan. Karena volumenya

500 µl, maka pustaka genom genom T. langsdorffiana yang dikonstruksi

mempunyai 6.8 x 103 pfu rekombinan. Analisis DNA sisipan menunjukkan bahwa

DNA T. langsdorffiana yang tersisip di dalam BlueSTAR-1 berukuran 10 kb.

Berdasarkan ukuran DNA sisipan ini dan genom Dissotis canescens yang

berkerabat dekat dengan T. langsdorffiana maka peluang mendapatkan sembarang

potongan DNA atau gen di dalam pustaka genom adalah 17% sehingga pustaka

ini belum mengandung seluruh genom T. langsdorffiana.

Saran

Untuk mendapatkan pustaka genom T. langsdorffiana yang lengkap maka

DNA yang digunakan harus murni sehingga proses pemotongan, fill-in dan ligasi

dapat berjalan dengan baik.

Ucapan Terima Kasih

Penelitian ini dibiayai oleh Proyek DIPA BIOTROP Tahun 2005 atas

nama Dr. Ir. Suharsono, DEA.

26

fage rekombinan, f = rasio ukuran DNA sisipan terhadap ukuran genom

(Sambrook et al. 1989), maka peluang (P) seluruh genom T. langsdorffiana

terdapat dalam pustaka genom adalah 17%. Hal ini berarti bahwa peluang untuk

mendapatkan sembarang potongan DNA di dalam pustaka genom adalah 17%.

Peluang ini sangat kecil dibandingkan dengan pustaka genom kedelai kultivar

Lumut (Suharsono 2007).

Hal yang perlu diperhatikan dalam mengkonstruksi suatu pustaka genom

adalah bahwa pustaka genom tersebut harus mempresentasikan semua gen yang

ada di dalam sumber DNA asalnya. Dengan kata lain, suatu pustaka gen ini

dikatakan representatif apabila mengandung semua DNA dari suatu organisme.

DAFTAR PUSTAKA

Chang S, Puryear J, Cairney J. 1993. A simple method for isolating RNA from

pine trees. Plant Mol Biol Rep 11:113-116.

Chauthaiwale VM, Therwath A, Deshpande VV. 1992. Bacteriophage lambda

as a cloning vector. Microbiol Mol Biol Rev 56(4):577-591.

Clontech. 1999. Chroma Spin Columns. [Produk protokol]. California:

Clontech.

Cross SH, Clark VH, Bird AP. 1999. Isolation of CpG islands from large

genomic clones. Nucl Acid Res 27(10):2099-2107.

Dale JW. 1994. Molecular Genetics of Bacteria. Ed ke-2. England: John Wiley

& Sons.

Elvawati. 1999. Konstruksi pustaka cDNA tanaman kedelai (varietas Yellow

Biloxy) yang diinduksi cekaman aluminium menggunakan vektor

[tesis]. Bogor: Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.

Faravani M, Bakar BH. 2007. Descriptive analysis on the morphology, growth

and branching patterns of princess flower (Tibouchina urvilleana Cogn.)

in Peninsular Malaysia. J of food, Agriculture & Environment 5(1):234-

238.

Glick BR, Pasternak JJ. 1994. Molecular Biotechnology, Principles and

Applications of Recombinant DNA. Washington DC: American Society

for Microbiology Pr.

Hanson L, McMahon KA, Johnson MAT, Bennett MD. 2001. First nuclear

DNA C-values for 25 angiosperm families. Ann of bot 87:251-258.

http://www.abc.net.au/gardening/stories/s2040246.htm [13 Mei 2009].

http://www.plantzafrica.com/plantcd/dissotiscanes.htm [13 Mei 2009].

Jansen S, Watanabe T, Smets E. 2002. Aluminium accumulation in leaves of 127

species in Melastomataceae, with comments on the order Myrtales. Ann of

Bot 90:53-64.

Judd WS, Campbell CS, Kellog EA, Stevens PF, Donoghue MJ. 2005. Plant

Systematics: A Phylogenetic Approach. Ed ke-2. USA: Sinauer

Associates, Inc.

Kurnia R. 2005. Isolasi gen penyandi glutathione s transferase dari pustaka

genom kedelai kultivar slamet [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan

Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.

29

Kurniawan A. 2005. Isolasi fragmen DNA yang mengandung gen penyandi

glutathione s transferase dari pustaka genom kedelai kultivar lumut

[skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam,

Institut Pertanian Bogor.

Lodish et al. 2000. Molecular Cell Biology. Ed ke-4. New York: Madison

Avenue.

Miftahudin, Widyastuti U, Suwanto A, Jusuf M, Aswidinoor H. 1998.

Construction of cDNA library from drought-stressed soybean. Hayati

5:34-37.

Muhaemin. 2008. Analisis pertumbuhan melastoma (Melastoma malabathricum

auct. non. L. dan M. affine D. Don.) yang mendapat cekaman pH rendah

dan aluminium [tesis]. Bogor: Sekolah pascasarjana, Institut Pertanian

Bogor.

Murray K. 1977. Applications of Bacteriophage Lambda in Recombinant DNA

Research. Di dalam: Scott WA, Werner R, editor. Molecular Cloning of

Recombinant DNA. USA: Academic Pr. hlm. 133-154.

Mutiasari A. 2008. Akumulasi aluminium pada Melastoma affine dan

Melastoma malabathricum [tesis]. Bogor: Sekolah Pascasarjana, Institut

Pertanian Bogor.

Novagen. 1997. BlueStar Vector System. Madison: Novagen.

Old RW, Primrose SB. 1989. Principles of Gene Manipulation. Oxford:

Blackwell.

Rachman F. 2005. Isolasi fragmen DNA yang mengandung gen penyandi

peroksidase dari pustaka genom kedelai kultivar slamet [skripsi]. Bogor:

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian

Bogor.

Rahmawati. 2005. Isolasi gen peroksidase melalui penapisan terhadap pustaka

genom kedelai kultivar lumut [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan

Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.

Renner SS. 1993. Phylogeny and classification of the Melastomataceae and

Memecylaceae. Nordic J of Bot 13:519-540.

Renner SS, Clausing G, Meyer K. 2001. Historical biogeography of

Melastomataceae the roles of tertiary migration and long distance

dispersal. Am J of Bot 88(7):1290-1300.

Sambrook J, Frisch EF, Kochian LV, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A

Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory.

30

Singer M, Berg P. 1991. Genes & Genomes. California: University Science

Books.

Stratagene. 2003. Gigapack III Gold Packaging Extract, Gigapack III Plus

Packaging Extract, and Gigapack III XL Packaging Extract. Instruction

Manual. California: Stratagene Cloning System.

Suharsono. 2002. Konstruksi pustaka genom kedelai kultivar Slamet. Hayati

9:67-70.

Suharsono, Julianto T, Jusuf M. 2003. Penapisan pustaka genom tanaman

kedelai kultivar Lumut menggunakan pelacak gen peroksidase dari

Arabidopsis thaliana. Simposium Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik,

Balitbiogen Pertanian, Bogor. hlm. 11-12.

Suharsono. 2007. Pembuatan perpustakaan genom kedelai (Glycine max (L.)

Merrill) kultivar Lumut di dalam fage lambda. Biosfera 24(2):83-89.

Wahyudi AT. 2001. Perpustakaan gen: Bagaimana mengontruksinya? [ulasan].

Hayati 8:27-30.

Xu L et al. 2006. Average gene length is highly conserved in prokaryotes and

eukaryotes and diverges only between two kingdom. Submitted as a letter

to Mol Biol and Evol, MBE Advance Access published 12 April 2006.

Yuwono T. 2008. Biologi Molekular. Jakarta: Erlangga.