DETEKSI VIRUS MENGGUNAKAN ANALISA GENOMIK DAN PROTEOMIK

Bambang SugihartoLaboratorium Biologi Molekul dan Bioteknologi

UPT. Laboratorium Terpadudan Sentra Inovasi-Teknologi CDAST

UNIVERSITAS JEMBERJl. Kalimantan No. 37 Jember, 68121 Email : sugiharto.fmipa@unej.ac.id

Kenampakan gejala penyakit akibat infeksi virus

Sugarcane mosaic virus?

Ringspot Virus ?

Infeksi pada hewan

Analisa Laboratorium ?

PENDAHULUAN :

BIOLOGI – BIOLOGI MOLEKUL – NANO BIOLOGIHubungan antara objek biologi dan ukuranya

nano scale micro scale milli scale

Helical Polyhedral Spherical Complex

TIPE MORFOLOGI VIRUS

Virus tidak mempunyai alat reproduksi

Virus Ebola

STRUKTUR MOLEKUL VIRUS

Partikel virus (virion) tersusun:1. Nukleotida DNA atau RNA 2. Protein dan Enzyme3. Membrane envelope

SCMV

Virus Corona

ANALISA LABORATORIUM Deteksi molekul virus

✓ Pesatnya perkembangan ilmu pengetahuandan teknologi

✓ Analisa biologi dilakukan pada tataranmolekul, reaksi biokimia dan nano-struktur

✓ Sel tersusun oleh makro molekul DNA, RNA dan protein

✓ Setiap molekul DNA atau protein adaperbedaan yang mencirikan organisma

✓ Perbedaan antar molekul dapat digunakanuntuk deteksi organisma yang lebih tepatdan akurat

Analisa molekul organisma

DETEKSI VIRUS

Analisis Genomik(identifikasi, pengukuran ekspresi, perbandingan struktur DNA pada tingkat genome)

Analisis Proteomik(identifikasi dan kuantifikasiprotein pada system biologi )

Berbasis reaksi polymerasePCR (polymerase chain reaction)RT-PCR, Reverse Transcriptase-PCRReal-Time PCR (qPCR, quantitative)

Berbasis hybridisasi DNASouthern Blot, Analisa DNANouthern Blot, Analisa RNA

Sequencing DNAAnalisa lain

Berbasis Reaksi Serologi denganpelacak (probe) antibodi

Immunobloting, Analisa kualititatif

ELISA (Enzyme-linked aimmunosorbent assay)Analisa kuantitatif

Rapid TestDeteksi IgG/IgMDeteksi protein virus

ANALISA PCR DAN RT-PCR – PRINSIP DASAR(Reaksi polimerisasi/replikasi DNA yang diulang-ulang)5’ 3’

5’3’

5’ 3’

5’3’5’ 3’

5’3’

5’ 3’

5’3’

5’ 3’

5’3’5’

5’

3’

3’

5’ 3’

5’3’

5’3’5’3’

denaturation (94 oC)

primer annealing (50-70 oC)

primer extension (72 oC)

Next round…..

5’ 3’AAAAAnTTTTTn

5’ 3’AAAAAnTTTTTn

first-strand cDNA synthesis by RT

5’3’

TTTTTn 5’3’5’

TTTTTn3’ 5’ AAAAAn

RNase treatment;primer annealing (50-70 oC)

primer extension (72 oC)

mRNA

TTTTTn3’

5’

5’

AAAAAn

TTTTTnAAAAAn

Next round…..

DNA

2n DNA Reaksi PCR

Hasil PCR dan visualisasi agarose gel elektroforesis (AGE)

M P+ WT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 WT

PCR

RT-PCR

DNA Sequencer

DNA sequence chart

AGEPCR & RT-PCR GelDoc

Deteksi tanaman transgenik

Deteksi DNA SCMV

Deteksi Real Time-PCR

Baseline – Siklus PCR permulaan sebelum signal flourescent dapat dideteksiThreshold – Tingkatan dimana flourescent mulai dapat terdeteksi

CT – (cycle threshold) Jumlah siklus PCR dimana jumlah hasil PCR melewati threshold

Rn- Reported signal flourescence

Rn – (Rn-baseline) Reported signal dikurangi Baseline

NTC – no template control

Log

fluor

esce

nce

(Rn)

Kurva eksponensialperbanyakan (amplifikasi) DNA hasil PCR

SYBR® green

Amplification Plot Amplification Plot of Standard

76

54

32

Real Time PCR / qPCR (quantitative PCR)

Digunakan penentuan jumlah DNA secara Absolut atau Relative

Menggunakan senyawa flourescense:1. SYBR - EVA Green 2. Primer Probe

Real Time PCR atau qPCR – Fluorescence Primer Probe

SYBR Green VS Flourescense Primer 1. Pertimbangan BIAYA2. Spesifisitas, Probe lebih spesifik3. Jumlah target DNA – sedikit atau

banyak

RNA

DNA

Primer probe

Reporter fluorescen

Contoh analisis Real Time PCR dengan kit seegene

ANALISIS PROTEOMIK – Serological Test(Analisis berdasarkan reaksi antigen dengan antibody)

Pemisahan dan visualisasi protein menggunakan gel elektroforesis

Elektroforesis vertikal

SDS-PAGE 2D elektroferesis

Pemisahanprotein Ecolidan pengecatandengan CBB

Organisma – sel – tersusun oleh banyak macam protein

TEST SEROLOGI(Analisis berdasarkan reaksi antigen-protein dengan antibody)

Teori dasar reaksi antara antibodi dan antigen

Visualisasi aglutinasi akibat adanya reaksi antibody dan antigen

Double immunodiffusion

Single radial immunodiffusion Test aglutinasi

Immuoblotting – Western Blot(deteksi protein menggunakan pemisahan elektroforesis dan reaksi antibodi)

Ekstraksiprotein daritarget seldengan lysis

Pemisahan protein Transfer ke membran Deteksi protein target

kDa

48

35

75

25

HpSCMVCp – 35S CaMV (DR)

M Ps881(+) 7.11 7.12 7.13 7.15 7.16 7.17 7.18

Deteksi1. Colorimetry2. Chemiluminesscence

Deteksi SCMV menggunakanimmunoblot dg antobodi coat protein

Pertimbangan:1. Sensifitas tinggi2. Bisa melihat ukuran protein target3. Semi-kuantitatif4. Waktu 1 – 2 hari /20 sample5. Perlu training

(Thermo Fisher Scientific)

ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)(deteksi protein target secara langsung menggunakan reaksi antigen-antibodi)

Absorbansi pada Plate Reader

Tipe ELISA

Pertimbangan:1. Analisa kuantitatif2. Efisien3. Waktu 1–2 hari /96 sample 4. Perlu training

Rapid Diagnostic Test (RDT)(test cepat dan mudah berbasis antibody)

Pertimbangan :1. Test cepat bisa 20 min selesai2. Analisa kualitatif3. Bisa dikerjakan kebanyakan masyarakat tidak perlu training4. Sensitifitas rendah, bisa terjadi false negative/positive5. Sering hanya digunakan untuk skrening awal

Pembuatan antibodi menggunakan protein recombinant(cara cepat produksi antibodi)

Konstruk

PlasmidTransformasi

Produksi

ProteinPurifikasi

Kontruksi

sintetik DNA

ke vektor

ekspresi

Transformasi

vektor

ekspresi ke

bakteri E.coli

Produksi

protein

rekombinan

skala besar

Pemurnian

protein

menggunakan

resin NiNTA

Induksi

Antibodi

Produksi

AntibodiOuchterlony Western Blot

Injeksi antigen

ke hewan cobaUji reaksi

antara antigen

dan antibodi

Uji sensifitas

antibody

menggunakan

western blot

Pengambilan

antibodi dari

serum darah

hewan coba

Outline pembuatan rekombinan antibodi

Produksidan purifikasirekombinan

Immunoblot - Deteksiinfeksi SCMV denganrekombinan antibodi

Mekanisma ketahanan virus pada tanaman transgenik

Protein Base ResistanceCP-MR

RNA Base ResistanceRNAi— Knock down

BAGIMANA DENGAN KETAHANAN VIRUS PADA MANUSIA ???

TERIMAKASIHMatur Suwun … Matur Sakalangkung….

The picture was taken after cultivation of GM sugarcane in Confined Field Trial (LUT), 2018