DR.Restu Syamsul Hadi, MKes.Teknologi dna rekombinan (GENETIC ENGINEERING)

Teknik Rekombinan meliputi:

-Teknik untuk mengisolasi DNA-Teknik untuk memotong DNA.-Teknik untuk menggabung atau menyambung DNA.-Teknik untuk memasukkan DNA kedalam sel hidup sehingga DNA rekombinan dapat bereplikasi dan dapat diekspresikan

Organisme transgenik: organisme yang membawa gen yang berasal dari jenis organisme lainnya.

Organisme transgenik dihasilkan melalui Rekayasa Genetika

Rekayasa Genetika menggunakan Teknologi DNA Rekombinan

Teknologi DNA Rekombinan kumpulan teknik atau metoda yang digunakan untuk mengkombinasikan gen-gen secara buatan.

Perubahan genetik suatu organisme, atau keturunan, teknik untuk menghilangkan karakteristik bahan yang tidak diinginkan atau untuk menghasilkan bahan yang baru yang diinginkan.

Penambahan, penghapusan, atau manipulasi sifat tunggal dalam organisme untuk menciptakan perubahan yang diinginkan Definisi:Apa Rekayasa Genetika?

Isolasi dan pemurnian DNA Isolasi DNA bakteri Isolasi DNA plasmid Pemurnian secara kimiawi dan enzimatisBerbagai jenis dan karakterisasi vektor vektor plasmid vektor yeast vektor bakteriofagEnzim restriksi dan ligase Jenis enzim restriksi Faktor yang berpengaruh terhadap enzim restriksi Faktor yang berpengaruh terhadap enzim ligase

Teknik Elektroforesis dan PCR Faktor yang berpengaruh dalam elektroforesis Faktor yang berpengaruh terhadap PCRDNA sekuensing dan hibridisasi southern blot northern blot western blotDNA rekombinan dan Transformasi Isolasi Restriksi Sel kompeten Transformasi

Rekayasa genetik pada : Rekayasa genetik pada hewan Rekayasa genetik pada tumbuhan Rekayasa genetika pada manusiaProduk transgenik, keamanan dan bioetika Biosafety bioetika GMO dan genetically modofied foods

Rekayasa genetika, juga dikenal sebagai teknologi DNA rekombinan, berarti mengubah gen dalam organisme hidup untuk menghasilkan Genetically Modified Organism (GMO) dengan genotipe baru Berbagai jenis modifikasi genetik yang mungkin: memasukkan gen asing dari satu spesies menjadi - spesies lain, - membentuk organisme transgenik; - mengubah gen yang ada sehingga produknya berubah, - mengubah ekspresi gen sehingga ditranslasikan lebih sering atau tidak sama sekali

Awalnya manipulasi genetik secara tradisional seperti : pemuliaan selektif untuk meningkatkan nilai gizi tanaman terlalu lambat

Pengenalan gen dari satu spesies yang berasal dari organisme ke organisme dari spesies yang berbeda (organisme transgenik) Kloning gen untuk menentukan fungsinya Mengubah fenotip suatu organisme untuk meningkatkan sifat yang diinginkan

Rekayasa genetika dengan teknik molekuler Memungkinkan untuk menciptakan perubahan genetik lebih besar pada kecepatan yang jauh lebih cepat Produksi bahan farmasi dalam jumlah besarMENGAPA ILMUWAN MENGEMBANGKAN REKAYASA GENETIKA..?

Teknik Dasar Rekayasa Genetika

Selective BreedingTanaman atau hewan dengan karakteristik yang diinginkan paling banyak digunakan untuk pemuliaan lebih lanjut

Hybridization (Crossbreeding)Menggabungkan strain yang berbeda spesies untuk menggabungkan karakteristik terbaik dari keduanya. (burung dara + perkutut = sinom) Recombinant DNA TechnologiesTransformasi

Basic steps in genetic engineeringIsolasi genInsersi ke dalam host menggunakan vectorPerbanyak copy DNA sebanyak mungkinPemisahan produk gen yang dihasilkanEkstraksi produk gen yang diinginkan

Fluorescent proteins are a useful tool in biotechnologyMenjadi petanda adanya ekspresi gen dan protein target dalam sel-sel hidup suatu organisme

Paling banyak digunakan adalah green fluorescent protein (GFP) pertama kali diisolasi dari Victoria aequorea (ubur-ubur), dapat dilekatkan ke hampir semua protein dan yang menarik dan masih dapat menjadi fluorescent molecule.

Dapat digunakan untuk melokalisasi protein yang sebelumnya belum di-karakterisasi untuk memvisualisasikan dan melacak protein untuk lebih memahami peristiwa selular.

Dapat digunakan untuk melihat proses perkembangan

Hewan Transgenik Tikus transgenik dapat digunakan untuk mempelajari sistem kekebalan tubuh dan penyakit genetik

Babi : Faktor VIII pada pembekuan darah, organ-organ untuk transplantasi

Hewan lain : hormon pertumbuhan IL-2 (kanker), albumin

Organisme rekombinanTanaman tahan hamajagung (gen toksin dari Bacillus thuringiensis yang dapat membunuh serangga)Tanaman tomatGolden rice (beta-carotene)Plant-based vaccines

Genetically Modified OrganismsTanaman tahan hamaJagung Bt (mengandung gen toksin dari Bacillus thuringiensis yang membunuh hama)Golden rice (mengandung beta-carotene)Tanaman sebagai vaksin

Genetic engineering of Bt-resistant corn (Bt-corn) Bt-transgenic plants are resistant to insects, no need for sprayinginsecticide Clone Bt toxin gene from bacteria and express in plants Tanaman jagung tidak perlu lagi insektisida, serangga/ulat akan mati bila memakan jagung

Contoh penerapan rekayasa genetika pada tanamanGolden Rice mengandung gen untuk menghasilkan vitamin A Biji beras (endosperm) kekurangan senyawa essential seperti vitamin A dan precursornya (-carotene). Defisiensi Vitamin A dapat meyebabkan kebutaan dan penurunan sistem imun tubuh.

HUMAN GENETIC ENGINEERING Rekayasa genetika manusia berarti mengubah gen dalam sel manusia yang hidup

Misalnya pada penderita penyakit paru-paru yang disebabkan oleh gen yang cacat dalam sel paru-paru. Dengan cara memperbaiki gen-gen memungkinkan akan sembuh .

Mengubah gen dalam sel hidup dengan menempatkan gen baru yang diinginkan ke virus yang diperbolehkan untuk masuk ke sel-sel manusia dan yang memasukkan gen baru ke dalam sel bersama dengan sebelumnya

HUMAN GENETIC ENGINEERING

"Somatic" genetic engineeringRekayasa genetika yang menargetkan gen di organ tertentu dan jaringan tubuh orang yang ada tanpa mempengaruhi gen dalam telur atau sperma. Percobaan transfer gen somatik sedang menjalani uji klinis, dengan hasil yang beragam sampai saat ini. Suatu hari nanti mungkin akan dapat digunakan dengan efektif

"Germ line" genetic engineering

Rekayasa genetika yang menargetkan gen dalam telur, sperma, atau embrio sangat awal Perubahan yang mempengaruhi setiap sel dalam tubuh individu yang dihasilkan, dan diwariskan kepada semua generasi berikutnya[note: The term "somatic" comes from the Greek "soma" for "body."The term "germline" refers to the "germ" or "germinal" cells, the eggs and sperm.

Insulin (diabetics) Factor VIII (males w/hemophilia A) Factor IX (hemophilia B) Human growth hormone Erythropoietin (anemia) Angiostatin/endostatin(anti-cancer drugs) leptinProduk DNA Recombinant untuk terapi pada manusia

DESIGNER BABY

Kesulitan pada Rekayasa Genetika ManusiaInserting gene in correct cellsInserting gene so it is expressed correctly Orientation RegulationControlling virus vectorEthical issues

KLONING GEN

Kloning - definisiDari Bahasa Yunani - klon, rantingKumpulan turunan suatu individu yang dihasilkan tanpa melalui perkawinan; kumpulan replika sebagian atau seluruh makromolekul (contoh, DNA atau antibodi)Suatu individu yang tumbuh dari satu sel somatik induknya serta memiliki identitas genetik yang sama dengan induknya Klon: Koleksi molekul atau sel yang semua identitasnya sama dengan molekul atau sel penurunnya

Kloning DNAMetoda untuk memurnikan atau mengidentifikasi dan memperbanyak suatu potongan DNA tertentu (klon) yang dikehendaki dari campuran potongan-potongan DNA yang kompleks.

Kloning GenKetika keseluruhan DNA dari suatu organisme diekstraksi, akan diperoleh seluruh gen yang dimiliki organisme tersebutPada kloning gen, hanya gen (DNA) tertentu yang diisolasi, dimurnikan, dan diperbanyak (diklon)

Tujuan mengklon GenMenentukan urutan basa nukleotida penyusun gen tersebutMenganalisis atau mengidentifikasi urutan basa nukleotida pengendali gen tersebutMempelajari fungsi RNA / protein/enzim yang disandi gen tersebutMengidentifikasi mutasi yang terjadi pada kecacatan gen yang mengakibatkan penyakit bawaanMerekayasa organisme untuk tujuan tertentu, misalnya memproduksi insulin, ketahanan terhadap hama, dll.

Sumber DNA untuk diklonDNA kromosomcDNA (complementary DNA) yang disintesis menggunakan mRNA sebagai cetakan (template)DNA yang dihasilkan dari perbanyakan menggunakan PCR

Bahan / Alat untuk MengklonEnzim endonuklease restriksi Enzim ligaseVektorsInang (Host)Metoda untuk memasukkan DNA ke dalam sel inang

Memotong DNAMenggunakan enzim endonuklease restriksiUjung lengket (sticky ends)Ujung tumpul (blunt ends)

Penamaan enzimEcoRIE = genus (Escherichia)co = species (coli)R = strainI = # of enzyme

Penyambungan (pasting) DNAPembentukan ikatan-H pada ujung-ujung yang komplemen (sticky ends)

Ligase membentuk ikatan fosfodiester untuk merekatkan benang-benang DNA

Vektor untuk MengklonDiperlukan suatu wahana (vehicle) untuk memasukkan suatu potongan DNA ke dalam sel agar DNA tersebut dapat disimpan dan diperbanyak di dalam sel tersebut

PlasmidDNA bukan kromosom (extrachromosomal DNA) yang secara alami dimiliki suatu jasadBentuknya benang ganda (double strands DNA, dsDNA) sirkular

Plasmid buatan (Artificial plasmids) dapat dibuat dengan menambahkan potongan-potongan DNA lain

Vektor untuk MengklonPlasmid dapat dimodifikasi untuk mampu membawa potongan DNA lain ke dalam sel bila memiliki:

Replikator (origin of replication) Penanda (Marker) yang mudah diseleksi (misalnya gen ketahanan terhadap antibiotik) Situs untuk mengklon (potongan DNA yang memiliki urutan basa nukleotida yang menjadi sasaran enzim restriksi tetapi tidak terletak di dalam daerah replikator atau penanda

Plasmid yang Dimiliki oleh Escherichia coli

Plasmid Khimera (Chimeric Plasmids)Khimera berasal dari mitologi Yunani, makhluk dengan tubuh gabungan dari bagian-bagian makhluk binatang lainSetelah pemotongan plasmid menggunakan suatu enzim restriksi, potongan DNA asing yang memiliki ujung pemotongan yang sama dapat disisipkan Setelah ujung-ujung plasmid dan potongan DNA asing disambung, akan dihasilkan "plasmid rekombinan" Plasmid rekombinan dapat bereplikasi dalam sel inang yang sesuai

Kloning TerorientasiBila diinginkan untuk menginsersikan potongan DNA asing dengan orientasi tertentu Dilakukan dengan memotong DNA vektor maupun DNA sumber gen yang dikehendaki menggunakan dua enzim restriksi yang berbeda

Vektor untuk Mengklon1 Vektor berupa plasmid 2 Vektor berupa bakteriofaga3 Cosmid 4 BACs (Bacterial Artificial Chromosome) & YAC (Yeast Artificial Chromosome)

Memiliki origin of replication dari inang yang dituju, sehingga memungkinkan replikasi secara independen terhadap genom inang.Memiliki penanda selektif: Memudahkan seleksi sel pembawa plasmid tersisipi DNA asingketahanan terhadap antibiotik ganda penapisan biru-putihMemiliki banyak situs pengkloningan (multiple cloning sites, MCS)Mudah diisolasi dari sel inang.Vektor berupa Plasmid

Multiple Cloning Site (MCS)

Vektor berupa Plasmid

Vektor berupa PlasmidKeunggulan:Kecil, mudah pengerjaannyaStrategi seleksi mudahBerguna untuk mengklon potongan DNA ukuran kecil (< 10kbp)Kelemahan:Kurang bermanfaat untuk mengklon potongan DNA ukuran besar (> 10kbp)

Bakteriofaga (l phage)

Vektor berupa bakteriofaga (l vectors)Lengan kiri:Protein penyusun kepala & ekorLengan kanan:Sintesis DNAPengendalianLisis inangDaerah yang dihilangkan:integrasi & eksisiPengendalian

Vektor berupa bakteriofaga (l vectors)

Vektor berupa BakteriofagaKeunggulan:Bermanfaat untuk mengklon potongan DNA ukuran besar (10 - 23 kbp)Seleksi berdasar ukuranKelemahan:Lebih sulit pengerjaannya

Vektor CosmidKeunggulan:Bermanfaat untuk mengklon potongan DNA berukuran sangat besar (32 - 47 kbp)Seleksi berdasar ukuranPengerjaan seperti plasmidKelemahan:Tidak terlalu mudah untuk mengerjakan plasmid dengan ukuran sangat besar (~ 50 kbp)Gabungan sifat vektor plasmid dan sifat berguna dari situs l cos (dihilangkan pada vektor l)

Vektor Cosmid

Vektor BACReplikasi dimediasi oriS dan oriEparA and parB mengendalikan agar hanya terdapat satu vektor dalam selMenggunakan penanda ketahanan terhadap KhloramfenikolR

Vecktor YACDapat disisipi gen asing 200 - 2000 kbp dan dimasukkan ke dalam yeast

BACs dan YACsKeunggulan:Dapat digunakan untuk mengklon potongan DNA dengan ukuran sangat besar (100 - 2,000 kbp)Penting digunakan dalam proyek penetapan urutan basa nukleotida total genomKelemahan:Tidak mudah mengerjakan molekul DNA dengan ukuran sangat besarBACs : Bacterial Artificial Chromosomes YACs : Yeast Artificial Chromosomes

Shuttle VectorVektor yang dapat digunakan untuk dua macam inang (memiliki origin of replication dari masing-masing inang)

Memilih VektorUkuran DNA yang disisipkanUkuran vektor Situs enzim restriksi yang tersediaJumlah salinan (copy number)Efisiensi kloningKemampuan untuk menapis DNA sisipanRencana penelitian selanjutnya

Cara Mengklon DNA (1)Isolasi vektor kloning (plasmid bacterial) & DNA sumber genPemotongan DNA sumber gen & vektor kloning menggunakan enzim restriksi yang samaPenyisipan potongan DNA sumber gen ke dalam vektor kloning yang telah dipotong menggunakan enzim restriksi yang sama; potongan disambung dengan bantuan enzim DNA ligase

Cara Mengklon DNA (2)Vektor kloning yang telah tersisipi potongan DNA dimasukkan ke dalam sel inang (transformasi sel inang)Penapisan sel pengklon (dan gen yang dimasukkan)Identifikasi sel pengklon pembawa gen yang dikehendaki

Transformasi Sel InangMemasukkan plasmid (yang merupakan vektor yang telah disisipi gen) ke dalam sel inang

Transformasi PRA-INKUBASI Sel E. coli calon penerima plasmid dipaparkan kepada ion positif kalsium klorida (CaCl2). Perlakuan ini memberikan cekaman kepada bakteri yang mengakibatkan membran sel dan dinding sel bakteri tersebut menjadi permeabel terhadap plasmid donor. Proses ini mengakibatkan E. coli menjadi kompeten" untuk menerima plasmid .

Transformasi INKUBASIPlasmid ditambahkan ke dalam suspensi sel E. coli kompeten. Suspensi sel E. coli kompeten lainnya yang tidak ditambah plasmid digunakan sebagai kontrol.

Transformasi KEJUTAN PANAS (HEAT SHOCK) Sel kompeten (baik yang diberi plasmid maupun kontrol) dipaparkan sejenak (90 detik) kepada suhu 42 oC. Langkah ini memaksimumkan masuknya plasmid menembus membran dan dinding sel.

Transformasi PENYEMBUHAN (RECOVERY) Sel kompeten (baik yang diberi plasmid maupun kontrol) ditumbuhkan dalam medium kaya nutrisi untuk memberi kesempatan penyembuhan setelah mengalami cekaman dan kejutan. Masa penyembuhan biasanya berlangsung satu waktu generasi (untuk E. coli berkisar antara 30 hingga 45 menit)

Transformasi PENAPISAN (SCREENING) Sel kompeten yang telah mengalami penyembuhan ditapis pada medium padat yang mengandung senyawa penapis berdasarkan penanda yang dibawa oleh plasmid.

Koloni E. coli yang membawa plasmid dengan penanda gen pendar fluor (pGLO)

E. coli yang Membawa Plasmid pGlo

Penapisan KlonMedium pertumbuhan diberi antibiotik yang sesuai dengan sifat ketahanan yang digunakan sebagai penanda, misalnya KanamisinBakteri di paruh cawan petri sebelah kanan memiliki plasmid dengan penanda ketahanan terhadap Kanamisin(Kanr), yang di sebelah kiri tidak memilikinya

Manfaat

Teknologi DNA rekombinan telah memberikan manfaat dibidang ilmu pengetahuan maupun dibidang terapan.

Contoh: Bidang Kesehatan:

Insulin manusia telah diproduksi secara massal menggunakan bakteri E.coli dan telah diperdagangkan untuk mengobati penyakit diabetis. Merekdagang: HumulinR

Hormon tumbuh manusia (GH) diproduksi menggunakan E.coli dan digunakan untuk mengobati kelainan pertumbuhan (misal: cebol).

Vaksin hepatitis B digunakan untuk mencegah infeksi virus hepatitis. Telah diproduksi secara komersial menggunakan S.cereviciae dalam skala industri

*Gene technology used in same way as genetic engineering, genetic fingerprinting no manipulation of DNA*Genetic engineering is a very young discipline, and is only possible due to the development of techniques from the 1960s onwards. These techniques have been made possible from our greater understanding of DNA and how it functions following the discovery of its structure by Watson and Crick in 1953. Although the final goal of genetic engineering is usually the expression of a gene in a host, in fact most of the techniques and time in genetic engineering are spent isolating a gene and then cloning it. This table lists the techniques that we'll look at in detail.

Need to explain some key terms first before we talk about how we would isolate the gene and clone it*******