departamento de ciencias de la vida y de la...

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DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y DE LA AGRICULTURA CARRERA DE INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA TESIS PREVIO A LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE INGENIERA EN BIOTECNOLOGÍA TEMA: ESTUDIO DE LA DIVERSIDAD GENÉTICA DE POBLACIONES DE GUAYACÁN SABANERO (Tabebuia billbergii) DE BOSQUES SECOS DEL ECUADOR AUTOR: RUEDA CÓRDOVA, ANA ELIZABETH DIRECTORA: M.Sc. JADÁN, MÓNICA CODIRECTOR: ING. TAIPE, MARCO SANGOLQUÍ, JULIO 2015

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DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA

Y DE LA AGRICULTURA

CARRERA DE INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA

TESIS PREVIO A LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE

INGENIERA EN BIOTECNOLOGÍA

TEMA: ESTUDIO DE LA DIVERSIDAD GENÉTICA DE

POBLACIONES DE GUAYACÁN SABANERO (Tabebuia

billbergii) DE BOSQUES SECOS DEL ECUADOR

AUTOR: RUEDA CÓRDOVA, ANA ELIZABETH

DIRECTORA: M.Sc. JADÁN, MÓNICA

CODIRECTOR: ING. TAIPE, MARCO

SANGOLQUÍ, JULIO 2015

i

CERTIFICACIÓN

M.Sc. Mónica Jadán Ing. Marco Taipe

Certifican:

Que el trabajo titulado “Estudio de la Diversidad Genética de Poblaciones de

Guayacán Sabanero (Tabebuia Billbergii) de Bosques Secos del Ecuador”,

realizado por Ana Elizabeth Rueda Córdova, ha sido guiado y revisado

periódicamente y cumple normas estatutarias establecidas en el Reglamento de

Estudiantes de la Universidad de las Fuerzas Armadas- ESPE.

Sangolquí, julio 2015

___________________

M.Sc. Mónica Jadán

__________________

Ing. Marco Taipe

DIRECTORA CODIRECTOR

ii

DECLARACIÓN DE RESPONSABILIDAD

Yo, ANA ELIZABETH RUEDA CÓRDOVA

Declaro que:

El proyecto de grado denominado “Estudio de la Diversidad Genética de

Poblaciones de Guayacán Sabanero (Tabebuia Billbergii) de Bosques Secos del

Ecuador”, ha sido desarrollado con base a una investigación exhaustiva, respetando

derechos intelectuales de terceros, conforme las citas que constan al pie de las

páginas correspondientes, cuyas fuentes se incorporan en la bibliografía.

Consecuentemente este trabajo es de mi autoría.

En virtud de esta declaración, me responsabilizo del contenido, veracidad y alcance

científico del proyecto de grado en mención.

Sangolquí, julio 2015

___________________________

Ana Elizabeth Rueda Córdova

iii

AUTORIZACIÓN

Yo, ANA ELIZABETH RUEDA CÓRDOVA

Autorizo que:

El proyecto de grado denominado “Estudio de la Diversidad Genética de

Poblaciones de Guayacán Sabanero (Tabebuia Billbergii) de Bosques Secos del

Ecuador”; sea publicado en la biblioteca virtual de la Universidad de las Fuerzas

Armadas – ESPE, cuyo contenido, ideas y criterios son de mi exclusiva

responsabilidad y autoría.

Sangolquí, julio 2015

_____________________________

Ana Elizabeth Rueda Córdova

iv

DEDICATORIA

A Dios, quien supo guiar mi camino,

A mi abuelito, por su sabiduría y su motivación,

A mis padres por ser el pilar de cada uno de mis pasos,

A mis hermanos, por su afecto, confianza y compresión.

Anita Elizabeth Rueda Córdova

v

AGRADECIMIENTO

El presente trabajo de tesis primeramente me gustaría agradecerte a ti Dios por

bendecirme en cada paso que doy, cuidándome y dándome fortaleza para continuar y

llegar hasta donde he llegado, porque hiciste realidad este sueño anhelado.

A mis padres, Jorge y Rita, pilares fundamentales en mi vida que con su apoyo, amor

y confianza me inspiraron a ser mejor cada día, porque son un ejemplo de vida,

admiración y respeto. A mis hermanos Kleber, Jorge y Christopher por su cariño y

apoyo que me brindaron en todo momento. A mis sobrinos que se han encargado de

llenar mi vida de ternura y alegría.

Expreso mis sinceros agradecimientos al Departamento Nacional de Biotecnología

del Instituto Nacional Autónomo de investigaciones Agropecuarias INIAP, en

especial al Dr. Eduardo Morillo, jefe del Departamento, por haber confiado en mí y

haberme otorgado esta magnífica oportunidad; además de su guía y colaboración en

el presente proyecto.

A la Secretaría Nacional de Educación Superior, Ciencia, Tecnología e Innovación –

SENESCYT, la cual financió el proyecto PIC-12-INIAP-001: “Desarrollo e

innovación biotecnológica para la potencia de rubros agrícolas de importancia en

seguridad alimentaria, competitividad exportable y adaptación al cambio climático”.

A los colaboradores del Departamento Nacional de Biotecnología del INIAP, a la

Ing. Johanna Buitrón por ser mi guía en el trabajo de laboratorio, a la Lic. Katherine

Orbe y al Ing. Santiago Meneses por su colaboración en mi tesis.

A mi querida Escuela Politécnica del Ejército, a la Carrera de Ingeniería en

Biotecnología y a mis profesores, por los conocimientos impartidos durante el

transcurso de la carrera, en especial a mi estimada Directora de tesis M.Sc. Mónica

Jadán por toda su ayuda y apoyo, a mi Codirector de tesis Ing. Marco Taipe gracias

por su guía y su apoyo en esta investigación.

vi

A mis compañeros del laboratorio de Biotecnología del INIAP, gracias por su

amistad, consejos, apoyo y las risas que hicieron que todo el trabajo sea más fácil.

A mis buenos amigos, Ivonne, Mayrita, Andresito, Morita y Dianita los que siempre

compartieron una sonrisa a mi lado y han sido personas muy importantes en mi paso

por la universidad y en el transcurso de mi vida.

Finalmente quiero agradecer a la persona que estuvo en el transcurso de esta carrera

porque fue un pilar muy importante para su culminación, gracias por apoyarme,

insistirme, por brindarme tu amor, tu apoyo, por ser mi compañía y mi alegría,

Victor.

Anita Elizabeth Rueda Córdova

vii

ÍNDICE DE CONTENIDOS

CERTIFICACIÓN ................................................................................................ i

DECLARACIÓN DE RESPONSABILIDAD ...................................................... ii

AUTORIZACIÓN ................................................................................................ iii

DEDICATORIA ................................................................................................... iv

AGRADECIMIENTOS ........................................................................................ v

ÍNDICE DE CONTENIDOS ................................................................................ vii

ÍNDICE DE TABLAS .......................................................................................... x

ÍNDICE DE FIGURAS ......................................................................................... xii

ÍNDICE DE ANEXOS .......................................................................................... xiv

RESUMEN ............................................................................................................ xv

ABSTRACT .......................................................................................................... xvi

CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN ....................................................................... 1

1.1 Formulación del problema .................................................................... 1

1.2 Justificación del problema ................................................................... 2

1.3 Objetivos de la investigación ............................................................... 3

1.3.1 Objetivo general ................................................................................... 3

1.3.2 Objetivos específicos ............................................................................ 3

1.4 Marco teórico ....................................................................................... 4

1.4.1 El género Tabebuia .............................................................................. 4

1.4.2 Taxonomía ............................................................................................ 5

1.4.3 Descripción Botánica de Tabebuia billbergii ....................................... 6

1.4.4 Distribución geográfica ….................................................................... 7

1.4.5 Importancia de la especie Tabebuia billbergii ..................................... 9

1.4.6 Diversidad genética .............................................................................. 10

1.4.6.1 Cuantificación de la diversidad genética ............................................. 11

1.4.7 Genética de poblaciones ....................................................................... 14

1.4.7.1 Selección natural .................................................................................. 14

1.4.7.2 Deriva genética ………………………................................................. 15

1.4.7.3 Flujo génico .......................................................................................... 15

viii

1.4.7.4 Mutación ............................................................................................... 16

1.4.8 Marcadores moleculares ...................................................................... 16

1.4.8.1 Marcadores ISSRs ............................................................................... 17

1.9 Hipótesis .......................................................................................... 21

CAPÍTULO II: MATERIALES Y METODOS.............................................. 22

2.1 Participantes............................................................................................. 22

2.1.1 Instituciones………………....................................................................... 22

2.1.2 Responsable del proyecto........................................................................... 22

2.1.3 Colaboradores científicos........................................................................... 22

2. 2 Zona de Estudio.......................................................................................... 23

2.2.1 Fase de Campo........................................................................................... 23

2.2.2 Fase de Laboratorio.................................................................................... 23

2.3 Período de tiempo de investigación…………………………………....... 23

2.4 Procedimientos…………………………………………………………... 23

2.4.1 Recolección de material vegetal……………………………………….... 23

2.4.2 Extracción de ADN genómico de guayacán………………..…………... 25

2.4.3 Cuantificación de ADN…………………...……………………………... 25

2.4.4 Validación del ADN de Guayacán Sabanero……………..……………... 26

2.4.5 Determinación de la especie Tabebuia billbergii con

el marcador ISSR 844A ………………………………………………… 28

2.4.6 Pre-selección de marcadores ISSR……………………………………….

29

2.4.8 Amplificación de fragmentos de ADN mediante

primers ISSR………………………………………………….…………. 30

2.4.8 Registro de datos……………………..………………………………….. 31

2.5.6 Análisis de datos………………………………..……………………….. 31

2 6.1 Análisis de diversidad genética………………………………………….. 31

2 6.2 Análisis de agrupamiento……………………………….………............. 32

2.6.3 Análisis de componentes principales……………………..……………... 32

2.6.4 Análisis molecular de varianza…………….…………………..………... 32

2.6.5 Distancia genética de Nei…………………………………...………....... 33

ix

CAPÍTULO III: RESULTADOS…………..………………………………….. 34

3.1 Extracción y cuantificación de ADN………….………….…………….... 34

3.2 Validación del ADN de Guayacán Sabanero…………………………….. 35

3.3 Determinación de la especie Tabebuia billbergii con el

marcador ISSR 844A…………………..………………………………… 36

3.4 Pre-selección de marcadores ISSRs……………………………….……... 36

3.5 Optimización de la Técnica de PCR……………………………………... 39

3.5.1 Concentración de MgCl2…………………………………………….…… 39

3.5.2 Temperatura de alineamiento………………………………………......... 40

3.6 Amplificación de ADN de guayacán (T. billbergii) mediante

los primers ISSR seleccionados…………………………………….……. 41

3.7 Análisis de datos………………………..……………………..…………. 43

3.7.1 Diversidad genética…………...…………………………………………. 43

3.7.2 Análisis de agrupamiento……………………….………………………... 48

3.7.3 Análisis de coordenadas principales………………………………….….. 50

3.7.4 Análisis molecular de varianza…………………………………………... 54

3.7.5 Distancia Genética de Nei………………………………………………... 57

CAPÍTULO IV: DISCUSIÓN………….……………………….………………. 58

4.1 Extraccion y calidad del ADN genómico……..…..…………………... 58

4.2 Amplificación de fragmentos de ADN mediante primers

ISSRs………................................................................................... 59

4.3 Análisis de diversidad genética…………………………..……………. 60

4.4 Análisis de agrupamiento………...……...…………..………………… 62

4.5 Análisis de coordenadas principales…………………..………………. 63

4.6 Análisis molecular de varianza………………………………………… 64

CAPITULO V: CONCLUSIONES…………………………………………….. 65

CAPÍTULO VI: RECOMENDACIONES……………………………………… 67

CAPÍTULO VII: BIBLIOGRAFÍA ……………………………………………. 68

ANEXOS ………………………………………...……………………………… 81

x

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1.1: Clasificación taxonómica de la especie Tabebuia billbergii……...

5

Tabla 1.2: Comparación de las características principales de las técnicas

moleculares para identificar diversidad genética (Spooner et al.,

2005)……………………………………………………………... 20

Tabla 2.1: Concentraciones y volúmenes de reacción para ensamblaje de la

PCR, validación con primer SSR TAU-15 (Morrillo & Miño,

2011)……………………...........................................................

27

Tabla 2.2: Temperaturas empleadas para la amplificación de SSR TAU-

15……………………………………………………………….…

27

Tabla 2.3: Concentraciones y volúmenes de reacción para ensamblaje de la

PCR, validación con primer ISSRs (Morrillo & Miño,

2011)……………….................................................................

28

Tabla 2.4: Temperaturas empleadas para la amplificación de

ISSR………………………………………………………………

29

Tabla 2.5: Lista de marcadores ISSR seleccionados para el

estudio………………............................................................

30

Tabla 3.1: Volúmenes de reactivos para una reacción de PCR, variando la

concentración de MgCl2…………………………………………..

39

Tabla 3.2: Alelos registrados con sus respectivas frecuencias en 5

poblaciones de guayacán con 10 primer ISSRs………………...

44

Tabla 3.3: Análisis de diversidad genética en 5 poblaciones de Tabebuia

billbergii provenientes de las localidades de las provincias de

Loja, Guayas y El Oro de los bosques secos del

Ecuador……………………………………….…..........................

46

Tabla 3.4: Análisis de diversidad genética de la población de guayacán

(Tabebuia billbergii) con 10 primer ISSRs………………............

47

Tabla 3.5: Valores Eigen, porcentaje individual y acumulativo de la

varianza por coordenada principal del ACoP de 214 genotipos de

guayacán con 10 primers ISSRs……………………………….....

51

Tabla 3.6: Análisis molecular de varianza de de 5 poblaciones de guayacán:

Mangahurco, Isla Puná, Cazaderos, Garza Real y La Cuca,

analizadas con 10 primers ISSR………………………………..... 54

xi

Tabla 3.7: Análisis molecular de varianza de poblaciones más alejadas

según el ACoP como lo son: Isla Puná, Garza Real y La Cuca

analizadas con 10 primers ISSR…………....................................

56

Tabla 3.8. Análisis molecular de varianza de poblaciones más cercanas

según el ACoP como lo son: Mangahurco, Isla Puná y Cazaderos

analizadas con 10 primers ISSR…..............................................

57

Tabla 3.9: Distancia de Nei (1978) calculadas en 214 genotipos de

guayacán analizados con 10 primers ISSRs……………………... 57

xii

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1.1: Fotografía de características de algunas especies del género

Tabebuia………………………………………………….…….

4

Figura 1.2: Características morfológicas de Tabebuia billbergii. a) Flores,

b) Hojas, c) fruto (Gentry, 1992)…………..………………........

7

Figura 1.3: Distribución de especies del género Tabebuia en

Sudamérica: = T. alba, = T. aurea, = T. barbata, = T.

billbergii ssp. billbergii, = T. billbergii ssp. Ampla (Gentry,

1992)….................................................................................

9

Figura 1.4: Foto de la especie Tabebuia billbergii tomada en el bosque seco

de Zapotillo en la Provincia de Loja……………………….……

10

Figura 1.5: Representación del alineamiento de los iniciadores ISSR no

anclados con respecto a un ADN molde. Los primers ISSR

anclados se muestran en color azul y rojo (De Vicente &

Fulton, 2003)…………………………………………………...

18

Figura 1.6: Representacion del alineamiento de iniciadores ISSR anclados

con respecto a un ADN molde. Los primers ISSR anclados se

muestran en color azul y rojo (De Vicente & Fulton,

2003)…………...…….…………………………………...……..

19

Figura 2.1: Mapa del Ecuador donde se muestran los puntos de recolección

de las muestras de guayacán (T. billbergii), realizado en DIVA-

GIS………....................................................................................

24

Figura 3.1: Electroforesis en gel de agarosa al 1% del ensayo de

extracciones de ADN con cuatro protocolos usando el marcador

de peso Low Mass Ladder……………………………………....

34

Figura 3.2: Electroforesis horizontal en gel de agarosa al 1.5 % de ADN

genómico de guayacán utilizando el marcador de peso

molecular Low Mass ladder……………………..………...……

35

Figura 3.3: Validación de los ADNs de guayacán (Carril M: marcador de

peso molecular Low Mass Ladder)……………………….……

35

Figura 3.4: Amplificación del ADN genómico de guayacán con el

marcador molecular ISSR 844A en gel de agarosa al 2%. En

donde se diferencia la especie T. billbergii de T. chrysantha

mediante el patrón de banda…………..……………………… 36

xiii

Figura 3.5:

Amplificación de ADN de guayacán con 10 primers ISSRs

siendo estos: a) 17899A y 17899B b) ISSR840 y ISSR841 c)

ISSR853 y ISSR857 d) HB12 y HB14 e) ISSR824 f)

ISSR900……….………………..………....................................

37

Figura 3.6: Amplificación de los primers ISSRs 853, 857 utilizando la

concentración de MgCl2 de 1.5mM……………………………

40

Figura 3.7: Amplificación de ADN de guayacán con el ISSR 840

utilizando diferentes temperaturas de alineamiento……….…....

40

Figura 3.8: Electroforesis en gel de agarosa al 1.5% de productos

amplificados con los primers: a) 841 b) 7899A………………

41

Figura 3.9: Análisis comparativo de los índices de diversidad genética de

las cinco poblaciones de guayacán (Tabebuia billbergii)………

46

Figura 3.10: Dendograma para los 214 genotipos de guayacán con el

coeficiente de similitud Jaccard, realizado en el programa

NTSYS.pc versión 2.02…………………………………………

49

Figura 3.11: Distribución en dos dimensiones de los 214 individuos de

Tabebuia billbergii mediante el análisis de coordenadas

principales (ACoP) en el programa NTSYS pc. 2.02 basado en

el coeficiente de similaridad de Jaccard…………………..….....

50

Figura 3.12: Distribución en dos dimensiones de las 5 poblaciones de

Tabebuia billbergii: a) genotipos de Mangahurco, b) genotipos

de la Isla Puná, c) genotipos de Cazaderos, d) genotipos de La

Cuca e) genotipos de Garza Real, mediante el análisis de

coordenadas principales (ACoP) en el programa

MULTBIPLOT basado en el coeficientes de similaridad de

Jaccard………………………………………………………….

52

Figura 3.13: Porcentaje de varianza molecular de 5 poblaciones de

guayacán: Mangahurco, Isla Puná, Cazaderos, Garza Real y La

Cuca, analizadas con 10 primers ISSR……….…………………

54

Figura 3.14: Porcentaje de varianza molecular de 3 poblaciones alejadas de

guayacán: Isla Puná, Garza Real y La Cuca, analizadas con 10

primers ISSR……………………………………………………

55

Figura 3.15: Porcentaje de varianza molecular de 3 poblaciones cercanas de

guayacán: Mangahurco, Isla Puná y Cazaderos, analizadas con

10 primers ISSR…………………………..……………………. 56

xiv

ÍNDICE ANEXOS

Anexo 1 : Datos del material vegetal de T. billbergii spp que corresponde a

las colectas realizadas en localidades de las provincias de Loja

(Mangahurco. Zapotillo. Cazaderos). Guayas (Isla Puná) y El Oro

(Arenillas)…………………………………………………………

81

Anexo 2: Tampón de extracción Sorbitol del protocolo de extracción de

ADN de Mariac et al. (1999) modificado por Morillo (2002)……..

87

Anexo 3: Tampón de lisis (CTAB 4%) del protocolo de extracción de ADN

de Mariac et al. (1999) modificado por Morillo (2002)………….

88

Anexo 4: Lista de los Primers ISSRs con los que se realizaron pruebas para

el estudio …………………………………………………………..

89

Anexo 5: a) Protocolo de extracción de ADN de Ferreira y Grattapaglia

(1998)…………………………………………………………... 90

Anexo 5:

b) Protocolo de extracción de ADN de Graham (1993)…………... 91

Anexo 5:

c) Protocolo de extracción de ADN de Álzate Marín (2001)……..

92

Anexo 6: Amplificación de 214 genotipos de guayacán con 10 primers ISSR

seleccionados para el estudio, mediante electroforesis horizontal

en geles de agarosa al 1.5%.......................................................

93

Anexo 7: Matriz binaria de los 214 genotipos de guayacán (Tabebuia

billbergii)………………………………………………………….. 99

xv

RESUMEN

Los bosques secos del Ecuador se caracterizan por la presencia de los guayacanes

sabaneros en especial de la especie endémica Tabebuia billbergii, conocida como

guayacán parquetero o “madero negro”, la cual es considerada de gran

importancia en el ámbito forestal, ambiental e incluso actualmente turístico. En el

país no existen estudios de caracterización molecular que sirvan para aclarar las

interrogantes sobre la variabilidad genética del guayacán. Por ende, en esta

investigación se emplearon 10 marcadores moleculares (ISSR) para el estudio de

la diversidad genética de 214 muestras de Tabebuia billbergii recolectadas en las

provincias de El Oro, Guayas y Loja. En el análisis molecular se detectaron 49

alelos con un promedio de 4.9 alelos/loci, en un rango desde 430 pb hasta 2105

pb. Se determinó el contenido de información polimórfica (PIC) y la

heterocigosidad esperada en la población obteniendo un valor promedio de 0.46 y

0.50 respectivamente. Además, la población de Mangahurco (Loja) presentó el

mayor porcentaje de polimorfismo o diversidad alélica con el 100 %, mientras que

la población La Cuca (El Oro) presentó el menor porcentaje de polimorfismo que

fue de 61.22%. También se determinó mediante el análisis de agrupamiento

UPGMA y el análisis de coordenadas principales (ACoP), que los individuos se

distribuyeron indistintamente y no de acuerdo a su distribución geográfica, sino

por características genotípicas que presentó la especie T. billbergii. Al utilizar el

análisis molecular de varianza, se determinó que la diversidad genética se

distribuye en mayor proporción dentro de cada población obteniendo el (89%, Φst

= 0.112).

PALABRAS CLAVES:

DIVERSIDAD GENÉTICA

TABEBUIA BILLBERGII

GUAYACÁN

ISSR

xvi

SUMMARY

The dry forests of Ecuador are characterized by the presence of sabaneros

guayacanes especially the endemic species Tabebuia billbergii, known as

parquetero guayacán or "black tree", which is considered of great importance

in forestry area, environmental and even today tourism. In the country there are

no molecular characterization studies that serve to clarify questions about the

genetic variability of guayacán. Therefore, in this investigation 10 molecular

markers (ISSR) were used to study the genetic diversity of 214 samples of

Tabebuia billbergii collected in the provinces of El Oro, Guayas and Loja. In

molecular analysis were detected 49 alleles averaging 4.9 alleles / loci, ranging

from 430 bp to 2105 bp. Polymorphic information content (PIC) and expected

heterozygosity in the population was determined by obtaining an average value

of 0.46 and 0.50 respectively. In addition, the population of Mangahurco (Loja)

had the highest percentage of polymorphism or allelic diversity with 100%,

while the population La Cuca (El Oro) had the lowest percentage of

polymorphism was 61.22%. It was also determined by cluster analysis

(UPGMA) and principal coordinate analysis (ACoP), individuals were

distributed equally and not according to their geographical distribution, but by

genotypic characteristics that submitted the species T. billbergii. By using the

molecular analysis of variance, it was determined that genetic diversity is

distributed in greater proportion within each population getting the (89%, Φst =

0.112).

KEYWORDS:

GENETIC DIVERSITY

TABEBUIA BILLBERGII

GUAYACAN

ISSR

1

CAPÍTULO I

INTRODUCCIÓN

1.1 Formulación del problema

Los bosques secos del sur del Ecuador y norte del Perú, constituyen

“El Centro de Endemismo Tumbesino”, que es considerado una de las

regiones más importantes del planeta por su riqueza biológica endémica y

biodiversidad, está ubicado en las provincias de El Oro y Loja a una altura

comprendida entre 0 a 700 m.s.n.m (Sierra et al., 1999) citado por (Espinosa,

2012). Estos bosques secos representan aproximadamente el 50 % de lo que

queda de este ecosistema y que constituye no más del 25 % de bosque seco

original, este ecosistema constituye según Sierra et al. (1999) la primera

prioridad de conservación del Ecuador continental.

Los bosques secos deciduos del Ecuador, han soportado durante los

últimos 70 años, grandes presiones antrópicas, se ha registrado la pérdida de

diversidad biológica arbórea ocasionada por los efectos del cambio climático

combinados con el inadecuado uso de tierras (expansión de la frontera

agrícola y ganadera) y la deforestación selectiva de especies comerciales;

Estos problemas se reflejan en el guayacán de sabana (T. billbergii spp) ),

esta especie de gran importancia en el cultivo forestal, contribuye una

importante protección de cuencas hidrográficas, además, permite la

estabilización del clima, la conservación de la biodiversidad, mejora las

condiciones y los nutrientes del suelo, ayuda a la fijación de carbono, mejora

la calidad del aire y brinda albergue a la vida silvestre (Aguirre et al., 2001;

Aguirre et al., 2005; Espinosa et al., 2012). También, se ha evidenciado que

el cambio climático puede producir alteraciones en la distribución biológica,

aumento de las tasas de extinción de especies, variaciones en los tiempos de

reproducción y en la duración de las estaciones de crecimiento de las plantas

(FAO, 2010).

2

El guayacán es una de las especies más representativas de los bosques

secos deciduos del Ecuador. Dos especies conocidas como guayacanes de

sabana o sabaneros estan presentes siendo estos Tabebuia billbergii y

Tabebuia chrysantha, en el caso de T. billbergii, especie endémica y conocida

como guayacán parquetero o “madero negro”, se han descrito las subespecies

T. billbergii–billbergii y T. billbergii-ampla, describiendo a esta última como

una mezcla de T. chrysantha spp y T. billbergii spp (Gentry, 1992).

Monitoreos de la diversidad genética en especies representativas de este

ecosistema son de importancia para determinar el estado de las poblaciones y

definir estrategias apropiadas de regeneración, uso sostenible y conservación.

En el caso de las especies de guayacán sabanero, no existen reportes a la

fecha de estudios de diversidad genética que se hayan publicado.

1.2 Justificación del problema

Los bosques secos del Ecuador se caracterizan por la presencia de los

guayacanes sabaneros T. billbergii y T. chrysantha, los cuales son

considerados de gran importancia en el ámbito forestal, ambiental e incluso

actualmente turístico. Por su potencial económico el guayacán parquetero, T.

billbergii, debería ser utilizado en programas de reforestación y restauración

de hábitats degradados como una estrategia de mitigación a los efectos

ocasionados por el cambio climático y la deforestación. A pesar de su

importancia estudios de diversidad genética en especies endémicas y

representativas de estos bosques secos, como T. billbergii aún no se han

realizado en el país.

Los estudios de diversidad biológica y genética en bosques, permiten

entender el funcionamiento y la conformación de los hábitats, esta

información se utiliza con el propósito de desarrollar acciones de

conservación de especies representativas, además, el uso de herramientas

tales, como los marcadores moleculares, han sido clave para realizar estudios

de diversidad genética permitiendo determinar la estructura genética de

poblaciones existentes, el flujo de genes y el nivel de variabilidad que puede

3

ser utilizado como acervo genético para la implementación de estrategias de

regeneración, uso sostenible y conservación adecuados.

El Departamento Nacional de Biotecnología del Instituto Nacional

Autónomo de Investigaciones Agropecuarias (INIAP), desarrolla el proyecto

“Desarrollo e innovación biotecnológica para la potenciación de rubros

agrícolas de importancia en seguridad alimentaria, competitividad exportable

y adaptación al cambio climático” financiado por la SENESCYT; este

proyecto entre sus objetivos, aplica biotecnologías en especies forestales

prioritarias para uso y conservación con el fin de generar conocimiento y

aportar al desarrollo de capacidades institucionales en recursos genéticos

forestales, para lo cual se seleccionaron seis especies forestales de

importancia en los bosques Ecuatorianos, entre ellas el guayacán sabanero.

1.3 Objetivos de la investigación

1.3.1 Objetivo general

Estudiar la diversidad genética de poblaciones de guayacán sabanero

(Tabebuia billbergii) en bosques secos del Ecuador a través del uso de

marcadores moleculares

1.3.2 Objetivos específicos

1) Realizar una prospección en los bosques secos del Ecuador para

establecer poblaciones de T. billbergii.

2) Monitorear la diversidad genética en cinco poblaciones de T. billbergii

a través de la caracterización molecular con marcadores ISSR en 214

árboles georeferenciados.

3) Determinar la diversidad genética entre las poblaciones en estudio y

asociar la variabilidad con su distribución geográfica.

4

1.4 Marco Teórico

1.4.1 El género Tabebuia

Tabebuia es el género más diverso de la familia Bignoniaceae

(Gentry, 1992); más del 75% de sus especies florecen una vez al año y

pierden las hojas durante la estación seca (Aguirre et at., 2006). Este género

está constituido por aproximadamente 100 especies; Su distribución abarca

regiones del trópico y subtrópico americano desde el norte de México hasta el

norte de Argentina (Gentry, 1992). En el Ecuador este género está

representado por 8 especies: T. billbergii, T. chrysantha, T. donnell-smithii, T.

incana, T. ochracea, T. palustris Hemsl, T. rosea y T. serratifolia (Jorgensen

& León-Yánez, 1999). Este género presenta: flores de color amarillo, blanco,

rosado y rojo, poseen hojas palmeadas de 3-7 foliolos, algunas presentan

pubescencia en hojas y cáliz y su madera es muy dura y pesada (figura 1.1)

(Grose & Olmstead, 2007).

Figura 1.1: Fotografía de características morfológicas de algunas especies

del género Tabebuia. (Bolfor et al., 2000).

5

1.4.2 Taxonomía

El género Tabebuia está ubicado dentro de la tribu Tecomae,

perteneciente a la familia Bignoniaceae. Esta familia está incluida en el orden

Scrophulariales, que pertenece a la subclase Asteridae (Gentry, 1992a). En

estudios taxonómicos realizados por Gentry (1992), se reportó que este género

en un inicio estaba constituido por 100 especies, de las cuales luego fueron 67

y un híbrido, dos fueron transferidas al género Roseodendron y 30 al género

Handroanthus, este último distribuido por Centro y Sudamérica (Grose &

Olmstead, 2007).

Estudios filogenéticos moleculares realizados por Grose & Olmstead

(2007), determinaron que el género Tabebuia forma parte de un grupo

parafilético, es decir, presentan a un antepasado en común con grupos

hermanos como Handroanthus y Roseodendron; razón por la cual a estos tres

géneros se les conoce como Alianza Tabebuia.

En el Ecuador el género Tabebuia está representado por 8 especies

siendo estas: T. chrysantha, T. donnell-smithii, T. incana, T. ochracea, T.

palustris Hemsl., T. rosea, T. serratifolia y T. billbergii (tabla 1.1) (Jorgensen

& León, 1999).

Tabla 1.1: Clasificación taxonómica de la especie Tabebuia billbergii.

TAXONOMÍA

Nombre Científico Tabebuia billbergii

Reino Plantae

Phylum Magnoliophyta

Clase Magnoliopsida

Orden Lamiales

Familia Bignoniaceae

Género Tabebuia

Especie billbergii

Nombre Común Madero negro

Sinónimo Guayacán

Fuente: (INRENA, 2002).

6

1.4.3 Descripción Botánica de Tabebuia billbergii

Los árboles de Tabebuia billbergii se encuentran en los bosques

semideciduos y secos, tienen una altura entre 12 a 14 metros, su copa se

caracteriza por ser redondeada y densa.

También presenta un tronco fuerte, compacto, recto, cilíndrico y de

aproximadamente 60 a 90 cm de diámetro a la altura del pecho (DAP), de

color pardo oscuro marcadamente fisurada.

Presenta hojas compuestas, opuestas, palmadas de 3 a 5 foliolos,

ovados angostos que miden hasta 10 cm de longitud y 5 cm de ancho, sus

hojas son de color verde claro y tienen peciolos delgados de 4 a 6 cm, el

folíolo terminal es más grande que los laterales y presenta un ápice agudo

acuminado.

Sus flores son amarillas con racimos florales terminales, cortos y no

ramificados, parecidas a umbelas con varias flores en pedúnculos cortos

dispuestas en una inflorescencia de racimo de 6 a 8 flores, además la flor está

compuesta del cáliz tubular de 1 cm con lóbulos irregulares en el ápice,

corola tubular amarillo limón.

El fruto es una cápsula linear oblonga de 17 a 25 cm de longitud por 8

a 10 mm de ancho; con pelos diminutos dispersos café oscuro cuando se

secan. Sus semillas son delgadas y tienen alas transparentes membranosas

(Aguirre, 2012) (figura 1.2).

7

Figura 1.2: Características morfológicas de Tabebuia billbergii. a) Flores,

b) Hojas, c) fruto (Gentry, 1992).

8

1.4.4 Distribución geográfica

Tabebuia es un género de plantas compuesto por un gran número de

especies estrictamente leñosas. Su distribución geográfica abarca grandes

regiones del trópico y subtrópico americano, en el ámbito regional una parte

de este género está presente en algunos países de América del Sur que son

muy conocidos por la calidad de la madera que se extrae de un grupo selecto

de sus especies, las cuales están consideradas entre las más pesadas y

durables de la Amazonía (Gentry, 1992b).

El límite meridional de su distribución se encuentra proximadamente

en 30 ºN en México y se extiende a través de toda centroamérica hasta el

norte del Uruguay y Argentina aproximadamente a los 35 ºS, lo que

constituye el extremo meridional de su distribución (Gentry, 1992b).

En el Ecuador específicamente en las provincias de Loja

(Mangahurco, Zapotillo, Cazaderos), Guayas (Isla Puná) y El Oro (Arenillas)

se encuentra Tabebuia billbergii, especie endémica presente en los bosques

secos tropicales en altitudes de 0 a 700 m.s.n.m (figura 1.3) (Sierra et

al.1999).

9

Figura 1.3: Distribución de especies del género Tabebuia en

Sudamérica: = T. alba, = T. aurea, = T. barbata, = T. billbergii

ssp. billbergii, = T. billbergii ssp. Ampla (Gentry, 1992).

1.4.5 Importancia de la especie Tabebuia billbergii

Tabebuia billbergii spp., es una especie representativa dentro de este

género, reconocida por su madera dura, resistente al ataque de termitas y al

agua salada; por esta razón es de gran interés comercial, comúnmente

utilizada en: ebanistería, artesanías finas, construcciones de puentes,

construcciones marinas, parquet, puertas y ventanas (Valverde, 1998). Es un

árbol melífero, el extracto de su corteza posee propiedades curativas utilizado

en tratamientos terapéuticos para el paludismo, tuberculosis, sífilis y

10

reumatismo (García, 1991); además es de interés en arboricultura urbana de

fincas y paisajes (figura 1.4) (Valverde, 1998).

Además, está especie es de gran interés ambiental, ya que contribuye a

una importante protección de cuencas hidrográficas, ayuda a la estabilización

del clima, favorece a la conservación de la biodiversidad, mejora las

condiciones y los nutrientes del suelo, ayuda a la fijación de carbono, mejora

la calidad del aire y brinda albergue a la vida silvestre (Aguirre et al., 2001;

Aguirre et al., 2005; Espinosa et al., 2012).

Figura 1.4: Foto de la especie Tabebuia billbergii tomada en el bosque

seco de Mangahurco en la Provincia de Loja.

1.4.6 Diversidad genética

La diversidad genética o variabilidad genética es el componente más

esencial de la biodiversidad, que da a conocer las variaciones de los genes

dentro de cada especie, ya que representa la variación heredable dentro y

entre poblaciones de organismos, esta variación se manifiesta en las

11

modificaciones ocurridas en la secuencia de nucleótidos del ADN, como

resultado de la migración, mutación, deriva génica, selección y la

combinación de estos eventos (Spooner et al., 2005).

La variabilidad genética ha avanzado progresivamente desde los

estudios de polimorfismo cromosómico (variación en el número y forma), los

análisis fisiológicos, los estudios bioquímicos isoenzimáticos, hasta el análisis

a escala molecular que incluye el secuenciamiento del ADN, logrando

detectar la variación a nivel nucleotídico (Nuez et al., 2000).

El estudio de la diversidad genética ha facilitado el conocimiento

básico para entender la evolución de las especies arbóreas forestales, la cual

ha permitido la adaptación de las especies a condiciones ambientales adversas

y variables durante miles de años, dando como resultado un conjunto de

recursos genéticos de árboles insustituibles, se estima que existe un número

alrededor de 100.000 especies arbóreas, de las cuales menos de 500 se han

estudiado detalladamente (FAO, 2005).

1.4.6.1 Cuantificación de la diversidad genética

El estudio de la diversidad genética dentro y entre poblaciones es

generalmente abordado a través de dos parámetros, una de ellas se basa en el

empleo de matrices de distancia y similitud con la finalidad de caracterizar la

población basados en la afinidad relativa de cada individuo respecto cada uno

de los individuos analizados, mientras que la segunda trata sobre el empleo de

parámetros basados en la determinación de las frecuencias alélicas en un

número de loci polimórficos, para distribuir la variación genética en

componentes de la variación dentro y entre poblaciones (Weising et al.,

2005).

Una de las medidas más frecuentemente usadas de variación genética es la

diversidad genética de Nei (1973) o heterocigosidad (h), la cual tiene en

12

cuenta las frecuencias alélicas que determina la probabilidad de que 2 alelos

elegidos al azar sean diferentes en la muestra. La misma se calcula como:

donde h es la heterocigosidad en un locus cuando se estudia una población de

apareamiento al azar, o la diversidad de un gen en un locus cuando los

apareamientos no son aleatorios en el grupo de estudio; h es la sumatoria de

i=1 a k, pi es la frecuencia del alelo y k es el número de alelos. La

diversidad genética h es luego promediada sobre el total de loci y a menudo

se denota como H.

Para obtener una visión más general de la diversidad en un grupo, la

heterocigosidad o diversidad genética se calcula para cada locus. La

estimación normalizada de esta medida es la Heterocigosidad esperada

imparcial o normalizada (UHe) (Nei, 1978):

Donde UHe es la heterocigosidad o diversidad genética para un solo locus, xi

es la frecuencia del alelo (o marcador) y n es el número de individuos.

El promedio de todos los loci (o marcadores) representará el promedio de la

heterocigosidad (H) o el promedio de la diversidad genética en el grupo,

calculada como:

Donde r es el número total de loci. En una población ideal y apareada

aleatoreamente, H es idéntica a la heterocigosidad esperada He.

13

La diversidad genética de Nei o también llamada contenido de información

polimórfica (PIC) puede calcularse para datos dominantes bialélicos como:

Aquí p es la frecuencia de los alelos visibles y q es la frecuencia de los alelos

nulos para el marcador i. En este caso, para los datos binarios diploides se

asume el equilibrio de Hardy-Weinberg:

q = (1-frecuencia de la banda)1/2 y p = 1- q

El contenido de información polimórfica provee una estimación del poder

discriminatorio de un locus teniendo en cuenta, no sólo el número de alelos

que son expresados, sino también las frecuencias relativas de los mismos

(Smith et al., 1997); para datos dominantes tiene un máximo de 0,5 cuando la

frecuencia toma el valor p= 0,5 (De Riek et al., 2001).

Según Botstein et al., (1980), menciona que el valor PIC va desde 0 (Perfil

monomórficos) a 1 (perfil altamente polimórfico) por lo que, marcadores con

valores PIC superior a 0,5 se consideran muy informativos, mientras que los

valores entre 0,25 y 0,50 indican una nivel informativo moderado y los

valores menores de 0,25 se consideran poco informativos.

Otra medida de diversidad, la cual se utiliza a menudo para datos dominantes,

es el Índice de Shannon (H’). Éste generalmente se calcula como:

donde pi es la frecuencia del alelo en la población, grupo de individuos o

especies, y ambos alelos (presencia y ausencia) de cada locus debe ser

tomado en cuenta.

14

Alternativamente, el logaritmo natural es usado en lugar del log2. La fórmula

quedaría de la siguiente manera:

1.4.7 Genética de Poblaciones

La genética de poblaciones estudia la distribución de los genes en las

poblaciones y la manera en que la frecuencia de genes y genotipos se

mantienen o cambian de una generación a otra, considerando los cambios

que se presentan a través del tiempo y el espacio (Gardner et al., 2003;

Griffiths et al., 2005). Dichos cambios pueden ser observados dentro y entre

poblaciones por el fenotipo, se dice que un gen o un rasgo fenotípico es

polimórfico cuando existe más de una forma del gen o más de un rasgo

fenotípico para un carácter dentro de una población (Griffiths et al., 2005).

En la genética de poblaciones la presencia de variabilidad genética es

requerida no solo para el mejoramiento genético o conservación de especies,

ya que el rol fundamental de la variabilidad genética es ser la materia prima

para los procesos evolutivos, sin variabilidad no hay evolución (Buckler &

Thornsberry, 2002).

Las poblaciones, están sujetas a cambios evolutivos que varían las

frecuencias alélicas o génicas, a su vez están influenciadas por la selección

natural y la deriva génica que actúan disminuyendo la variabilidad genética

de las poblaciones, en cambió sucesos como la migración y mutación actúan

aumentando la variabilidad genética (Griffiths et al., 2005).

1.4.7.1 Selección natural

La selección natural ha sido un medio importante para la evolución,

ya que actúa en las poblaciones que presentan una mejor adaptación al

15

ambiente ya sea en el fenotipo o genotipo, originando que los individuos más

aptos tengan mayor probabilidad de sobrevivir y reproducirse (Campbell et

al., 2005).

La selección natural también explica la diversidad entre organismos

ya que promueve su adaptación a diferentes modos de vida, según Charles

Darwin mostró que “los portadores de variantes hereditarias que permitan a

los mismos adaptarse al medio son más probables que sobrevivan y originen

más progenie que organismos que carecen de dichas variantes” (Grant, 1991).

Otro factor seria la eficacia biológica o valor adaptativo destacando la

reproducción diferencial que puede deberse a diferentes tasas de fertilidad,

fecundidad y la selección sexual (Haldane, 1927).

1.4.7.2 Deriva genética

La deriva genética explica que la reproducción de organismos origina

cambios aleatorios en las frecuencias alélicas en una población (Gardner et

al., 2003). En la deriva genética existen dos fenómenos conocidos como:

cuello de botella y el efecto fundador; el cuello de botella ocurre cuando el

tamaño de la población disminuye drásticamente debido a la falta de alimento

o por desastres ambientales, mientras que el efecto fundador da a conocer la

generación de una nueva población a partir de un grupo pequeño de

individuos provenientes de una población más grande (Slatkin, 2004;

Mancera, 2007).

1.4.7.3 Flujo génico

El flujo genético o migración es la transferencia de genes de una

población a otra producida por diferentes factores como la movilidad

(Hastings et al., 2009). También ocurre cuando una población al no estar

completamente aislada recibe material genético adicional de otras

poblaciones con frecuencias genéticas diferentes, de esta manera cualquier

16

población puede contribuir a la constitución genética de otras por medio de la

migración (Griffiths et al., 2005).

1.4.7.4 Mutación

La mutación es la principal fuente de variabilidad genética, ya que

altera la secuencia del ADN introduciendo nuevas variantes mediante

procesos de recombinación, otro suceso son las mutaciones puntuales que

insercionan o deleccionan nucleótidos sueltos o pequeñas secuencias; además,

cada especie tiene una tasa de mutación propia que ha sido modulada por la

selección natural para que la especie pueda enfrentarse de un modo más

óptimo a los cambio que le impone su ambiente (Gravel, 2012).

1.4.8 Marcadores moleculares

Históricamente se han usado herramientas moleculares para la

caracterización e identificación de variedades (Rallo et al, 2002). Existen dos

clases de marcadores genéticos, los marcadores morfológicos y los

marcadores moleculares. Los marcadores morfológicos han permitido evaluar

la taxonomía o clasificación de organismos mediante el estudio de

características fenotípicas, estos marcadores son limitados ya que las

características a medir no son infinitas, ya que, se deben medir en cierta etapa

del crecimiento y pueden estar influenciados por el ambiente (Tanksley,

1983). Por otro lado el desarrollo de los marcadores moleculares ha ayudado

a eliminar los inconvenientes de una selección basada en el análisis exclusivo

del fenotipo, como la identificación de especies y variedades de una forma

más rigurosa y repetitiva (ArgenBio, 2007).

Los marcadores moleculares han sido desarrollados para detectar la

transmisión de un segmento de cromosoma de una generación a otra

(Tanksley, 1983). Son utilizados en estudios de variabilidad genética, mapeo

genético, localización y aislamiento de genes de interés, estudios de genética

humana, vegetal, animal y microbiana; En la actualidad existen varias

17

técnicas moleculares que nos permiten conocer cómo se encuentran las

proporciones de genes en las poblaciones naturales de manera indirecta, con

los análisis de proteínas o de manera directa con estudios de ADN, los

diferentes tipos de marcadores se distinguen por su capacidad de detectar

polimorfismos en loci únicos o múltiples y son de tipo dominante o

codominante (Simpson, 1997).

1.4.8.1 Marcadores ISSRs

Las siglas ISSR provienen de (Interspread single sequence repeats),

traducido como secuencias intercaladas entre los microsatélites (Zietkewicz et

al., 1994). Técnica basada en PCR, es de característica semiarbitraria debido

a que se utiliza un solo primer de 14 pb o más, complementario a dos

microsatélites cercanos presentes en el genoma. La amplificación ocurrirá si

hay un adecuado alineamiento de los iniciadores y la distancia entre éstos sea

de 100 a 2500 pb, o más dependiendo de las condiciones PCR (González &

Aguirre, 2007).

Existen dos clases de iniciadores usados con los ISSR. Los primeros

son los conocidos como: no anclados que poseen una secuencia

complementaria al microsatélite pero no posee nucleótidos diferentes a éste.

Además, presentan dos lugares diferentes de alineamiento para un mismo

primer no anclado; es decir, que los iniciadores, dada su complementariedad

total con la secuencia microsatélite, se podrían alinear a lo largo de éste,

pudiendo variar de esta manera la longitud del producto amplificado (figura

1.5), esto está influenciado por las condiciones de temperatura que se le

proporcione a la reacción (De Vicente y Fulton, 2003).

18

Figura 1.5: Representación del alineamiento de los iniciadores ISSR no

anclados con respecto a un ADN molde. Los primers ISSR anclados se

muestran en color rojo y azul (De Vicente & Fulton, 2003).

En la figura 1.6 se muestran los segundos iniciadores conocidos

como: anclados los que tienen uno o varios nucleótidos diferentes (en

posición 3’ o 5’) que facilitan el alineamiento del iniciador en una posición

específica con relación al microsatélite. Existen dos casos que presentan los

iniciadores anclados: en el caso 1 se trata de un primer anclado con un

nucleótido T (en posición 3’) adicional a la secuencia del microsatélite (AG),

ya que para que ocurra la hibridación, debe haber complementariedad entre el

nucleótido N y la Timina 3’ del primer (señalados con un círculo). El caso 2

sucede cuando el primer anclado posee la secuencia adicional en el extremo

5’ en donde se señala con un círculo un grupo de tres nucleótidos (CTG) del

extremo 5’ del cebador que deben ser complementarios a los tres nucleótidos

19

(NNN) para que los primers se logren hibridar al ADN molde (De Vicente &

Fulton, 2003).

Figura 1.6: Representacion del alineamiento de iniciadores ISSR anclados

con respecto a un ADN molde. Los primers ISSR anclados se muestran en

color rojo y azul (De Vicente & Fulton, 2003).

En los ISSRs la presencia de la banda representa el genotipo

dominante (homócigo o heterócigo), mientras que su ausencia representa el

genotipo homócigo recesivo, también la ausencia de una banda puede deberse

a varios factores como: la no existencia de un sitio de unión completo al

primer debido a una mutación, rearreglos estructurales en el cromosoma

durante la meiosis, inserciones o deleciones suficientemente grandes como

para aumentar o disminuir el tamaño de la banda de manera que se identifica

como un locus diferente (González & Aguirre, 2007).

20

Los marcadores ISSR presentan la característica de semiarbitrariedad,

esto es de gran importancia al presentar una mayor reproducibilidad, que

ciertos marcadores como los RAPDs, ya que, la reproducibilidad corresponde

a que son secuencias de nucleótidos más largas que los RAPDs, por lo que la

temperatura de alineamiento es más alta y estable así obteniendo un mayor

número de bandas (Bornet & Branchard, 2001).

La técnica de los ISSR combina la mayoría de los beneficios de los

RAPD, microsatélites (SSR) y los AFLP. La Tabla 1.2 resume las

características principales de estos marcadores.

Tabla 1.2: Comparación de las características principales de las técnicas

moleculares para identificar diversidad genética (Spooner et al., 2005).

MARCADOR

ISSR RAPD SSR AFLP CARACTERÍSTICA

Abundancia genómica Alta Alta Alta Alta

Nivel de polimorfismo Medio/alto Medio Alto Medio

Especifico de locus No No Si No

Codominancia No/Si No Si No/Si

Reproducibilidad Medio/alto Baja Alta Medio/alto

laboriosidad Baja Baja Baja/Media Media

Demanda técnica Baja/Media Baja Baja/Media Medio

Costos operacionales Bajos Bajos Bajos/Medios Medio

Costos de desarrollo Bajo Bajo/Medio Alto Bajo

Cantidad de ADN requerido Baja Baja/Media Baja Baja

Facilidad de automatización Si Si Si Si

Los ISSRs son marcadores dominantes y proveen alta variabilidad,

han sido utilizados en estudios de cultivos de especies desde el año de 1994,

pero hace algunos años se han utilizado en investigaciones de variabilidad

poblacional en especies silvestres por su reproducibilidad, rapidez y costo

(Wolfe, et al., 1998), facilitado la identificación de grupos genéticos,

21

evaluación de diversidad genética en poblaciones, reconstrucción filogenética

e identificación de individuos con origen clonal y sexual (Pradeep, et al,

2002).

1.9 Sistema de hipótesis

No existe diversidad genética en las poblaciones de Tabebuia

billbergii presentes en bosques secos del Ecuador.

22

CAPÍTULO II

MATERIALES Y MÉTODOS

2.1 Participantes

2.1.1 Instituciones

Las instituciones auspiciantes de esta investigación son el INIAP y la

Secretaria de Educación Superior, Ciencia, Tecnología e Innovación

SENESCYT quien financia el proyecto: “Desarrollo e innovación

biotecnológica para la potencia de rubros agrícolas de importancia en

seguridad alimentaria, competitividad exportable y adaptación al cambio

climático” (SENESCYT PIC-12-INIAP-001).

2.1.2 Responsable del proyecto

Ana Elizabeth Rueda Córdova

2.1.3 Colaboradores científicos

PhD. Eduardo Morrillo. Director de tesis y Líder del

Departamento Nacional de

Biotecnología del INIAP

Lic. Katherine Orbe Responsable del Departamento de

Biotecnología de la Estación

Experimental Santa Catalina.

Ing. Johanna Buitrón Técnica del área de biología

molecular

Ing. Santiago Meneses Técnico del área de cultivo de tejidos

vegetales

M.Sc. Mónica Jadán Directora de tesis

Ing. Marco Taipe Codirector de tesis

23

2.2 Zona de Estudio

2.2.1 Fase de Campo

En el presente trabajo se analizaron muestras de ADN de 214 árboles

de guayacán sabanero georeferenciados durante misiones de prospección

realizadas en localidades de las provincias de Loja (Mangahurco, Cazaderos,

Garza Real), Guayas (Isla Puná) y El Oro (Arenillas- La Cuca), recolectadas en

los meses de Febrero, Marzo y Abril del 2014 respectivamente.

2.2.2 Fase de Laboratorio

La parte experimental se realizó en el Laboratorio de Biología Molecular

del Departamento Nacional de Biotecnología en la Estación Experimental Santa

Catalina del INIAP, ubicada en la parroquia Cutuglagua, cantón Mejía, provincia

de Pichincha.

2.3 Período de tiempo de investigación

La investigación se inició en el mes de Abril del año 2014 y finalizó

en el mes de marzo del año 2015.

2.4 Procedimientos

2.4.1 Recolección de material vegetal

El muestreo del material vegetal se realizó en las provincias de Loja,

El Oro y Guayas en los meses de Febrero, Marzo y Abril del 2014 y en

anteriores prospecciones por técnicos del Departamento de Biotecnología del

INIAP, ya que el guayacán sabanero presenta un ciclo fenológico de floración

entre los meses de Diciembre a Enero (Aguirre, 2012). Para realizar el

muestreo se georeferenció el área de prospección dentro del bosque, el tamaño

24

de la prospección por población fue de 4 km2 dentro de la cual se seleccionaron

en algunos casos diez plantas por cada población, ya que no se contaba con

suficiente material vegetal foliar. Para la selección de los árboles se

consideraron las características morfológicas de la especie como la altura,

grosor del tallo, las hojas palmeadas y el florecimiento. En el campo se realizó

una codificación de los individuos, para su posterior identificación, tomando en

cuenta las coordenadas donde se los recolectó (anexo 1). Se recolectaron de 5 a

10 hojas jóvenes, las que se colocaron en fundas herméticas con sílica gel (50g)

debidamente etiquetada. La figura 2.1 muestra los puntos de colecta realizados

en tres provincias.

Figura 2.1: Mapa del Ecuador donde se muestran los puntos de recolección de

las muestras de guayacán (T. billbergii), realizado en DIVA-GIS.

25

2.4.2 Extracción de ADN genómico de guayacán

Para la extracción de ADN se utilizó el protocolo descrito por Mariac

et al. (1999) modificado por Morillo (2002). En microtubos de 1,5 ml con

100 mg de muestra (tejido foliar seco) y 50 mg de metasulfito de sodio se

añadió 1 ml de tampón de extracción Sorbitol (anexo 2) en cada tubo. A

continuación se centrifugaron los tubos a 13000 rpm por 10 minutos luego se

eliminó el sobrenadante y se añadió 700 µl de Tampón de lisis (CTAB 4%)

(anexo 3) y se homogenizó, luego se incubaron los tubos a 65°C por 2 horas,

agitándolos muy cuidadosamente cada 30 minutos. Luego de dejarlos enfriar

se centrifugaron por 10 minutos a 13000 rpm, en un tubo se recuperó el

sobrenadante y se añadió 700 µl de cloroformo-alcohol isoamílico (24:1), se

agitaron y se centrifugaron a 13000 rpm por 10 minutos nuevamente en un

tubo se recuperó el sobrenadante y se añadió 700 µl de cloroformo-alcohol

isoamílico (24:1), prontamente se centrifugó a 13000 rpm por 10 minutos.

Luego se recuperó la fase acuosa en un nuevo tubo y se añadió 700 µl de

etanol al 100%, se invirtió los tubos para mezclar completamente el contenido

el que se distinguió como unos hilitos o una pelotilla (en caso contrario, se

puso las muestras a -20 ºC durante 20 minutos). Luego se centrifugó por 3

minutos a 10000 rpm en donde se recuperó el pellet de ADN después de

haber desechado el sobrenadante. A continuación se realizó dos lavados del

pellet de ADN con 250 µL de etanol 70%. Luego se dejó secar los tubos boca

abajo y se colocó en la micro estufa por media hora o hasta que se haya

eliminado completamente el olor a etanol. Luego se añadió 100 µl de TE y 1

µl de ARNsa. Por último se dio un vórtex y un punto de centrífuga, se colocó

en la microestufa por ½ hora aproximadamente y se conservó el ADN a 4 °C.

2.4.3 Cuantificación de ADN

La cuantificación de ADN permitió determinar características

cualitativas y cuantitativas como la concentración de ADN y la pureza

existente en las muestras de guayacán. La cuantificación de ADN genómico

de guayacán se realizó utilizando el espectrofotómetro para microplacas

26

EPOCH™ de Biotek®, el cual detecta la radiación emitida por las bases

nitrogenadas presentes en el ADN luego de ser excitadas con luz de 260 nm

(Rocha, 2002). En la microplaca se añadió 2μl de cada muestra y se obtuvo

la absorbancia del material vegetal, con referencia a un blanco como el buffer

Tris-EDTA, se obtuvo la pureza y la concentración en unidades de ng/μl

(Biotec Instruments, 2011).

Las muestras de ADN genómico tambien fueron cuantificadas

mediante electroforesis horizontal en geles de agarosa al 1%, en cada pocillo

se cargó 2.5 μl de buffer Blue Juice 5X, 7.5 μl de ADN y se cargó 2 μl del

marcador de peso molecular Low DNA Mass Ladder INVITROGEN®. La

corrida electroforética se fijó en 100 V durante 30 minutos. Posteriormente se

realizó la tinción de los geles en una solución de bromuro de etidio (15 ppm)

por un periodo de tiempo de 45 minutos en agitación continua; los geles se

visualizaron en el fotodocumentador Dolphin View Wealtec (Morillo &

Miño, 2011).

2.4.4 Validación del ADN de Guayacán Sabanero

El ADN genómico obtenido fue validado con el primer Tau 15,

marcador reportado en el estudio realizado en la especie Tabebuia aurea por

Braga et al. (2007). Para la amplificación de las muestras de Tabebuia

billbergii se utilizó el coctel de reacción PCR (tabla 2.1 y tabla 2.2).

27

Tabla 2.1: Concentraciones y volúmenes de reacción para ensamblaje de la

PCR, validación con primer SSR TAU-15 (Morrillo & Miño, 2011).

Reactivos Ci Cf

Volumen para una

reacción (µL)

Agua ---------- -----------

2.18

Buffer PCR 5 X 1 X

1.50

MgCl2 25 mM 2 mM

0.6

dNTP’s 5 mM 0.2 mM

0.38

Primer forward 10 µM 0.5 µM 0.38

Primer reverse 10µM 0.5 µM 0.38

Taq polimerasa 5 U/µL 0.067 U/µL 0.10

Muestra (ADN) 5 ng/µL 1.33 ng/µL 2

Ci= concentración inicial, Cf = concentración final

Tabla 2.2: Temperaturas empleadas para la amplificación de SSR TAU-15

Temperatura Tiempo N° de ciclos

1 94 °C 5 min 1

2 94 °C 45 seg

34 3 56 °C 1 min

4 72 °C 2 min

5 72 °C 7 min 1

6 10 °C 5 min 1

Los productos de PCR se visualizaron mediante electroforesis

horizontal en geles de agarosa al 2%, posteriormente se realizó la tinción de

los mismos en una solución de bromuro de etidio (15 ppm) por un periodo de

tiempo de 30 minutos en agitación continua; los geles se visualizaron en el

fotodocumentador Dolphin View Wealtec (Morillo & Miño, 2011).

28

2.4.5 Determinación de la especie Tabebuia billbergii con el marcador

ISSR 844A

Para verificar que el ADN validado corresponde a T. billbergii, se

realizó una amplificación con el marcador universal ISSR 844A, esto se

efectuó utilizando el coctel de PCR descrito a continuación (tabla 2.3 y tabla

2.4).

Tabla 2.3: Concentraciones y volúmenes de reacción para ensamblaje de la

PCR, validación con primer ISSRs (Morrillo & Miño, 2011).

Mix PCR: Ci Cf Vol. 1 Rx

(µL)

Agua

2.6

Buffer PCR (X) 10 1

1

MgCl2 (mM) 50 3

0.6

dNTP's (mM) 2.5 0.1

0.4

Primer (µM) 10 0.2

0.2

Taq casera (U/ µL) 5 0.1

0.2

Muestra (ng/ µL) 5 2.5

5

Volumen de reacción (µL)

10

ng de ADN por Rx (ng)

25

Ci= concentración inicial, Cf = concentración final

29

Tabla 2.4: Temperaturas empleadas para la amplificación de ISSR

Temperatura Tiempo N° de ciclos

1 92 °C 4 min 1

2 92 °C 30 seg

40 3 37 °C 1 min

4 72 °C 1 min

5 72 °C 10 min 1

6 4 °C 10 min 1

Los productos de PCR se visualizaron mediante electroforesis

horizontal en geles de agarosa al 2% y posteriormente se realizó la tinción de

los mismos en una solución de bromuro de etidio (15 ppm) por un periodo de

tiempo de una hora en agitación continua; los geles se visualizaron en el

fotodocumentador Dolphin View Wealtec (Morillo & Miño, 2011).

2.4.6 Pre-selección de marcadores ISSRs

Para la selección de marcadores que proporcionen una alta

información en términos de amplificación de bandas polimórficas; se realizó

una pre-selección utilizando 48 marcadores ISSR detallados en el (anexo 4)

con 8 muestras representativas de la población de Tabebuia billbergii. De las

amplificaciones realizadas se seleccionaron 10 marcadores los que

presentaron mayor polimorfismo. A continuación se detalla la lista de

marcadores seleccionados (tabla 2.5).

30

Tabla 2.5: Lista de marcadores ISSR seleccionados para el estudio

No. Primer Secuencia (5’-3’) TºA

1 17899A CACACACACACAAG 37 °C

2 17899B CACACACACACAGG 37°C

3 HB12 CACCACCACGC 37°C

4 HB14 CTCCTCCTCGC 37°C

5 824 TCTCTCTCTCTCTCTCG 37°C

6 840 GAGAGAGAGAGAGAG AYT 52°C

7 841 GAGAGAGAGAGAGAGAYC 37°C

8 853 TCTCTCTCTCTCTCTCRT 37°C

9 857 ACACACACACACACACYG 37°C

10 900 ACT TCCCCACAGGTTAACACA 37°C

Y = T C, R = G A

2.4.7 Amplificación de fragmentos de ADN mediante primers ISSR

Para realizar la amplificación con los marcadores moleculares

seleccionados se realizaron pruebas preliminares utilizando el coctel de

reacción PCR descrito por Morrillo y Miño (2011), detallado en la Tabla 3 y

4. Los productos amplificados se analizaron por electroforesis horizontal en

geles de agarosa al 2% en tampón TAE 1X, cada pocillo se cargó con 2.5 μl

de buffer Blue Juice 5X, 7.5 μl de ADN y se cargó 2 μl del marcador de peso

molecular 1Kb Plus DNA Ladder INVITROGEN®. La corrida electroforética

se fijó en 100 V durante una hora. Posteriormente se realizó la tinción de los

geles en una solución de bromuro de etidio (15 ppm) por un periodo de

tiempo de una hora en agitación continua; Para la visualización se colocó el

gel bajo un transiluminador UV y la imagen se analizó en el programa

PhotoCaptMw versión 10.01, para la estimación del peso de las bandas en

relación al marcador de referencia 1Kb plus DNA Ladder Marker

INVITROGEN®.

31

Además se realizaron ensayos para determinar la concentración de

cloruro de magnesio y la temperatura de alineamiento. Luego de establecer

las condiciones de PCR, se realizaron las amplificaciones con los 10 primers

con toda la población de Tabebuia billbergii.

2.5 Registro de datos

Las fotografías de los geles fueron analizados en el programa

PhotoCaptMw que es un asistente de lectura de las imágenes. Los datos

obtenidos se utilizaron para determinar el nivel de polimorfismo presente

teniendo como variable al número de alelos por locus. Se tomó como

referencia los pesos moleculares de cada banda del marcador 1Kb plus DNA

Ladder Marker INVITROGEN® para determinar el peso de las bandas

amplificadas. Se realizó una matriz de pesos moleculares con los 10

marcadores ISSRs y otra matriz con los datos en código binario siendo la

presencia igual a 1 y la ausencia igual a 0 (Shen et al., 2006). La matriz

obtenida fue compatible para el análisis de diversidad genética utilizada en

diversos programas bioestadísticos.

2.7 Análisis de datos

2.7.1 Análisis de diversidad genética

Para el análisis de diversidad genética se utilizó el software GenALEX

versión 6.5 (Peakall et al., 2012), que determinó las frecuencias de alelos, el

porcentaje de loci polimórfico. También se uso el programa en línea

Polymorphic Information Calculator (Nagy et al., 2012), para determinar el

Contenido de Información de Polimorfismo (PIC) y la heterocigosis

esperada.

32

2.7.2 Análisis de agrupamiento

Los análisis estadísticos para observar la diversidad genética fueron

realizados utilizando los coeficientes de similaridad los cuales comparan las

bandas compartidas entre individuos o poblaciones y consideran para el

análisis solamente la presencia de bandas excluyendo así el equilibrio de

Hardy-Weinberg. Estos coeficientes son: Dice (1945) y Jaccard (1908)

usados en análisis de marcadores dominantes. Los análisis de agrupamiento

fueron realizados utilizando el programa NTSYSpc versión 2.02 (Rohlf,

2002), con el que se construyó los dendrogramas utilizando, el análisis de

agrupamiento UPGMA (unweighted pair-group method with arithmetic

averages) que nos permite determinar las relaciones entre poblaciones.

2.7.2 Análisis de coordenadas principales

El análisis de coordenadas principales (ACoP) permite observar la

diversidad genética utilizando el coeficiente de similaridad de Jaccard (1908)

el que permite conocer la distribución que tienen los individuos en las

poblaciones. El ACoP resume en pocas dimensiones, la variabilidad de una

matriz de dispersión que tiene un gran número de variables (Legendre &

Legendre, 2000). Este análisis se lo llevó a cabo en el programa NTSYSpc

versión 2.02 con el módulo Eigen (Rohlf, 2002), también se utilizó el

programa MULTBIPLOT (Vicente-Villardón, 2014), para realizar el análisis

de coordenadas principales, donde se creó los gráficos de cada una de las

poblaciones de guayacán.

2.7.3 Análisis molecular de varianza

El análisis molecular de varianza AMOVA (Excoffier et al., 1992) es

un análisis jerárquico que nos permite observar la variación dentro y entre los

componentes de una población usando distancias genéticas (Culley et al.,

2007). Para el análisis molecular de varianza se utilizó el software GenALEX

versión 6.5 (Peakall et al., 2012), este programa trata a los datos dominantes

33

como haplotipos y analiza el total de la varianza en los componentes de la

covarianza asociados con diferencias entre individuos dentro de poblaciones,

entre individuos en diferentes poblaciones dentro de grupos y entre grupos

(Culley et al., 2007).

2.7.4 Distancia genética de Nei

Los índices de distancias genéticas se calcularon entre las poblaciones

formadas en el análisis de agrupamiento UPGMA y ACoP, con el objetivo de

describir el grado de diferenciación genética entre grupos. Este valor se

refiere a las diferencias genéticas obtenidas en función de las frecuencias

genéticas (Nei, 1979).

Para el cálculo de la distancia genética de Nei, se utilizó la matriz

binaria que fue introducida en el software GenALEX versión 6.5 (Peakall et

al., 2012), usando la opción frequency.

34

CAPÍTULO III

RESULTADOS

3.1 Extracción y cuantificación de AND

Se probaron cuatro protocolos de extracción de ADN con 12 muestras

de guayacán siendo estos: Graham (1993), Álzate Marín (2001), Ferreira &

Grattapaglia (1998), Mariac et al., (1999) adaptado por Morillo (2002)

detallados en el (anexo 5) Con los resultados obtenidos de la cuantificación se

escogió el protocolo Mariac et al., (1999) adaptado por Morillo (2002), que

resultó ser más efectivo en la extracción de ADN mostrando una molécula

más definida y con menos degradación (figura 3.1).

Figura 3.1: Electroforesis en gel de agarosa al 1% del ensayo de

extracciones de ADN con cuatro protocolos usando el marcador de peso

Low Mass Ladder.

Se realizaron las extracciones de ADN genómico de un total de 214

individuos con el protocolo de Mariac et al., (1999) adaptado por Morillo

(2002), el que resultó ser el más eficaz para la extracción de ADN mostrando

ADN de buena calidad y sin degradación, obteniendo una concentración

promedio de la población de 568,67 ng/μl y un índice de pureza promedio de

35

1,81. Además se comprobó la calidad de ADN con electroforesis horizontal

en geles de agarosa al 1.5 % (figura 3.2).

Figura 3.2: Cuantificación de ADN genómico de guayacán utilizando el

marcador de peso molecular Low Mass Ladder.

3.2 Validación del ADN de Guayacán Sabanero

Para validar las 214 muestras de ADN obtenidas, se realizó una

amplificación con el marcador Tau 15 (Braga et al., 2007), utilizando

diluciones de ADN a una concentración de 5ng/µl, con el coctel de PCR

descrito por Morrillo & Miño (2011), detallado en la tabla 2.1 y 2.2. No se

detectaron problemas en la amplificación de las muestras de ADN, los

amplicones presentaron buena intensidad. A continuación se muestra la

imagen de la validación de ADN de guayacán sabanero (figura 3.3).

Figura 3.3: Validación de los ADNs de guayacán (Carril M: marcador de

peso molecular Low Mass Ladder).

36

3.3 Determinación de la especie Tabebuia billbergii con el marcador

ISSR 844A.

Se realizó la amplificación de los 214 ADNs genómico de guayacán

donde se utilizó el marcador molecular ISSR 844A con el coctel de PCR

descrito por Morrillo & Miño (2011), detallado en la tabla 2.3 y 2.4, el

marcador de peso molecular 100 bp DNA Ladder. Se comprobó que el ADN

validado corresponde a T. billbergii con el marcador ISSR 844A, ya que este

marcador resultó ser el más idóneo en la diferenciación de las especies T.

billbergii y T. chrysantha mediante el patrón de banda (figura 3.4).

Figura 3.4: Amplificación del ADN genómico de guayacán con el marcador

molecular ISSR 844A en gel de agarosa al 2%. En donde se diferencia la

especie T. billbergii de T. chrysantha mediante el patrón de banda.

3.4 Pre-selección de marcadores ISSRs

Se realizaron pruebas de amplificación con 48 marcadores ISSR y 8

muestras de ADN de guayacán (T. billbergii) diluidas a una concentración de

37

5ng/µl, utilizando el coctel de PCR para ISSRs descrito por Morrillo & Miño

(2011), detallado en la tabla 2.3 y 2.4. Se seleccionaron 10 marcadores ISSR

los que mostraron el mayor número de fragmentos de ADN polimórficos en

la población de T. billbergii. Se realizó pruebas de Temperatura de Annealing

para obtener una mejor resolución de banda y pruebas variando la

concentración de MgCl2. En la (Figura 3.5) se indica los productos

amplificados con los 10 marcadores seleccionados.

Figura 3.5: Amplificación de ADN de guayacán con 10 marcadores ISSRs

siendo estos: a) 17899A y 17899B b) ISSR840 y ISSR841.

38

Figura 3.5: Amplificación de ADN de guayacán con 10 marcadores ISSRs

siendo estos: c) ISSR853 y ISSR857 d) HB12 y HB14 e) ISSR824 f)

ISSR900.

39

3.5 Optimización de la Técnica de PCR

Para establecer las condiciones adecuadas de PCR se llevaron a cabo

distintos ensayos para optimizar: concentración de cloruro de magnesio y

temperatura de alineamiento.

3.5.1 Concentración de MgCl2

En la estandarización del MgCl2

se tomó en consideración el patrón

de bandas en busca de una mejor definición de las bandas, para lo cual, se

trabajó con tres concentraciones diferentes de MgCl2siendo estas: 1.5, 2.5 y

3 mM, utilizando el coctel de PCR descrito por Morrillo & Miño (2011),

detallado a continuación en la tabla 3.1.

Tabla 3.1: Volúmenes de reactivos para una reacción de PCR, variando la

concentración de MgCl2

MIX PCR Ci Cf VOL. 1 Rx

(µL)

Agua

2.6

Buffer PCR (X) 10 1

1

MgCl2 (mM) 50 [1.5], [2.5] ,[3]

0.6

dNTP's (mM) 2.5 0.1

0.4

Primer (µM) 10 0.2

0.2

Taq casera (U/ µL) 5 0.1

0.2

Muestra (ng/ µL) 5 2.5

5

Volumen de reacción (µL) 10

ng de ADN por Rx 25

Ci= concentración inicial, Cf = concentración final

40

Se obtuvo una mejor definición de bandas utilizando la concentración

de MgCl2: 1.5 mM. Una vez determinada la concentración idónea de

MgCl2

se procedió a pasar los primers que presentaron un mayor número

de bandas siendo estos: 841, 853, 857, 17899A y 17899B (figura 3.6).

Figura 3.6: Amplificación de los primers ISSRs 853, 857 utilizando la

concentración de MgCl2 de 1.5mM.

3.5.2 Temperatura de alineamiento

Las condiciones de temperatura para la amplificación de los 10 ISSRs

se mantuvieron según el programa de PCR para ISSRs detallado en la (tabla

2. 4). En el caso del primer 840, se probaron cuatro temperaturas 37 ºC, 42

ºC, 47 ºC y 52 ºC (figura 3.7), de las cuales se observó que a 52 ° C resultó

ser la temperatura más idónea al conseguir una mejor definición de banda.

Figura 3.7: Amplificación de ADN de guayacán con el ISSR 840 utilizando

diferentes temperaturas de alineamiento.

41

3.6 Amplificación de ADN de guayacán (T. billbergii) mediante los

primers ISSR seleccionados.

Luego de haber comprobado las condiciones de PCR para cada primer

se procedió a la amplificación de los 10 primers ISSR seleccionados con los

214 ADNs de guayacán (T. billbergii). Los productos amplificados con los

primers se muestran en el anexo 5 y a continuación dos de ellos (figura 3.8).

Figura 3.8: Electroforesis en gel de agarosa al 1.5% de productos

amplificados con los primers: a) 841 b) 17899A c) HB12 d) 840 e) 824.

42

c)

d)

e)

Figura 3.8: Electroforesis en gel de agarosa al 1.5% de productos

amplificados con los primers: c) HB12 d) 840 e) 824.

43

Las fotografías de los geles fueron analizados en el programa

PhotoCaptMw que es un asistente de lectura de imágenes. Los datos

obtenidos se utilizaron para determinar el nivel de polimorfismo presente

teniendo como variable al número de alelos por locus. Se tomó como

referencia los pesos moleculares de cada banda del marcador 1Kb plus DNA

Ladder Marker INVITROGEN® para determinar el peso de las bandas

amplificadas. Se realizó una matriz de pesos moleculares con los 10

marcadores ISSRs y otra matriz con los datos en código binarios siendo la

presencia igual a 1 y la ausencia igual a 0 (Shen et al., 2006). La matriz

obtenida fue compatible para ser utilizada en diversos programas

bioestadísticos para el análisis de diversidad genética.

3.7 Análisis de datos

3.7.1 Diversidad genética

Para el análisis de diversidad genética de los 214 genotipos de

guayacán (T. billbergii) para los 10 marcadores ISSR se elaboró una matriz

genotípica que se muestra (anexo7). Se detectaron 49 alelos con un promedio

de 4.9 alelos/loci, el rango de longitud para los alelos fue de 430 a 2105 pb.

Con ayuda del software GenALEx versión 6.5 (Peakall et al., 2012),

se obtuvo las frecuencias alélicas de las cinco poblaciones de T. billbergii,

que estuvieron en el rango de 0.010 para los alelos de 989pb y 1408pb para

los loci ISSR900 y HB12, hasta el valor de 1 para los alelos de 650pb y

770pb para el locus ISSR840, 1015pb, 1065pb y 1276pb para los loci,

ISSR853, ISSR824 y 17899A respectivamente. El mayor número de alelos

reportados fue 8 para el loci 17899A, mientras que el loci ISSR857 presentó

el menor número que fue de 3 alelos. En el anexo 8 y tabla 3.2 se detalla las

frecuencias alélicas para cada uno de los loci.

44

Tabla 3.2: Alelos registrados con sus respectivas frecuencias en 5

poblaciones de guayacán con 10 primer ISSRs.

Locus

Tamaño

encontrado

(pb)

Frecuencia

(Loja)

Mangahurco

(Guayas)

Isla Puná

(Loja)

Cazaderos

(El Oro)

La Cuca

(Loja)

Garza

Real

ISSR

824

1368 0.322 0.491 0.650 0.900 0.400

1237 0.455 0.453 0.150 0.200 0.300

1065 0.975 1.000 1.000 1.000 1.000

950 0.099 0.321 0.300 0.200 0.200

ISSR

853

1627 0.372 0.358 0.300 0.800 0.800

1444 0.446 0.245 0.250 0.800 0.400

1015 0.793 0.868 1.000 0.800 1.000

950 0.017 0.300 0.020 0.300 0.010

ISSR

841

704 0.884 0.962 0.800 0.300 0.100

606 0.901 0.962 0.900 0.800 0.600

508 0.132 0.264 0.350 0.800 0.800

453 0.777 0.679 0.800 0.050 0.200

ISSR

HB14

1676 0.074 0.060 0.150 0.200 0.020

1325 0.215 0.302 0.200 0.050 0.040

952 0.603 0.792 0.950 0.700 0.800

615 0.380 0.811 0.800 1.000 0.600

ISSR

840

1384 0.182 0.038 0.200 0.400 0.200

1220 0.545 0.981 0.850 0.200 0.300

960 0.355 0.434 0.450 0.200 0.400

770 0.744 0.283 0.400 0.600 1.000

650 0.868 1.000 1.000 1.000 1.000

562 0.446 0.774 0.550 0.100 0.800

ISSR

857

1375 0.496 0.377 0.550 0.600 1.000

950 0.314 0.132 0.150 0.400 0.900

524 0.025 0.100 0.100 0.300 0.040

ISSR

900

1680 0.240 0.245 0.100 0.400 0.030

1329 0.132 0.132 0.200 0.400 0.100

1080 0.413 0.151 0.650 0.800 0.900

989 0.017 0.020 0.010 0.030 0.040

920 0.025 0.040 0.040 0.400 0.200

850 0.058 0.010 0.020 0.030 0.300

ISSR

17899A

1734 0.041 0.100 0.030 0.200 0.040

1559 0.975 0.981 0.900 0.800 0.800

Continúa

45

1276 0.959 1.000 1.000 1.000 0.900

1142 0.967 0.962 0.900 0.100 0.300

1074 0.017 0.038 0.050 0.300 0.030

978 0.545 0.472 0.700 0.020 0.020

727 0.769 0.736 0.800 0.020 0.100

650 0.107 0.415 0.250 0.030 0.030

ISSR

17899B

1178 0.198 0.321 0.600 0.100 0.400

650 0.099 0.472 0.350 0.300 0.020

550 0.521 0.604 0.200 0.400 0.700

500 0.496 0.604 0.100 0.400 0.700

430 0.372 0.642 0.020 0.020 0.050

ISSR

HB12

2105 0.521 0.434 0.600 0.700 0.500

1408 0.099 0.113 0.010 0.200 0.100

966 0.570 0.774 0.600 0.700 0.700

874 0.826 0.623 0.700 0.700 0.700

739 0.339 0.226 0.300 0.500 0.600

En la tabla 3.3 y figura 3.9 se ilustra algunos parámetros de diversidad

genética realizados en el software GenALEx versión 6.5 (Peakall et al.,

2012). Como: el índice de información de Shannon que tuvo su valor máximo

de 0.455 para la población de Mangahurco y el mínimo de 0.326 para la

población de Garza Real con un promedio de 0.39. Asimismo se pudo

evidenciar que la población de Mangahurco presentó el mayor valor del

porcentaje de polimorfismo y diversidad siendo: 100% y 0.300

respectivamente, mientras que la población de Garza Real presentó el valor

más bajo de 61.22% y 0.217.

46

Tabla 3.3: Análisis de diversidad genética en 5 poblaciones de Tabebuia

billbergii provenientes de las localidades de las provincias de Loja, Guayas y

El Oro de los bosques secos del Ecuador.

Población N Na Na Freq.

> =5% Ne I h %P

Mangahurco 121 2.000 1.79 1.514 0.455 0.300 100

Isla Puná 53 1.796 1.65 1.466 0.402 0.269 79.59

Cazaderos 20 1.735 1.73 1.429 0.386 0.256 73.47

Garza Real 10 1.694 1.69 1.427 0.381 0.255 69.39

La Cuca 10 1.612 1.61 1.364 0.326 0.217 61.22

Promedio

1.77 1.69 1.44 0.39 0.26 76.73

N= número de Individuos. Na = número de alelos diferentes. Ne = número

de alelos efectivos. I = índice de información de Shannon's. h = diversidad.

%P = porcentaje de polimorfismo.

Figura 3.9: Análisis comparativo de los índices de diversidad genética de las

cinco poblaciones de guayacán (Tabebuia billbergii).

47

También se uso el programa en línea Polymorphic Information

Calculator (Nagy et al., 2012), para determinar el Contenido de Información

de Polimorfismo (PIC) y la heterocigosis esperada con diez marcadores

ISSRs detallado en la tabla 3.4. El índice de diversidad genética de Nei o

heterocigosidad esperada presentó un valor promedio en toda la población de

0.50, su valor máximo fue de 0.53 para los marcadores: 17899A, ISSR824,

ISSR840 y el mínimo de 0.27 con el marcador ISSR900. El valor del

contenido de información de polimorfismo (PIC), asimismo fue el más alto

para los marcadores: 17899A, ISSR824, ISSR840 con un valor de 0.50 y un

mínimo de 0.24 para el ISSR900, mientras que el promedio para toda la

población fue de 0.46.

Tabla 3.4: Análisis de diversidad genética de la población de guayacán

(Tabebuia billbergii) con 10 primer ISSRs.

Primer Secuencia (5’-3’) NBT NBP He PIC

17899A CACACACACACAAG 9 8 0.53 0.50

17899B CACACACACACAGG 11 5 0.36 0.33

HB12 CACCACCACGC 8 5 0.37 0.34

HB14 CTCCTCCTCGC 9 4 0.51 0.47

824 TCTCTCTCTCTCTCTCG 8 4 0.53 0.50

840 GAGAGAGAGAGAGAGAYT 8 6 0.53 0.50

841 GAGAGAGAGAGAGAGAYC 10 4 0.47 0.44

853 TCTCTCTCTCTCTCTCRT 5 4 0.51 0.49

857 ACACACACACACACACYG 6

3 0.44 0.40

900 ACTTCCCCACAGGTTAACACA 10 6 0.27 0.24

PROMEDIO 8.4 4.9 0.50 0.46

NBT= número de bandas totales. NBP= número de bandas polimórficas.

He= heterocigosidad esperada o diversidad genética de Nei (1973). PIC=

Contenido de Información de Polimorfismo. (Y = T C, R = G A).

48

3.7.2 Análisis de agrupamiento

El análisis UPGMA agrupa a los individuos en forma aglomerativa y

jerárquica en base a promedios de similaridad, como resultado de ello se

obtiene una representación gráfica o dendograma.

Usando el programa NTSYSpc versión 2.02 se generó el dendograma

para los 214 genotipos de guayacán con el coeficiente de asociación o

similitud Jaccard. En el dendograma se pudo distinguir que los agrupamientos

de los genotipos no coinciden de acuerdo al lugar de su proveniencia ya que

los genotipos se distribuyeron indistintamente.

El análisis del dendograma muestra 2 grandes grupos, denominados A

y B, conformados por varios subgrupos, se escogió un valor de similitud de

0.40 para resolver los agrupamientos, los cuales se incluyen en la (figura

3.10). El grupo A, reúne a los subgrupos conformado por los genotipos de las

poblaciones de (Mangahurco, Isla Puná y Cazaderos); La población de

Mangahurco está presente en un 90.08%, así también, los genotipos de la

población de la Isla Puná están presentes en un 100%, y los genotipos

pertenecientes a Cazaderos presentaron un 100%. Dentro del grupo B pueden

distinguirse subgrupos constituidos por los genotipos pertenecientes a las

poblaciones de La Cuca, Garza Real y Mangahurco en un 100%, 80% y

7.45% respectivamente.

Además, ciertos genotipos están en forma aislada de los grupos A y

B, siendo: los genotipos (241 y 242) partieron de un valor de similitud de

0.74, mientras que los genotipos (152 y 165) partieron de 0.77 y el genotipo

(11) partió de un valor de similitud de 0.36, estos genotipos pertenecen a las

poblaciones de Garza Real y Mangahurco. Los grupos que presentaron una

mayor connotación en agrupación fueron los de las poblaciones de

Mangahurco y la Isla Puná ya que tuvieron el mayor número de genotipos de

la población de guayacán siendo de 121 y 53 respectivamente.

49

Figura 3.10: Dendograma para los 214 genotipos de guayacán con el

coeficiente de similitud Jaccard, realizado en el programa NTSYS.pc versión

2.02. Representación de los grupos A y B, los que estan conformados por las

5 poblaciones de guayacán.

50

3.7.3 Análisis de coordenadas principales

Se realizó un análisis de ACoP en el programa NTSYS.pc versión

2.02 basado en la matriz binaria a partir de las similaridades obtenidas con el

coeficiente de Jaccard, el cual permite conocer las agrupaciones que tienen

los genotipos en un espacio bidimensional (figura 3.11). Se obtuvo el grafico

que representa los genotipos de las cinco poblaciones de guayacán (Tabebuia

billbergii) las cuales se distribuyeron indistintamente a lo largo del plano de

variación.

Figura 3.11: Distribución en dos dimensiones de los 214 individuos de

Tabebuia billbergii mediante el análisis de coordenadas principales (ACoP)

en el programa NTSYS pc. 2.02 basado en el coeficiente de similaridad de

Jaccard.

A partir de la matriz binaria (anexo 7) y mediante el coeficiente de

similitud de Jaccard en el programa NTSYS pc.versión 2.02, se obtuvo los

ejes de variabilidad de los genotipos con respectó a su ordenación en el

51

espacio, en donde se muestra los valores “Eigen” que indican el porcentaje

individual y el porcentaje acumulado de la variabilidad de cada una de las

coordenadas obtenidas. El análisis determinó tres coordenadas principales en

donde la tercera coordenada presentó el valor más alto de 20.79% de la

varianza total, las coordenadas 1 y 2 presentaron un porcentaje de varianza de

8.53% y 6.35% respectivamente (tabla 3.5).

Tabla 3.5: Valores Eigen, porcentaje individual y acumulativo de la varianza

por coordenada principal del ACoP de 214 genotipos de guayacán con 10

primers ISSRs.

Coordenada Valores Eigen Porcentaje

individual

Porcentaje

acumulado

1 4.83 8.53 8.53

2 3.59 6.35 14.88

3 3.35 5.91 20.79

También se realizó el análisis de coordenadas principales (ACoP) en

el programa MULTBIPLOT y se obtuvo los gráficos que representan los

genotipos de las cinco poblaciones de guayacán (Tabebuia billbergii) en

donde no se diferenció agrupamientos de los genotipos de acuerdo al lugar de

su proveniencia, ya que se distribuyeron indistintamente a lo largo del plano

de variación representado (figura 3.12).

En este análisis se puede distinguir que las poblaciones de la Isla

Puná, Garza Real y La Cuca son las más alejadas entre sí, ya que, la

distribución de los genotipos de la Isla Puná presentan una mayor agrupación

en el segundo y tercer cuadrante del plano de variación, mientras que los

genotipos de La Cuca y Garza Real se agrupan en el primer y cuarto

cuadrante. Además las poblaciones de Mangahurco, Isla Puná y Cazaderos

son más cercanas entre sí, presentando sus genotipos distribuidos en los

cuatro cuadrantes del plano de variación.

52

a)

b)

c)

Continúa

53

d)

e)

Figura 3.12: Distribución en dos dimensiones de las 5 poblaciones de

Tabebuia billbergii: a) genotipos de Mangahurco, b) genotipos de la Isla Puná,

c) genotipos de Cazaderos, d) genotipos de La Cuca e) genotipos de Garza

Real, mediante el análisis de coordenadas principales (ACoP) en el programa

MULTBIPLOT basado en el coeficientes de similaridad de Jaccard.

54

3.7.4 Análisis molecular de varianza

En el análisis molecular de varianza (AMOVA) se obtuvo un índice de

diferenciación genética (Φst) de 0.112 entre las 5 poblaciones de guayacán

(Mangahurco, Isla Puná, Cazaderos, Garza Real y La Cuca). Se determinó que el

11% de la diversidad aporta a la diferenciación entre las poblaciones mientras

que el 89% de la varianza está presente en cada una de las poblaciones, es decir,

la varianza genética está distribuida heterogéneamente de tal manera que la

mayor parte de la diversidad se encuentra dentro de cada población detallado

(figura 3.13 y tabla 3.6).

Figura 3.13: Porcentaje de varianza molecular de 5 poblaciones de guayacán:

Mangahurco, Isla Puná, Cazaderos, Garza Real y La Cuca.

Tabla 3.6. Análisis molecular de varianza de de 5 poblaciones de guayacán:

Mangahurco, Isla Puná, Cazaderos, Garza Real y La Cuca, analizadas con 10

primers ISSR.

C

o

n

e

l

Origen de

la

variación

g.l. Suma de

cuadrados

Promedio de

cuadrados

Componente de

varianza

% variación

genética Φst

Entre

poblaciones 4 28.895 7.224 0.179 11% 0.000

Dentro de

cada

población

209 295.521 1.414 1.414 89% 0.112

Total 213 324.416

1.593 100%

55

Con el objetivo de robustecer el análisis de coordenadas principales y

los resultados del análisis molecular de varianza, se efectuaron análisis de

varianza entre las poblaciones de guayacán más alejadas (Isla Puná, Garza

Real y La Cuca) y más cercanas (Mangahurco, Isla Puná y Cazaderos) del

origen del plano de variación.

El resultado de las poblaciones más alejadas (Isla Puná, Garza Real y

La Cuca) dió un porcentaje de variación del (28%) entre poblaciones, se

evidenció que la fuente de variación fue dentro de cada población con el

(72%) (figura 3.14 y tabla 3.7), esto explica gran parte la variación dentro de

las poblaciones detectado en el análisis molecular de varianza para las cinco

poblaciones de guayacán.

Figura 3.14: Porcentaje de varianza molecular de 3 poblaciones lejanas

de guayacán: Isla Puná, Garza Real y La Cuca.

56

Tabla 3.7. Análisis molecular de varianza de las poblaciones más alejadas

según el ACoP como lo son Isla Puná, Garza Real y La Cuca, analizadas con

10 primers ISSR.

El resultado para las poblaciones más cercanas (Mangahurco, Isla

Puná y Cazaderos) fue mayor la fuente de variación dentro de las poblaciones

con un 91%, que la existente entre las poblaciones con un 9% de variación

(figura 3.15 y tabla 3.8).

Figura 3.15: Porcentaje de varianza molecular de 3 poblaciones cercanas

de guayacán que son Mangahurco, Isla Puná y Cazaderos.

Origen de

la

variación

g.l. Suma de

cuadrados

Promedio de

cuadrados

Componente de

varianza

% variación

genética Φst

Entre

poblaciones 2 92,137 46,068 2,495 28% 0.000

Dentro de

cada

población 70 449,726 6,425 6,425 72% 0.280

Total 72 541,863

8,919 100%

57

Tabla 3.8. Análisis molecular de varianza de las poblaciones más cercanas

según el ACoP que son Mangahurco, Isla Puná y Cazaderos, analizadas con 10

primers ISSR.

2.7.5 Distancia Genética de Nei

La tabla 3.9 muestra las distancias genéticas de Nei entre las cinco

poblaciones de guayacán (T. billbergii). Se observó que el valor más bajo se

encuentra entre la relación de la población de Mangahurco e Isla Puná

(D=0.044) mientras que el valor más alto corresponde a la población de la

Isla Puná y La Cuca (D=0.215). Por los valores obtenidos menores a 0.15 se

aprecia que las poblaciones están muy relacionadas entre ellas.

Tabla 3.9: Distancia de Nei (1978) calculadas en 214 genotipos de guayacán

analizados con 10 primers ISSRs.

Mangahurco Isla

Puná Cazaderos La Cuca

Garza

Real

0.000

Mangahurco

0.044 0.000

Isla Puná

0.053 0.053 0.000

Cazaderos

0.163 0.215 0.168 0.000

La Cuca

0.136 0.192 0.164 0.078 0.000 Garza Real

Origen de

la

variación

g.l. Suma de

cuadrados

Promedio de

cuadrados

Componente de

varianza

% variación

genética Φst

Entre

poblaciones 2 83,712 41,856 0,681 9% 0.000

Dentro de

cada

población 191 1363,700 7,140 7,140 91% 0.087

Total 193 1447,412

7,821 100%

58

CAPITULO IV

DISCUSIÓN

4.1 Extraccion y calidad del ADN genómico

Hoy en día existen varios protocolos de extracción de ADN vegetal en

donde se requiere el aislamiento de ADN de buena calidad y de alto peso

molecular ya que este proceso no es siempre simple debido a que un gran

número de plantas producen metabolitos secundarios tales como fenoles,

alcaloides, polisacáridos, flavonoides, quininas y nucleasas que dificultan su

aislamiento. Además ciertos protocolos de extracción de ADN no son siempre

reproducibles para cualquier especie, ya que no se cuenta con un protocolo

específico y establecido para cada especie como es el caso de Tabebuia

billbergii (Khanuja, et al., 1999; Fellers, et al., 2002; Chen y Ronald, 1999).

Al analizar los resultados de los cuatro protocolos de extracción de

ADN que se realizaron en este estudio se escogió el protocolo de Mariac et

al., (1999) adaptado por Morillo (2002), con el que se obtuvo la mayor

calidad y cantidad de ADN al revelar bandas nítidas de alto peso molecular

y sin degradación. La concentración promedio de la población de guayacán

fue de 568.67 ng/μl y la pureza promedio fue de 1.81 encontrándose dentro de

los parámetros aceptables de pureza de ADN a aquellas que se encuentren

entre 1.7 y 1.9 mientras que valores superiores a este rango indican

contaminación por sales y los inferiores a interferencias de proteínas, fenol y

otros compuestos aromáticos (Touil et al., 2008).

La mayor concentración de ADN puede deberse a que este protocolo

emplea dos buffer uno de extracción y otro de lisis, el buffer de lisis contiene

porcentajes altos de CTAB (bromuro de cetil trimetil amonio) siendo 4%

mayor que la usada en los diferentes protocolos (Graham, 1993; Ferreira &

Grattapaglia, 1998 y Alzate-Marin, 2009), este reactivo solubiliza los lípidos

de la membrana aumentando así la lisis celular lo que permitió la degradación

59

de moléculas de fenol y proteínas. Otro factor fue el tiempo de incubación

que fue de dos horas el que permitió una mayor acción de los compuestos de

la buffer de lisis con la muestra.

La calidad del ADN extraído se aseguró mediante la resuspensión del

pellet en la solución TE y RNAsa, además de su refrigeración a - 20 °C. La

solución TE contiene EDTA el cual es un quelante de iones magnesio e

inhibidor de las DNAsas debido a que el ión Magnesio es un cofactor para su

actividad evitando que las DNAsas presentes actúen sobre el ADN

(Lehninger, 1981). La RNAsa son enzimas que degradan secuencias de RNA

evitando así que actúen sobre el ADN. (Somma, 2002).

4.2 Amplificación de fragmentos de ADN mediante primers ISSRs

Las condiciones de temperatura de Annealing para la amplificación

de los 10 ISSRs se mantuvieron según el programa de PCR para ISSRs

descrito por Morrillo & Miño (2011). Solo en el caso del primer 840, se

probaron cuatro temperaturas de Annealing siendo estas 37 ºC. 42 ºC. 47 ºC y

52 ºC, de las cuales se pudo observar que a 52°C resultó ser la temperatura

más idónea al conseguir una mejor resolución y definición de bandas.

En la estandarización de la concentración de MgCl2

se tomó en

consideración el patrón de bandas en busca de una mejor definición de las

bandas para lo cual se realizó ensayos con tres concentraciones diferentes de

MgCl2siendo estas 1.5. 2.5 y 3 mM, en donde se obtuvo una mejor definición

de bandas con la concentración de MgCl2de 1.5 mM. En estudios realizados

por Shen et al., (2006). Prevost & Wilkinson (1999) y Casasoli et al., (2001)

recomiendan utilizar concentraciones de 1.2 mM a 1.8 mM de MgCl2; además

la reducción de concentraciones de MgCl2

evita la generación de una gran

cantidad de bandas poco intensas e inespecíficas en la amplificación, debido a

que el MgCl2

es un cofactor de la DNA polimerasa y al disminuir la

60

concentración del cofactor se evita una exagera actividad de la enzima la cual

puede ser inespecífica (Rickwood & Homes. 1995).

4.3 Análisis de diversidad genética

El estudio de la diversidad genética en las cinco poblaciones del

guayacán (Tabebuia billbergii) es abordado a través de la determinación de

las frecuencias alélicas sobre un número de marcadores polimórficos y el

empleó de medidas basadas en estas frecuencias como: el contenido de

información polimórfica (PIC), el porcentaje de polimorfismo y el índice de

diversidad genética de Nei o heterocigosidad esperada (He) (Weising et al.,

2005).

La presente investigación es una de las pioneras en el estudio de

diversidad genética de la especie endémica Tabebuia billbergii en los

bosques secos del Ecuador, por lo que es considerada como un estudio guía,

del cual se obtuvo algunos parámetros de diversidad genética como: el

contenido de información polimórfica (PIC) y el índice de diversidad

genética de Nei o heterocigosidad esperada con valores promedio de 0.46 y

0.50 respectivamente. Para cotejar los resultados obtenidos de PIC y He se

tomó con guía estudios realizados en otras especies del género Tabebuia,

como por ejemplo: En un estudio realizado en la especie Tabebuia rosea con

microsatélites en Colombia, se reportó un índice de polimorfismo (PIC)

promedio de 0.60 y un índice de diversidad genética promedio de 0.64

(López et al., 2015). En otro estudio de caracterización molecular con

microsatélites desarrollados para Tabebuia aurea en Brasil, obtuvieron un

índice de diversidad genética o heterocigosidad promedio de 0.91 (Braga et

al., 2006), mientras que según Silva (2011) para la misma especie reporto un

índice de diversidad genética promedio de 0.95.

Con estos estudios realizados en diferentes especies del género

Tabebuia se puede apreciar que los valores del contenido de información

61

polimórfica (PIC) y el índice de diversidad genética de Nei o heterocigosidad

esperada, variaron aún cuando se trabajó con microsatélites demostrando que

cada especie tiene sus características genotípicas diferentes del resto, aún así

cuando puedan presentar un antepasado en común.

Según González et al., (2005) & Pérez de la Torre et al., (2010), el

nivel de polimorfismo detectado por los ISSR, depende tanto del tipo de

secuencia repetitiva incorporada al iniciador utilizado para generar los

productos de amplificación, así como de la especie vegetal a ser analizada.

Según Pradeep et al., (2002) los iniciadores con motivos poli con

repeticiones (AG), (GA), (CT), (TC), (AC) y (CA), generan en promedio

mayor número de bandas y mayor polimorfismo que otros iniciadores di, tri o

tetranucleótidos con diferentes motivos. Los resultados del análisis de

diversidad genética obtenido revelaron que los marcadores ISSR 824, ISSR

840 y 17899A con motivos poli (TC), (GA) y (CA) respectivamente,

obtuvieron los mayores valores de PIC que fueron de 0.50 y el índice de

diversidad genética fue de 0.53. Estos resultados podrían llegar a explicarse

debido a que los iniciadores anclados en el extremo 5’ incluyen en su

producto de amplificación la secuencia completa del microsatélite y dado que

su longitud varía a lo largo de todo el genoma, es esperable encontrar un

mayor número de bandas y mayor grado de polimorfismo (Pradeep et al.,

2002).

Además, según Botstein et al., (1980) menciona que el contenido de

información polimórfica (PIC), indica la calidad del marcador y que el valor

PIC va desde (0 = Perfil monomórficos) a (1= perfil altamente polimórfico);

por lo que, marcadores con valores PIC superior a 0.5 se consideran muy

informativos, mientras que los valores entre 0.25 y 0.50 indican un nivel

informativo moderado y los valores menores de 0.25 se consideran poco

informativos. Razón por la que los resultados obtenidos indican que los

marcadores ISSR 824, ISSR 840 y 17899A mostraron un nivel informativo

62

moderado de diversidad genética presente en la población de tabebuia

billbergii.

También, se encontró una mayor diversidad alélica o porcentaje de

polimorfismo en la población de Mangahurco (Loja) con 100 %, demostrando

que la población presenta los 49 alelos establecidos para este estudio, además

de que posee el mayor número de individuos, seguida de la población de la

Isla Puná (Guayas) que obtuvo un 79.59% y posteriormente las poblaciones

de Cazaderos y Garza Real (Loja) con 73.47% y 69.39% respectivamente,

mientras que la población La Cuca (El Oro) presentó el menor porcentaje de

polimorfismo que fue de 61.22%.

4.4 Análisis de agrupamiento

Al realizar el dendograma UPGMA con los datos moleculares, usando

el coeficiente de similitud de Jaccard, se observó que los genotipos se

distribuyeron indistintamente y no de acuerdo a su distribución geográfica, es

decir, que genotipos de regiones distantes pueden ser genéticamente muy

próximos. El análisis del dendograma mostró 2 grandes grupos (con un valor

de similitud de 0.40). El primer grupo denominado (A), reúne a los subgrupos

conformado por los genotipos de las poblaciones de (Mangahurco, Isla Puná

y Cazaderos); La población de Mangahurco está presente en este grupo en un

90.08%, los genotipos de las poblaciones de la Isla Puná y Cazaderos

presentaron igual porcentaje que fue de 100% para cada uno. Dentro del

segundo grupo (B) pueden distinguirse subgrupos constituidos por los

genotipos pertenecientes a las poblaciones de La Cuca, Garza Real y

Mangahurco con: 100%, 80% y 7.45% respectivamente.

Además los resultados obtenidos del dendograma revelaron que cinco

individuos están en forma aislada de los grupos A y B, revelando que sus

genotipos pueden ser diferentes del resto de la población. Gentry (1992)

menciona, que la especie T. billbergii presenta dos subespecies conocidas

como T. billbergii–billbergii y T. billbergii-ampla, lo que explicaría el

63

porqué ciertos individuos están aislados, ya que pueden pertenecer a una de

estas subespecies. Según, Gentry (1992) indica que la subespecie T. billbergii

ampla está presente en las provincias de Guayas y El Oro. Además se conoce

que el guayacán T. billbergii está presente en las provincias de Manabí,

Guayas y Loja (Aguirre, 2006; Aguirre, 2012; Brack & Mendiola, 2004;

Jorgense & León 1999).

4.5 Análisis de coordenadas principales

También con los resultados del análisis de coordenadas principales se

puede afirmar que los individuos se distribuyeron indistintamente a lo largo

del plano de variación y no de acuerdo a su distribución geográfica sino más

bien por características genotípicas que presentó la especie T. billbergii.

En los agrupamientos realizados se observó que los individuos de las

poblaciones de Garza Real (Loja) y La Cuca (El Oro) se encuentran muy

cercanos entre sí, pero separados del resto de individuos de las otras

poblaciones, esto puede deberse a que las características fenotípicas de estas

dos poblaciones son muy similares a diferencia del resto de la población de

guayacán (T. billbergii).

La distribución de los individuos de poblaciones alejadas del origen

del plano de variación como: Garza Real, Isla Puná y La Cuca presentaron el

28% de la diversidad genética aportada a la diferenciación entre las

poblaciones, mientras que el 72% de la diversidad se encuentra en cada

población. Mientras que en poblaciones que se encuentran muy cercanas

según el ACoP como: Mangahurco, Isla Puná y Cazaderos, presentaron el

9% de diversidad genética entre las poblaciones, mientras que el 91% de la

diversidad genética está dentro de las poblaciones.

No se descarta la existencia del flujo de genes entre las poblaciones de

guayacán, debido a que, usualmente las semillas son esparcidas por aves,

ganado y hasta el hombre, ya que, el guayacán (Tabebuia billbergii) se ha

64

caracterizado por poseer una madera dura y resistente al ataque de termitas y

al agua salada, representando un gran interés en la industria comercial

(Rodríguez et al., 1991).

4.6 Análisis molecular de varianza

El análisis de varianza molecular (AMOVA) realizado para examinar

las diferencias existentes en las poblaciones, con el valor significativo (Φst

=0,112), indica que la mayor diversidad genética se debió a la variabilidad

existente dentro de las cinco poblaciones con un (89%) y el 11% corresponde

a la variabilidad existente entre poblaciones. Estos resultados indican la

diferenciación genética dentro de las cinco poblaciones, revelando la

homogeneidad de las poblaciones en estudio. De acuerdo a Salhi-Hannachi et

al., (2005), la baja diversidad entre las poblaciones y la gran variabilidad

detectada dentro las mismas podrían estar explicadas por la ocurrencia del

flujo génico en poblaciones naturales de las cuales se originaron estas

poblaciones o bien pudieran tener un origen común.

El AMOVA distribuyó la variación observada en componentes dentro

y entre poblaciones usando distancias genéticas. El componente de varianza

entre las poblaciones es llamada Φst, y es un análogo de Fst y θ. Este método

no fue originalmente diseñado para analizar datos estrictamente dominantes

como los RAPD, AFLP o ISSR, y ciertamente se deben considerar los datos

como haplotipos moleculares. El resultado obtenido del componente de

varianza Φst fue estimado en 0.112, lo que según De Vicente et al., (2004)

indica que las poblaciones analizadas no difieren considerablemente, ya que a

un mayor valor de Fst de 0,25 el flujo génico entre las poblaciones será

mayor.

65

CAPITULO V

CONCLUSIONES

Se realizó las prospecciones en los bosques secos del Ecuador en donde se

estableció cinco poblaciones representativas para la especie Tabebuia

billbergii, siendo estas: Mangahurco, Isla Puná, Cazaderos, Garza Real y

La Cuca.

Los análisis de diversidad genética mostraron que al utilizar 10

marcadores ISSR en 214 genotipo de guayacán Tabebuia billbergii fue

posible detectar el valor promedio del contenido de información

polimórfica (PIC) de 0.46 y el índice de diversidad genética de Nei o

heterocigosidad esperada con el valor promedio de 0.50

Se determinó el contenido de información polimórfica (PIC) y el índice de

diversidad genética de Nei o heterocigosidad esperada (He) en la

población de Tabebuia billbergii, en donde los marcadores: ISSR824,

ISSR840 y 17899A presentaron un nivel informativo moderado de

diversidad genética, ya que presentaron los mismos resultados tanto para el

PIC que fue 0.50 y He de 0.53.

Se determinó que la población de Mangahurco (Loja) presentó la mayor

diversidad alélica o porcentaje de polimorfismo con el 100 %, mientras

que la población La Cuca (El Oro) tiene la menor diversidad alélica con el

61.22%. Estos resultados pueden ser influenciados por el número de

individuos que presentó cada población ya que Mangahurco posee el

mayor número de individuos a diferencia de La Cuca.

66

Se determinó mediante el análisis de coordenadas principales y

agrupamiento, que los individuos no se distribuyeron de acuerdo a su

localidad geográfica, sino por características genotípicas que presentó la

especie Tabebuia billbergii.

El análisis molecular de varianza nos muestra que la contribución a la

mayor diversidad genética se debió a las diferencias dentro de cada

población, sin embargo los resultados obtenidos entre las poblaciones nos

indican cuán diferenciados se encuentran los genotipos, presentando un

nivel moderado de diversidad genética.

67

CAPITULO VI

RECOMENDACIONES

Se recomienda realizar un estudio morfológico que permita confirmar, la

especie con la que se está trabajando. Ya que la especie T. billbergii, según

Gentry (1992) presenta dos subespecies conocidas como T. billbergii–

billbergii y T. billbergii-ampla y en este tipo de estudio esto puede

perturbar la interpretación de los resultados.

Las bandas amplificadas con los marcadores ISSRs de la presente

investigación podrían ser usadas para desarrollar microsatélites específicos

para la especie Tabebuia billbergii los mismos que, podrían relacionarlos

en un futuro con caracteres morfológicos deseados

En los ensayos de amplificación, es importante usar un mayor número de

primers tanto para marcadores dominantes como codominantes, lo cual

podría ayudar a detectar una mayor cantidad de variación a lo largo del

genoma, permitiendo obtener resultados más consistentes.

68

CAPITULO VII

BIBLIOGRAFÍA

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Evaluación ecológica rápida de la vegetación en los bosques secos

de la Ceiba y Cordillera Arañitas. Ecociencia. Ministerio del

Ambiente. Herbario Loja y Proyecto Bosque Seco. Quito. 15-35.

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Aguirre . L; Sanchez. O. (2006). Bosques secos en Ecuador y su diversidad.

Botánica Económica de los Andes Centrales. 2:162-187.

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manejo forestal sostenible ante el cambio climático. MAE/FAO-

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81

ANEXOS

Anexo 1

Datos del material vegetal de T. billbergii spp que corresponde a las colectas

realizadas en localidades de las provincias de Loja (Mangahurco. Zapotillo.

Cazaderos). Guayas (Isla Puná) y El Oro (Arenillas).

Árbol Provincia Cantón Sitio

Altura Edad Altitud Coordenadas GPS

Especie Total

(m) (años) m.s.n.m. Latitud Longitud

1 Loja Zapotillo Mangahurco 29 200 354 562506 9540360 Tabebuia

billbergii

2 Loja Zapotillo Mangahurco 17 100 362 563682 9540860 Tabebuia

billbergii

5 Loja Zapotillo Mangahurco 20 80 331 563746 9538150 Tabebuia billbergii

6 Loja Zapotillo Mangahurco 30 200 314 563285 9539824 Tabebuia

billbergii

7 Loja Zapotillo Mangahurco 22 180 564 566474 9542902 Tabebuia

billbergii

9 Loja Zapotillo Mangahurco 18 50 453 565495 9541860 Tabebuia billbergii

11 Loja Zapotillo Mangahurco 24 200 513 565779 9543686 Tabebuia

billbergii

12 Loja Zapotillo Mangahurco 25 180 547 565822 9543948 Tabebuia

billbergii

13 Loja Zapotillo Mangahurco 30 170 646 565014 9545505 Tabebuia billbergii

14 Loja Zapotillo Mangahurco 25 80 646 565020 9545512 Tabebuia

billbergii

15 Loja Zapotillo Cazaderos 38 300 247 557599 9548336 Tabebuia

billbergii

17 Loja Zapotillo Cazaderos 35 250 240 558372 9551420 Tabebuia billbergii

18 Loja Zapotillo Cazaderos 17 100 232 558936 9552752 Tabebuia

billbergii

19 Loja Zapotillo Progreso 17 100 226 561093 9555078 Tabebuia

billbergii

20 Loja Zapotillo Progreso 15 50 274 563676 9555992 Tabebuia billbergii

23 Loja Zapotillo Zapotillo 14 80 381 583724 9528700 Tabebuia

billbergii

24 Loja Zapotillo Zapotillo 26 150 381 583347 9531542 Tabebuia

billbergii

37 Guayas Guayaquil Isla Puná

Agua Piedra 40 250 41

S 02° 46' 51.5''

W 80° 04' 49.3''

Tabebuia billbergii

38 Guayas Guayaquil Isla Puná

Agua Piedra 25 80 41

S 02° 46'

51.5''

W 80° 04'

49.3''

Tabebuia

billbergii

40 Guayas Guayaquil

Isla Puná

Campo Alegre

18 80 21 S 02° 47'

15.1''

W 80° 10'

53.3''

Tabebuia

billbergii

41 Guayas Guayaquil

Isla Puná

Campo

Alegre

5 60 21 S 02° 47'

15.1'' W 80° 10'

53.3'' Tabebuia billbergii

60 Loja Zapotillo Mangahurco 17 100 331 -4.14513 -80.43843 Tabebuia billbergii

61 Loja Zapotillo Mangahurco 20 100 359 -4.14734 -80.43992 Tabebuia

billbergii

62 Loja Zapotillo Mangahurco 20 80 323 -4.13499 -80.43976 Tabebuia

billbergii

63 Loja Zapotillo Mangahurco 20 80 351 -4.13466 -80.43622 Tabebuia

billbergii

Continúa

82

64 Loja Zapotillo Mangahurco 30 200 419 -4.12614 -80.43457 Tabebuia

billbergii

65 Loja Zapotillo Mangahurco 22 180 318 -4.12702 -80.44129 Tabebuia

billbergii

66 Loja Zapotillo Mangahurco 20 120 331 -4.12595 -80.44153 Tabebuia

billbergii

67 Loja Zapotillo Mangahurco 18 50 341 -4.14888 -80.43015 Tabebuia

billbergii

68 Loja Zapotillo Mangahurco 18 80 381 -4.15155 -80.42427 Tabebuia billbergii

69 Loja Zapotillo Mangahurco 24 200 363 -4.15091 -80.42294 Tabebuia billbergii

70 Loja Zapotillo Mangahurco 25 180 345 -4.15426 -8042637 Tabebuia

billbergii

71 Loja Zapotillo Mangahurco 30 170 337 -4.16048 -80.42787 Tabebuia

billbergii

72 Loja Zapotillo Mangahurco 25 80 440 -4.16705 -80.41523 Tabebuia

billbergii

73 Loja Zapotillo Mangahurco 38 300 427 -4.16615 -80.39061 Tabebuia

billbergii

74 Loja Zapotillo Mangahurco 9 50 336 -4.14617 -80.41804 Tabebuia billbergii

75 Loja Zapotillo Mangahurco 35 250 381 -4.14621 -80.41503 Tabebuia billbergii

76 Loja Zapotillo Mangahurco 17 100 515 -4.13668 -80.40402 Tabebuia

billbergii

77 Loja Zapotillo Mangahurco 17 100 491 -4.13527 -80.40220 Tabebuia

billbergii

78 Loja Zapotillo Mangahurco 15 50 706 -4.12580 -80.38107 Tabebuia

billbergii

79 Loja Zapotillo Mangahurco 16 80 447 -4.14200 -80.43112 Tabebuia

billbergii

80 Loja Zapotillo Mangahurco 10 50 623 -4.11438 -80.42173 Tabebuia billbergii

81 Loja Zapotillo Mangahurco 14 80 386 -4.15881 -80.42217 Tabebuia billbergii

82 Loja Zapotillo Mangahurco 26 150 467 -4.12080 -80.40729 Tabebuia

billbergii

83 Loja Zapotillo Mangahurco 25 50 492 -4.10839 -80.40102 Tabebuia

billbergii

84 Loja Zapotillo Mangahurco 17 100 618 -4.11455 -80.41543 Tabebuia

billbergii

85 Loja Zapotillo Mangahurco 17 100 644 -4.10962 -80.41760 Tabebuia

billbergii

86 Loja Zapotillo Cazaderos 15 50 241 -4.08103 -80.47330 Tabebuia billbergii

87 Loja Zapotillo Cazaderos 16 80 207 -3.99802 -80.39475 Tabebuia billbergii

88 Loja Zapotillo Cazaderos 10 50 182 -3.99438 -80.39560 Tabebuia

billbergii

89 Loja Zapotillo Cazaderos 14 80 180 -3.99125 -80.37583 Tabebuia

billbergii

90 Loja Zapotillo Cazaderos 26 150 169 -3.98543 -80.36174 Tabebuia

billbergii

91 Loja Zapotillo Cazaderos 18 100 200 -3.99799 -80.34353 Tabebuia

billbergii

101 Guayas Guayaquil Isla Puna Campo

Alegre

18 80 41 -2.78111 -80.08056 Tabebuia billbergii

102 Guayas Guayaquil Isla Puna Campo

Alegre

5 60 41 -2.78111 -80.08056 Tabebuia billbergii

103 Guayas Guayaquil Isla Puna

Campo

Alegre

20 80 43 -2.79067 -80.19222 Tabebuia

billbergii

104 Guayas Guayaquil Isla Puna

Campo

Alegre

18 60 43 -2.79086 -80.19214 Tabebuia

billbergii

105 Guayas Guayaquil Isla Puna

Campo Alegre

12 60 36 -2.79061 -80.19250 Tabebuia

billbergii

106 Guayas Guayaquil Isla Puna

Campo Alegre

7 20 33 -2.79061 -80.19253 Tabebuia

billbergii

107 Guayas Guayaquil Isla Puna Campo

Alegre

12 30 40 -2.79106 -80.19219 Tabebuia billbergii

108 Guayas Guayaquil Isla Puna Campo

Alegre

30 100 37 -2.79122 -80.19231 Tabebuia billbergii

109 Guayas Guayaquil Isla Puna

Campo

Alegre

40 250 37 -2.79122 -80.19231 Tabebuia

billbergii

110 Guayas Guayaquil Isla Puna

Campo

Alegre

12 30 31 -2.79122 -80.19222 Tabebuia

billbergii

111 Guayas Guayaquil Isla Puna

Campo Alegre

30 100 25 -2.79001 -80.09003 Tabebuia

billbergii

112 Guayas Guayaquil Isla Puna

Campo Alegre

40 250 29 -2.79014 -80.09019 Tabebuia

billbergii

Continúa

83

113 Guayas Guayaquil Isla Puna

Campo

Alegre

25 80 42 -2.79061 -80.08992 Tabebuia

billbergii

114 Guayas Guayaquil Isla Puna

Campo

Alegre

8 40 40 -2.79089 -80.08983 Tabebuia

billbergii

115 Guayas Guayaquil Isla Puna

Campo Alegre

18 80 36 -2.79097 -80.08969 Tabebuia

billbergii

116 Guayas Guayaquil Isla Puna

Campo Alegre

5 60 37 -2.79111 -80.08956 Tabebuia

billbergii

117 Guayas Guayaquil Isla Puna Campo

Alegre

5 60 35 -2.79067 -80.08911 Tabebuia billbergii

118 Guayas Guayaquil Isla Puna Campo

Alegre

20 80 42 -2.79072 -80.08894 Tabebuia billbergii

119 Guayas Guayaquil Isla Puna

Campo

Alegre

18 60 38 -2.79078 -80.08950 Tabebuia

billbergii

120 Guayas Guayaquil Isla Puna

Campo

Alegre

17 100 26 -2.74717 -80.07633 Tabebuia

billbergii

121 Guayas Guayaquil Isla Puna

Campo Alegre

20 100 26 -2.74689 -80.07631 Tabebuia

billbergii

122 Guayas Guayaquil Isla Puna

Campo Alegre

20 80 35 -2.74703 -80.07642 Tabebuia

billbergii

123 Guayas Guayaquil Isla Puna Campo

Alegre

20 80 35 -2.74703 -80.07642 Tabebuia billbergii

124 Guayas Guayaquil Isla Puna Campo

Alegre

30 200 33 -2.74722 -80.07667 Tabebuia billbergii

125 Guayas Guayaquil Isla Puna

Campo

Alegre

22 180 41 -2.74725 -80.07672 Tabebuia

billbergii

126 Guayas Guayaquil Isla Puna

Campo

Alegre

20 120 41 -2.74725 -80.07672 Tabebuia

billbergii

127 Guayas Guayaquil Isla Puna

Campo Alegre

18 50 49 -2.74753 -80.07644 Tabebuia

billbergii

128 Guayas Guayaquil Isla Puna

Campo Alegre

18 80 42 -2.74758 -80.07664 Tabebuia

billbergii

129 Guayas Guayaquil Isla Puna Campo

Alegre

24 200 42 -2.74758 -80.07664 Tabebuia billbergii

130 Guayas Guayaquil Isla Puna Campo

Alegre

25 180 14 -2.71494 -80.09383 Tabebuia billbergii

131 Guayas Guayaquil Isla Puna

Campo

Alegre

30 170 11 -2.71747 -80.09278 Tabebuia

billbergii

132 Guayas Guayaquil Isla Puna

Campo

Alegre

25 80 10 -2.71783 -80.09350 Tabebuia

billbergii

133 Guayas Guayaquil Isla Puna

Campo Alegre

38 300 12 -2.71622 -80.09081 Tabebuia

billbergii

134 Guayas Guayaquil Isla Puna

Campo Alegre

9 50 15 -2.71600 -80.09078 Tabebuia

billbergii

135 Guayas Guayaquil Isla Puna Campo

Alegre

35 250 9 -2.71589 -80.09089 Tabebuia billbergii

136 Guayas Guayaquil Isla Puna Campo

Alegre

17 100 13 -2.71639 -80.09028 Tabebuia billbergii

137 Guayas Guayaquil Isla Puna

Campo

Alegre

17 100 2 -2.71497 -80.09292 Tabebuia

billbergii

138 Guayas Guayaquil Isla Puna

Campo

Alegre

15 50 6 -2.71528 -80.09267 Tabebuia

billbergii

139 Guayas Guayaquil Isla Puna

Campo Alegre

16 80 6 -2.71422 -80.08839 Tabebuia

billbergii

140 Guayas Guayaquil Isla Puna

Campo Alegre

10 50 8 -2.71294 -80.03731 Tabebuia

billbergii

141 Guayas Guayaquil Isla Puna Campo

Alegre

14 80 8 -2.71314 -80.03742 Tabebuia billbergii

142 Guayas Guayaquil Isla Puna Campo

Alegre

26 150 18 -2.71353 -80.03747 Tabebuia billbergii

143 Guayas Guayaquil Isla Puna

Campo

Alegre

25 50 9 -2.71300 -80.03764 Tabebuia

billbergii

144 Guayas Guayaquil Isla Puna

Campo

Alegre

17 100 6 -2.71314 -80.03800 Tabebuia

billbergii

145 Guayas Guayaquil Isla Puna

Campo Alegre

17 100 6 -2.72653 -79.97142 Tabebuia

billbergii

146 Guayas Guayaquil Isla Puna

Campo Alegre

15 50 11 -2.72631 -79.96967 Tabebuia

billbergii

147 Guayas Guayaquil Isla Puna Campo

Alegre

16 80 10 -2.72650 -79.96953 Tabebuia billbergii

148 Guayas Guayaquil Isla Puna Campo

Alegre

20 120 13 -2.72639 -79.96908 Tabebuia billbergii

149 Guayas Guayaquil Isla Puna

Campo

Alegre

18 50 9 -2.72717 -79.99139 Tabebuia

billbergii

150 Loja Zapotillo Paletilla 18 80 586 -4.17444 -80.29517 Tabebuia

billbergii

151 Loja Zapotillo Paletilla 24 200 586 -4.17450 -80.29531 Tabebuia

billbergii

152 Loja Zapotillo Bolaspamba 25 180 464 -4.17111 -80.38072 Tabebuia

billbergii

Continúa

84

153 Loja Zapotillo Bolaspamba 30 170 501 -4.16394 -80.39658 Tabebuia

billbergii

154 Loja Zapotillo Bolaspamba 25 80 501 -4.16397 -80.39650 Tabebuia

billbergii

155 Loja Zapotillo Bolaspamba 38 300 533 -4.16472 -80.40539 Tabebuia

billbergii

156 Loja Zapotillo Bolaspamba 9 50 530 -4.16400 -80.40250 Tabebuia

billbergii

157 Loja Zapotillo Mangahurco 24 200 465 -4.16794 -80.41161 Tabebuia billbergii

158 Loja Zapotillo Mangahurco 25 180 464 -4.16800 -80.41167 Tabebuia billbergii

159 Loja Zapotillo Mangahurco 30 170 471 -4.16781 -80.41150 Tabebuia

billbergii

160 Loja Zapotillo Mangahurco 25 80 474 -4.16772 -80.41144 Tabebuia

billbergii

161 Loja Zapotillo Mangahurco 38 300 472 -4.16781 -80.41131 Tabebuia

billbergii

162 Loja Zapotillo Mangahurco 9 50 467 -4.16772 -80.41189 Tabebuia

billbergii

163 Loja Zapotillo Mangahurco 7 80 465 -4.16769 -80.41192 Tabebuia billbergii

164 Loja Zapotillo Mangahurco 10 80 465 -4.16761 -80.41192 Tabebuia billbergii

165 Loja Zapotillo Mangahurco 18 100 466 -4.16758 -80.41189 Tabebuia

billbergii

166 Loja Zapotillo Mangahurco 10 80 465 -4.16742 -80.41175 Tabebuia

billbergii

167 Loja Zapotillo Mangahurco 8 60 352 -4.15747 -80.43697 Tabebuia

billbergii

168 Loja Zapotillo Mangahurco 10 80 353 -4.15742 -80.43703 Tabebuia

billbergii

169 Loja Zapotillo Mangahurco 10 120 347 -4.15731 -80.43756 Tabebuia billbergii

170 Loja Zapotillo Mangahurco 8 100 345 -4.15778 -80.43772 Tabebuia billbergii

171 Loja Zapotillo Mangahurco 10 60 346 -4.15789 -80.43750 Tabebuia

billbergii

172 Loja Zapotillo Mangahurco 7 80 340 -4.15786 -80.43797 Tabebuia

billbergii

173 Loja Zapotillo Mangahurco 15 100 342 -4.15781 -80.43803 Tabebuia

billbergii

174 Loja Zapotillo Mangahurco 18 80 344 -4.15792 -80.43836 Tabebuia

billbergii

175 Loja Zapotillo Mangahurco 12 80 344 -4.15781 -80.43853 Tabebuia billbergii

176 Loja Zapotillo Saucecito 8 80 331 -4.13503 -80.43967 Tabebuia billbergii

177 Loja Zapotillo Saucecito 15 100 323 -4.13517 -80.43928 Tabebuia

billbergii

178 Loja Zapotillo Saucecito 10 60 321 -4.13522 -80.43933 Tabebuia

billbergii

179 Loja Zapotillo Saucecito 12 200 318 -4.13542 -80.43931 Tabebuia

billbergii

180 Loja Zapotillo Saucecito 20 200 319 -4.13556 -80.43933 Tabebuia

billbergii

181 Loja Zapotillo Saucecito 22 300 320 -4.13550 -80.43969 Tabebuia billbergii

182 Loja Zapotillo Saucecito 8 80 320 -4.13547 -80.43967 Tabebuia billbergii

183 Loja Zapotillo Saucecito 8 60 321 -4.13553 -80.43978 Tabebuia

billbergii

184 Loja Zapotillo Mangahurco 12 80 430 -4.14203 -80.43111 Tabebuia

billbergii

185 Loja Zapotillo Mangahurco 15 100 437 -4.14211 -80.43119 Tabebuia

billbergii

186 Loja Zapotillo Mangahurco 12 150 431 -4.14225 -80.43122 Tabebuia

billbergii

187 Loja Zapotillo Mangahurco 6 60 433 -4.14222 -80.43128 Tabebuia billbergii

188 Loja Zapotillo Mangahurco 8 100 432 -4.14217 -80.43128 Tabebuia billbergii

189 Loja Zapotillo Mangahurco 15 150 439 -4.14228 -80.43017 Tabebuia

billbergii

190 Loja Zapotillo Mangahurco 20 120 438 -4.14228 -80.43033 Tabebuia

billbergii

191 Loja Zapotillo Mangahurco 12 120 436 -4.14233 -80.43044 Tabebuia

billbergii

192 Loja Zapotillo Mangahurco 10 80 444 -4.14242 -80.43039 Tabebuia

billbergii

Continúa

85

193 Loja Zapotillo Mangahurco 8 60 435 -4.14239 -80.43025 Tabebuia

billbergii

194 Loja Zapotillo Balneario el

Inca 12 80 485 -4.10844 -80.40119 Tabebuia

billbergii

195 Loja Zapotillo Balneario el

Inca 15 100 483 -4.10819 -80.40092 Tabebuia

billbergii

196 Loja Zapotillo Balneario el

Inca 15 120 501 -4.10758 -80.40178 Tabebuia

billbergii

197 Loja Zapotillo Balneario el Inca

10 110 489 -4.10603 -80.40147 Tabebuia billbergii

197a Loja Zapotillo Balneario el Inca

- 5 490 -4.10600 -80.40150 Tabebuia billbergii

197b Loja Zapotillo Balneario el

Inca - 5 490 -4.10608 -80.40147 Tabebuia

billbergii

197c Loja Zapotillo Balneario el

Inca - 12 486 -4.10606 -80.40144 Tabebuia

billbergii

198 Loja Zapotillo Balneario el

Inca 8 200 501 -4.12478 -80.40683 Tabebuia

billbergii

199 Loja Zapotillo Casaderos 15 200 241 -4.07886 -80.47203 Tabebuia

billbergii

220 Loja Zapotillo Casaderos 20 200 239 -4.07867 -80.47211 Tabebuia billbergii

201 Loja Zapotillo Casaderos 12 200 238 -4.07847 -80.47228 Tabebuia billbergii

202 Loja Zapotillo Casaderos 10 200 241 -4.07919 -80.47244 Tabebuia

billbergii

203 Loja Zapotillo Casaderos 12 120 238 -4.07922 -80.47294 Tabebuia

billbergii

204 Loja Zapotillo Casaderos 10 80 234 -4.07938 -80.47300 Tabebuia

billbergii

205 Loja Zapotillo Casaderos 8 60 249 -4.08119 -80.47330 Tabebuia

billbergii

206 Loja Zapotillo Casaderos 12 80 263 -4.08197 -80.47350 Tabebuia billbergii

207 Loja Zapotillo Casaderos 15 100 241 -4.08089 -80.47330 Tabebuia billbergii

208 Loja Zapotillo Casaderos 12 150 250 -4.08042 -80.47233 Tabebuia

billbergii

209 Loja Zapotillo Las Vegas 6 60 220 -4.01158 -80.40822 Tabebuia

billbergii

210 Loja Zapotillo Las Vegas 8 100 224 -4.01169 -80.40808 Tabebuia

billbergii

211 Loja Zapotillo Las Vegas 15 150 227 -4.01200 -80.40814 Tabebuia

billbergii

212 Loja Zapotillo Las Vegas 20 120 228 -4.01225 -80.40817 Tabebuia billbergii

213 Loja Zapotillo Las Vegas 12 120 229 -4.01183 -80.40850 Tabebuia billbergii

214 Loja Zapotillo Las Vegas 10 80 180 -3.99244 -80.39528 Tabebuia

billbergii

215 Loja Zapotillo Las Vegas 8 60 179 -3.99242 -80.39553 Tabebuia

billbergii

216 Loja Zapotillo Las Vegas 12 80 174 -3.99242 -80.39569 Tabebuia

billbergii

217 Loja Zapotillo Las Vegas 15 100 173 -3.99247 -80.39575 Tabebuia

billbergii

218 Loja Zapotillo Las Vegas 12 150 161 -3.99283 -80.3567 Tabebuia billbergii

219 Loja Zapotillo Las Vegas 6 60 151 -3.98636 -80.36118 Tabebuia billbergii

220 Loja Zapotillo Las Vegas 8 100 158 -3.98633 -80.3611 Tabebuia

billbergii

221 Loja Zapotillo Mangahurco 15 150 430 -4.16703 -80.41544 Tabebuia

billbergii

222 Loja Zapotillo Mangahurco 20 120 428 -4.16725 -80.41567 Tabebuia

billbergii

223 Loja Zapotillo Mangahurco 12 120 403 -4.16750 -80.41569 Tabebuia

billbergii

224 Loja Zapotillo Mangahurco 10 80 416 -4.16794 -80.41567 Tabebuia billbergii

225 Loja Zapotillo Mangahurco 8 60 413 -4.16817 -80.41578 Tabebuia billbergii

226 Loja Zapotillo Mangahurco 12 80 402 -4.16856 -80.41606 Tabebuia

billbergii

227 Loja Zapotillo Mangahurco 15 100 395 -4.16847 -80.41647 Tabebuia

billbergii

228 Loja Zapotillo Mangahurco 12 150 389 -4.16833 -80.41728 Tabebuia

billbergii

229 Loja Zapotillo Mangahurco 6 60 404 -4.16767 -80.41761 Tabebuia

billbergii

Continúa

86

230 Loja Zapotillo Balsa Real 8 100 306 -4.23883 -80.23917 Tabebuia

billbergii

231 Loja Zapotillo Balsa Real 15 150 305 -4.23917 -80.24069 Tabebuia

billbergii

233 Loja Zapotillo Balsa Real 12 120 312 -4.23797 -80.23994 Tabebuia

billbergii

234 Loja Zapotillo Balsa Real 10 80 330 -4.23794 -80.23967 Tabebuia

billbergii

235 Loja Zapotillo Balsa Real 8 60 340 -4.23756 -80.23883 Tabebuia billbergii

236 Loja Zapotillo Balsa Real 12 80 337 -4.23744 -80.23883 Tabebuia billbergii

237 Loja Zapotillo Balsa Real 15 100 317 -4.23864 -80.23906 Tabebuia

billbergii

238 Loja Zapotillo Balsa Real 12 150 318 -4.23867 -80.23922 Tabebuia

billbergii

239 Loja Zapotillo Balsa Real 6 60 309 -4.23858 -80.23958 Tabebuia

billbergii

240 Loja Zapotillo Garza Real 8 100 261 -4.29508 -80.23406 Tabebuia

billbergii

241 Loja Zapotillo Garza Real 15 150 260 -4.28722 -80.23961 Tabebuia billbergii

242 Loja Zapotillo Garza Real 20 120 251 -4.28719 -80.23964 Tabebuia billbergii

243 Loja Zapotillo Garza Real 12 120 250 -4.28756 -80.24039 Tabebuia

billbergii

244 Loja Zapotillo Garza Real 10 80 250 -4.28758 -80.24039 Tabebuia

billbergii

245 Loja Zapotillo Garza Real 8 60 250 -4.28750 -80.24039 Tabebuia

billbergii

246 Loja Zapotillo Garza Real 12 80 250 -4.28747 -80.24036 Tabebuia

billbergii

247 Loja Zapotillo Garza Real 15 100 250 -4.28742 -80.24036 Tabebuia billbergii

248 Loja Zapotillo Garza Real 12 150 250 -4.28736 -80.24039 Tabebuia billbergii

249 Loja Zapotillo Garza Real 6 60 250 -4.28731 -80.24039 Tabebuia

billbergii

250 El Oro Arenillas La Cuca 8 100 25 -3.48394 -80.10781 Tabebuia

billbergii

251 El Oro Arenillas La Cuca 15 150 25 -3.48392 -80.10794 Tabebuia

billbergii

252 El Oro Arenillas La Cuca 20 120 25 -3.48403 -80.10800 Tabebuia

billbergii

253 El Oro Arenillas La Cuca 12 120 25 -3.48444 -80.10814 Tabebuia billbergii

254 El Oro Arenillas La Cuca 10 80 27 -3.48389 -80.10819 Tabebuia billbergii

255 El Oro Arenillas La Cuca 8 60 24 -3.48333 -80.10828 Tabebuia

billbergii

256 El Oro Arenillas La Cuca 12 80 23 -3.48333 -80.10856 Tabebuia

billbergii

257 El Oro Arenillas La Cuca 15 100 25 -3.48308 -80.10864 Tabebuia

billbergii

258 El Oro Arenillas La Cuca 12 150 24 -3.48300 -80.10875 Tabebuia

billbergii

259 El Oro Arenillas La Cuca 6 60 27 -3.48356 -80.10869 Tabebuia billbergii

87

Anexo 2

Tampón de extracción Sorbitol del protocolo de extracción de ADN de

Mariac et al. (1999) modificado por Morillo (2002).

Componentes Cantidad (50 ml)

Sorbitol 3.18 g

Trizma base 0.60 g

EDTA 0.009 g

Bisulfito de sodio 0.25 g

88

Anexo 3

Tampón de lisis (CTAB 4%) del protocolo de extracción de ADN de

Mariac et al. (1999) modificado por Morillo (2002).

Componentes Cantidad (100 ml)

Trizma base 1.2 g

NaCl 7.2 g

EDTA 0.74 g

CTAB 4 g

89

Anexo 4.

Lista de los Primers ISSRs con los que se realizaron pruebas para el estudio

No. PRIMER TºA No. PRIMER TºA

1 ISSR 840 52 25 ISSR 859 37

2 ISSR 841 37 26 ISSR 877 37

3 ISSR 853 37 27 ISSR 827 37

4 ISSR 857 37 28 ISSR 842 37

5 ISSR 900 37 29 ISSR 844 37

6 ISSR HB12 37 30 ISSR 881 37

7 ISSR HB14 37 31 ISSR 886 37

8 ISSR 17899A 37 32 ISSR 894 37

9 ISSR 17899B 37 33 ISSR 852 37

10 ISSR 824 37 34 ISSR 854 37

11 ISSR 822 37 35 ISSR 814 37

12 ISSR 844B 37 36 ISSR 815 37

13 ISSR HB 11 37 37 ISSR 816 37

14 ISSR HB 9 37 38 ISSR 823 37

15 ISSR 884 37 39 ISSR 843 37

16 ISSR 875 37 40 ISSR 870 37

17 ISSR 889 37 41 ISSR 886 37

18 ISSR 834 37 42 ISSR 887 37

19 ISSR 856 37 43 ISSR 881 37

20 ISSR 865 37 44 ISSR 834 37

21 ISSR 863 37 45 ISSR 853 37

22 ISSR 17898A 37 46 ISSR 837 37

23 ISSR 17898B 37 47 ISSR 855 37

24 ISSR 810 37 48 ISSR 813 37

90

Anexo 5

a) Protocolo de extracción de ADN de Ferreira y Grattapaglia (1998)

Soluciones necesarias

- Tampón de extracción CTAB 2X

- CIA (24:1)

- ISOPROPANOL

- TE (0.1 M)

Procedimiento:

1. Añadir 700 l de buffer a 0.05 g de tejido seco de cada material.

2. Incubar a 65 ºC por 1 hora agitando cada 30 minutos.

3. Centrifugar a velocidad tope por 15 minutos.

4. Tomar el sobrenadante y añadir 600 l de CIA (24:1). Homogeneizar.

5. Centrifugar a 13000 rpm por 5 minutos.

6. Repetir el paso 4 y 5.

7. Adicionar 400 l de isopropanol (2/3 volumen de sobrenadante).

8. Centrifugar por 4 minutos a 13000 rpm Si el pellet no es visible colocar

el tubo a -20 ºC durante 30 minutos y centrifugar nuevamente.

9. Retirar el isopropanol y lavar dos veces con 1 ml de etanol 70% la

pastilla de ADN formada.

10. Secar en la microestufa por 30 minutos a 37 C.

11. Resuspender el ADN en 100 l de TE a temperatura ambiente por toda la

noche.

12. Cuantificar el ADN en un gel de agarosa 1%

91

Anexo 5

b) Protocolo de extracción de ADN de Graham (1993)

Procedimiento:

1. Macerar las hojas secas y obtener 200mg de muestra

2. Añadir 700 l de buffer de extracción.

3. Incubar a 65 ºC por 1 hora agitando cada 30 minutos.

4. Centrifugar a 4000 rpm por 10 minutos.

5. Tomar el sobrenadante y añadir 300 l de CIA (24:1). Homogeneizar.

6. Centrifugar a 4000 rpm por 10 minutos.

7. Tomar el sobrenadante y añadir 50 l de acetato de amonio 7.5 M y 500

l de etanol al 100%.

8. Colocar a -20 °C por 1 hora

9. Centrifugar por 10 minutos a 13000 rpm.

10. Retirar el etanol al 100% y lavar dos veces con 1 ml de etanol al 70% la

pastilla de ADN formada.

11. Secar en la microestufa por 30 minutos a 37 C.

12. Resuspender el ADN en 200 l de TE y añadir 2l de RNAsa y colocar a

baño maría a 65 °C por 15 minutos.

13. Cuantificar el ADN en un gel de agarosa 1%.

92

Anexo 5

c) Protocolo de extracción de ADN de Álzate Marín (2001)

Procedimiento:

1. Macerar en un mortero 200 mg de tejido seco

2. Añadir 900 l de buffer de extracción mas 2l B- marcaptoetanol.

3. Incubar a 65 ºC por 1 hora agitando cada 30 minutos.

4. Centrifugar a velocidad tope por 15 minutos.

5. Tomar el sobrenadante y añadir 800 l de CIA (24:1). Homogeneizar.

6. Centrifugar a 13000 rpm por 5 minutos.

7. Repetir el paso 4 y 5.

8. Adicionar 400 l de isopropanol (2/3 volumen de sobrenadante).

9. Centrifugar por 4 minutos a 13000 rpm Si el pellet no es visible colocar el

tubo a -20 ºC durante 30 minutos y centrifugar nuevamente.

10. Retirar el isopropanol y lavar dos veces con 1 ml de etanol 70% la pastilla de

ADN formada.

11. Secar en la microestufa por 30 minutos a 37 C.

12. Resuspender el ADN en 100 l de TE a temperatura ambiente por toda la

noche.

13. Cuantificar el ADN en un gel de agarosa 1%

93

Anexo 6

Amplificación de 214 genotipos de guayacán con 10 primers ISSR

seleccionados para el estudio, mediante electroforesis horizontal en geles de

agarosa al 1.5%.

94

Continuación Anexo 6

Amplificación de 214 genotipos de guayacán con 10 primers ISSR

seleccionados para el estudio, mediante electroforesis horizontal en geles de

agarosa al 1.5%.

95

Continuación Anexo 6

Amplificación de 214 genotipos de guayacán con 10 primers ISSR

seleccionados para el estudio, mediante electroforesis horizontal en geles de

agarosa al 1.5%.

96

Continuación Anexo 6

Amplificación de 214 genotipos de guayacán con 10 primers ISSR

seleccionados para el estudio, mediante electroforesis horizontal en geles de

agarosa al 1.5%.

97

Continuación Anexo 6

Amplificación de 214 genotipos de guayacán con 10 primers ISSR

seleccionados para el estudio, mediante electroforesis horizontal en geles de

agarosa al 1.5%.

98

Continuación Anexo 6

Amplificación de 214 genotipos de guayacán con 10 primers ISSR

seleccionados para el estudio, mediante electroforesis horizontal en geles de

agarosa al 1.5%.

1 1 1 0 1 0 1 0 1 0 1 1 0 0 0 1 1 1 0 0 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 1 0 0 0 1 1 0 1 0 1 1 0

2 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0

5 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0

6 1 0 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 0

7 1 0 1 1 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 1 1 1 1 0 0 1 0

9 1 1 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 0 1 1 1 1 0 0 1 1

11 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0

12 1 0 1 1 0 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 1 1 0 0 1 0 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1

13 1 0 0 1 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 1 1 1 0 1 1 1

14 1 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 1 1 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 1 1 0

15 3 1 0 1 0 1 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 1 1 1 1 1 0 1 1 0

17 3 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0

18 3 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 1 1 0 1 0 1 1 1

19 1 1 1 1 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 0 1 0 1 1 1

20 1 0 1 1 0 1 0 1 0 1 1 0 0 1 0 1 1 0 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0

23 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 1 0 1 0 1 1 0

24 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0

37 2 0 1 1 1 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 1 0 1 1 0 1 0 1 0

38 2 0 1 1 1 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 1 0 0 1 1 1 1 0 0 1 1 0

40 2 1 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 1 1 1 1 1 0 0 1 0

41 2 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 1 1 1 1 0 0 0 1 0

60 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1

61 1 0 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 1 1 1 0 1 1 0

62 1 1 1 1 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 1 0 1 0 1 1 1 1 0 1 1 0

63 1 0 1 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1

64 1 0 1 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0

65 1 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1

66 1 0 0 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1

67 1 0 0 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 1 1 0

68 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0

69 1 0 1 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0

70 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 1

71 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 0

72 1 0 1 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0

73 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0

74 1 0 1 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1

75 1 0 1 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 1

76 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 1

77 1 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 1 1 0

78 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1

79 1 0 1 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 1 1 0 1 0 1 1 0

80 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 1 1 1 0 0 0 1 1

81 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 1 1 1 1 0 1 1 1

82 1 0 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0

83 1 0 0 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

84 1 0 0 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

85 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0

86 3 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0

87 3 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0

88 3 0 1 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0

89 3 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0

90 3 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0

91 3 0 1 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0

101 2 0 0 1 0 1 0 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0

102 2 0 1 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0

103 2 0 0 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

104 2 0 0 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0

105 2 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 1 0 1 0

106 2 0 0 1 0 1 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1

107 2 1 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0

108 2 1 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0

109 2 0 1 1 0 1 0 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0

110 2 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0

111 2 0 0 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0

112 2 0 1 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

113 2 0 1 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0

114 2 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0

115 2 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0

116 2 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0

117 2 0 1 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0

118 2 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

119 2 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

120 2 0 1 1 0 1 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1

121 2 0 1 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0

122 2 0 1 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 1

123 2 0 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1

124 2 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1

125 2 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0

126 2 0 1 1 0 1 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 1 1 0 1 0 1 1 0

127 2 0 1 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0

128 2 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 1

129 2 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0

130 2 0 1 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 1 1

131 2 0 1 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 0 0 1 0 1 1 0 1 0 1 0 1

132 2 0 1 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 1 0 1 1 0

133 2 0 1 1 0 1 0 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0

134 2 0 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 0 1

CONTINÚA .

ISSR 900 ISSR 17899A ISSR17899B

Matriz binaria de los 214 genotipos de guayacán (Tabebuia billbergii )

Anexo 7:

Muestra Pob. ISSR824 ISSR HB12ISSR853 ISSR841 ISSR HB14 ISSR840 ISSR853

136 2 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 0 1 0 0 1 0 1 1 1

137 2 0 1 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1

138 2 0 1 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 1 1 1 1 0 1 1 0

139 2 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 0 1 0 1 0 0 1 1 1

140 2 0 1 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1 1

141 2 0 1 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1

142 2 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 1 1 1 1 0 1 1 1

143 2 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 0

144 2 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1

145 2 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 0 1 1 1

146 2 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0

147 2 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 1

148 2 0 1 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 1

149 2 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 1 1 0

150 1 0 1 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 0 1 1 0

151 1 1 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0 1 1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0

152 1 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0

153 1 0 1 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0

154 1 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 1 0 0

155 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1

156 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 0 1 1 0

157 1 0 1 1 0 1 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 0 0 1 1 0

158 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1

159 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 0 1 1 1

160 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 1

161 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 1 1 1

162 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0

163 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 1 1 0 1 0 1 1 0

164 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 1 1 0 1 0 1 1 1

165 1 1 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 0

166 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 1 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 1 1 0

167 1 0 1 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0

168 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0

169 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0

170 1 0 1 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

171 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 1 1 0 1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0

172 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0

173 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0

174 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0

175 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 1 0 0

176 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0

177 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1

178 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0

179 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0

180 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 0 1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0

181 1 1 0 1 0 1 0 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 0 1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0

182 1 1 0 1 0 1 0 1 0 1 1 1 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 0 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 0

183 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 1 1 1 1 1 0 1 1 0

184 1 1 0 1 0 1 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 1 1 1 1 1 0 1 1 0

185 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 1 1 0 0 1 0 0 1 1 0

186 1 0 1 1 0 1 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0

187 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 1 1 0

188 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0

189 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0 0 1 1 1 0

190 1 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 0

191 1 0 1 1 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 1 1 0

192 1 0 1 1 0 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 1 1 1 1 0 0 1 1 0

193 1 0 1 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 1 1 1 1 0 0 1 1 0

194 1 0 1 1 0 0 1 1 0 1 1 1 0 0 1 1 1 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0

195 1 0 1 1 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 1

196 1 0 1 1 1 1 0 1 0 1 1 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0

197 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 0

197a 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 1 1 1 0 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

197b 1 0 1 1 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 1 1 1 1 1 0 1 1 0

197c 1 0 1 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 1 1 0 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1

198 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0

199 3 0 1 1 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 1 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1 1 0 0 1 1 1

200 3 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 1 0

201 3 0 1 1 1 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 0 0

202 3 0 1 1 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0

203 3 0 1 1 0 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 1 1 1 1 0 0 1 1 1

204 3 0 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 1 0 0

205 3 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0

206 3 0 1 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1

207 3 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1

208 3 1 0 1 1 1 0 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 1 1 0

209 3 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 1 1 1

210 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0

211 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0

212 1 1 0 1 1 1 0 1 0 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 1 0

213 1 1 0 1 1 1 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 1

214 1 1 0 1 1 1 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 0

215 1 1 0 1 1 1 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1

216 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0

217 1 0 0 1 1 0 0 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 0 0 1 0 1 1 1

218 1 0 0 1 1 0 0 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 1 1 0 0 0 1 0 1 0 1

219 1 1 0 1 1 1 0 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 1 1 1 0 0 1 0 1 1 0

CONTINÚA .

ISSR853 ISSR 900 ISSR 17899A

Anexo 7:

Matriz binaria de los 214 genotipos de guayacán (Tabebuia billbergii )

Muestra Pob. ISSR824 ISSR853 ISSR841 ISSR HB14 ISSR840 ISSR17899B ISSR HB12

221 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0

222 1 0 0 1 1 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1

223 1 0 1 1 1 0 0 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 1 1 1

224 1 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 0 1 0 1 0 0 0 0 1 0 1 1 0

225 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1

226 1 1 0 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 1 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 1 1 0

227 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 1 1 1

228 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 0 1 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0

229 1 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0

230 1 0 0 1 0 1 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0

231 1 1 0 1 0 1 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0

233 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0

234 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0

235 1 1 0 1 0 1 0 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

236 1 0 1 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1

237 1 0 1 1 0 0 1 1 0 0 1 1 0 0 0 1 1 1 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0

238 1 0 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1

239 1 1 0 1 0 0 1 1 0 0 1 1 0 0 0 1 1 1 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0

240 4 0 0 1 0 1 1 0 1 0 1 1 0 0 0 1 1 1 0 0 0 1 1 1 0 1 0 1 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0

241 4 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 1

242 4 1 1 1 0 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0

243 4 1 0 1 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1

244 4 1 0 1 0 0 1 1 0 0 1 1 0 1 0 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0

245 4 1 0 1 1 1 1 1 0 0 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1

246 4 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 1 1 0

247 4 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 1 0 1 1 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 1 1 0

248 4 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 1 1 1

249 4 1 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 1 1

250 5 0 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1

251 5 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 1 1 0

252 5 1 0 1 1 1 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 1 0 1

253 5 1 0 1 0 1 0 1 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 1 0 1

254 5 1 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1

255 5 0 1 1 0 1 0 1 0 0 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0

256 5 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 1 1

257 5 0 0 1 0 0 1 1 0 0 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 0

258 5 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1

259 5 0 1 1 0 1 1 1 0 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0

ISSR17899B ISSR HB12

Matriz binaria de los 214 genotipos de guayacán (Tabebuia billbergii )

Muestra Pob. ISSR824 ISSR853 ISSR841 ISSR HB14 ISSR 840 ISSR853 ISSR 900 ISSR 17899A

Anexo 7: