degradasi mrna pada bakteri
DESCRIPTION
degradasiTRANSCRIPT
Degradasi mRNA pada BakteriOleh: Reinhard Rauhut, Gabriele Klug
AbstrakRNA messenger pada prokariotik menunjukkan paruh waktu yang pendek bila dibandingkan dengan mRNA eukariotik. Sudah ada kemajuan selama beberapa tahun terakhir dalam pemahaman tentang degradasi mRNA pada bakteri. Terdapat dua aspek utama dalam menentukan masa hidup messenger pada sel bakteri. Di sisi substrat, fitur struktural mRNA memiliki pengaruh besar pada stabilitas molekul. Di sisi lain, terdapat komponen degradasi pada bakteri. Kemajuan dalam karakterisasi biokimia protein yang terlibat dalam degradasi mRNA telah terlihat jelas bahwa degradasi RNA adalah proses selular yang sangat terorganisir di mana terdiri dari beberapa komponen protein, dan tidak hanya inti sel yang terlibat. Pada bakteri Escherichia coli, protein ini mengatur kompleks massa molekul tinggi, yaitu degradosome. Enzim yang menjadi kunci untuk proses awal degradasi mRNA dan untuk pembuatan degradosome adalah endoribonuclease E. Kami membahas komponen pengidentifikasian degradosome dan cara kerjanya. Sejak penelitian degradasi mRNA yang sering melibatkan E. coli kami juga meneliti pada organisme lain untuk melihat apakah bakteri lain mungkin bisa mengikuti standar model seperti pada E. coli.
Kata Kunci: Degradasi mRNA; Degradosome; Rnase E; PNPase; Ribonuclease
1. Degradasi mRNA pada bakteri
Dibandingkan dengan eukariot, menunjukkan messenger RNA (mRNA)
paruh berada dalam kisaran jam, bakteri menunjukkan ketidakstabilan mRNA
yang cukup besar pada in vivo dengan rata-rata waktu paruh dalam beberapa
menit saja. Konsentrasi yang bagus pada messenger berbanding lurus dengan
waktu paruhnya. Messenger adalah bagian dari strategi bakteri untuk merespon
dengan cepat untuk segera mengubah parameter lingkungan. Untuk memenuhi
persyaratan dalam perubahan isi selular, sintesis protein dapat dengan cepat
diprogram dengan perubahan yang cepat dalam pola mRNA.
Degradasi mRNA tampaknya merupakan peran utama dalam regulasi
ekspresi gen dalam dua cara. Pertama, saat sebuah molekul mRNA dapat
berfungsi sebagai template untuk menterjamahkan ribosom ditentukan oleh
stabilitas yang terkandung di dalamnya. Perlengkapan dari degradasi RNA selular
akan menghilangkan setiap messenger secara cepat atau lambat dari sirkulasi sel,
tergantung dalam menstabilkan atau destabilisasi fitur struktural RNA. Kedua,
mRNA degradasi, diatur sendiri oleh parameter lingkungan, dapat menyediakan
sarana untuk secara aktif beradaptasi menterjemahkan selular dengan perubahan
sesuai kebutuhan bakteri. Meskipun tidak ada bukti bahwa parameter lingkungan
secara langsung mengendalikan tingkat translasi pada prokariota, seperti pengaruh
1 Universitas Syiah Kuala
2
pada stabilitas spesies mRNA yang telah diamati. Tingkat peluruhan puf mRNA
misalnya pada bakteri Rhodobacter capsulatus secara signifikan ditingkatkan
dengan adanya oksigen.1 Messenger polisistronik ini mengkode beberapa
komponen protein kompleks fotosintesis pada bakteri ungu ini dan optimal
dinyatakan hanya di bawah kondisi tekanan oksigen yang rendah. Stabilitas CSPA
mRNA, pengkodean protein besar cold-shock pada Escherichia coli, sementara
meningkat setelah menurunkan suhu pertumbuhan.2 mRNA pada RNA binding
protein Rbp dari Anabaena variabilis secara khusus stabil setelah menurunkan
suhu pertumbuhan.3 E. coli pada kucing dan Bacillus subtilis thrS mRNA
menunjukkan peningkatan stabilitas dalam kondisi kelaparan.4,5 Ini mungkin
mengisyaratkan fenomena umum untuk mRNA lainnya, ketika sel-sel di bawah
kondisi C atau N kelaparan.6,7 Perlu dicatat bahwa dalam sistem eukariotik urutan
RNA telah diidentifikasi sebagai sensor langsung pada keadaan stres lingkungan.8
Banyaknya transkrip primer polisistronik adalah keganjilan pada
prokariotik. Tidak hanya 5´ dan 3´ yang diterjemahkan tetapi juga daerah
intercistronic yang mengatur urutan daerah pengkodean. Asosiasi beberapa gen
dalam satu transkrip tidak berarti bahwa jumlah molar yang sama dari masing-
masing protein yang diterjemahkan. Ribosom mungkin mengikat secara
independen untuk setiap awal cistron individu dan melepaskan diri dari transkrip
di berbagai situs pemutusan internal. Fine tuning pada perbedaan terjemah
inisiasi, elongasi, dan terminasi kinetik dari segmen individu dapat menyebabkan
jumlah molar yang berbeda yang diterjemahkan oleh protein. Pengaturan
autogenous subset dari protein dalam messengers polisistronik menambah
khasanah mekanisme dari kontrol translasi. Mekanisme tersebut telah dipelajari
secara ekstensif dalam operon seperti protein E. coli ribosom atau E. coli operon
ATP (ATPase).9,10
Dalam transkrip polisistronik degradasi mRNA membuat kontribusi yang
signifikan untuk perbedaan ekspresi gen. Studi ekstensif selama bertahun-tahun
terakhir pada puf mRNA polisistronik R. capsulatus mengungkapkan bahwa
stabilitas perbedaan segmental diberikannya salah satu pengaruh yang
menentukan stoikiometri protein selama terjemahan dari fragmen yang
bersangkutan (Gambar. 1).11 Protein dikodekan dalam transkrip polisistronik ini
Universitas Syiah Kuala
3
dibutuhkan dalam jumlah stoikiometri yang berbeda untuk merakit fotosintesis
kompleks yang fungsional. Sebagai konsekuensi dari banyaknya mRNA
menstabilkan dan mendestabilisasi elemen struktur dalam transkrip primer,
kegiatan nucleolytic membagi RNA polisistronik menjadi mRNA yang lebih
kecil. Segmen ini menunjukan paruh waktu yang sangat berbeda, yang pada
gilirannya menyebabkan jumlah molar berbeda yang diterjemahkan oleh protein.
Gambar. 1. Operon puf sebagai contoh dalam menstabilkan dan mendestabilisasi struktur RNA. Struktur ini mempengaruhi stabilitas segmental diferensial dari messanger polisistronik. Operon ini mengkodekan protein LH I dan RC pad fotosintesis kompleks di R. capsulatus. Protein kode oleh B dan A yang dibutuhkan dalam perbandingan molar 15:1 atas protein kode oleh segmen L dan M. Hal ini terlihat kembali pada paruh segmen mRNA yang sesuai. Sementara transkrip primer dan transkrip tersebut dipangkas menjadi 2,7 kb memiliki paruh kurang dari setengah menit atau 8 menit masing-masing, dirampingkan pufBA memiliki paruh 33 menit dan karena itu tersedia lebih lama untuk terjemahan. Jepitan merah menstabilkan urutan hulu. Jepitan hijau membentuk kompleks penstabil 5´. Kotak kuning menandakan pembelahan internal pada RNase E yang bertanggung jawab untuk membatasi tingkat kerusakan dari messenger 2,7 kb.
Efek serupa telah dipelajari di sejumlah transkrip polisistronik lainnya
seperti pada E. coli mal-EFG, Salmonella histadin pada transportasi operon,
transkrip E. coli ftsA-ftsZ, Acinetobacter calcoaceticus hapusan operon, dan
Alcaligenes eutrophus hoxS mRNA.12 -16
Untuk menggambarkan perlengkapan degradasi mRNA dalam sel bakteri
perlu melihat dua aspek. Pertama, kita harus memahami sifat dan distribusi
menstabilkan atau mendestabilisasi elemen struktural dalam mRNA. Kemudian
kami juga harus menyelidiki mana ribonucleases yang terlibat dalam degradasi Universitas Syiah Kuala
4
mRNA. Meskipun pembelahan ikatan internucleotide memerlukan tindakan dari
endo atau exoribonuclease, hasil terakhir telah menyatakan dengan jelas bahwa
degradasi RNA juga memerlukan enzim selain itu.
Sejak subjek dari stabilitas mRNA telah diteliti dengan hasil penelitian
terakhir kali telah memberikan gambaran umum tentang degradasi mRNA yang
sangat berpengaruh dalam sel bakteri.17,18 Di lapangan, terdapat sedikit fakta
meskipun bahwa E. coli mendominasi penelitian. Hasil yang diperoleh dari E.
coli, menggunakan beberapa model RNA, mungkin tidak dapat mewakili sama
sekali untuk bakteri lainnya.
Percobaan degradasi pada mRNA sangat sering dibutuhkannya
pengukuran paruh waktu pada mRNA. Hal ini dapat dicapai baik dengan
percobaan pada in vivo ataupun in vitro. Selama studi in vivo, inisiasi transkripsi
dari mRNA pada sel hidup akan terhenti dengan adanya penambahan inhibitor
transkripsi pada kultur hidup dengan waktu nol. Kultur aliquots tersebut
kemudian dihapus pada berbagai titik waktu untuk mengisolasi RNA dan
memisahkan dengan gel. Teknik hibridisasi menggunakan probe berlabel, khusus
untuk mRNA tertentu yang penting, yang kemudian digunakan untuk mendeteksi
dan mengukur keberadaan dan pembusukan kinetika mRNA ini (kimia paruh).
Sejak RNases menunjukkan kegiatan yang tumpang tindih atau bahkan bisa saling
menggantikan, sulit untuk membedakan efek secara individu yang mungkin
dimiliki pada degradasi mRNA. Penghapusan satu atau lebih gen nuklease dari
strain dengan latar belakang genetik yang identik dapat meningkatkan interpretasi
pola degradasi kompleks dari model substrat. Strain bakteri yang membawa gen
mutan dengan protein yang sensitif pada temperatur dapat terlibat dalam degradasi
mRNA dikarenakan pergeseran suhu sehingga memperlihatkan dampak dari gen
ts pada jalur degradasi dan kinetika kerusakan dari mRNA.19 Dalam percobaan in
vitro terdapat keuntungan dari kemudahan tersedianya RNA transkrip, yang
pernah menjadi RNA kloning di bawah kendali promotor fag seperti T7 atau SP6.
Pencetakan transkrip berlabel dapat dibuat dengan transkripsi in vitro. Tergantung
pada konstruksi, hanya bagian dari messenger, 5´ dan daerah 3´ diterjemahkan
(UTR), atau wilayah polisistronik lengkap dapat dimasukkan. Substrat in vitro ini
kemudian diinkubasi dengan ekstrak bakteri atau protein dan dimurnikan selama
Universitas Syiah Kuala
5
uji degradasi in vitro. Pendekatan ini adalah keuntungan besar ketika mempelajari
efek letak mutasi pada substrat RNA dan pada degradasi mRNA. Menggunakan
ekstrak daripada melakukan pemurnian dapat menyebabkan hasil yang tidak jelas
karena adanya aktifitas tumpang tindih dari berbagai komponen. Ujung 5´- dan 3´-
pada fragmen RNA yang diamati dapat ditentukan dengan menggunakan analisis
ekstensi primer dan pemetaan S1 nuklease, sehingga memperlihatkan posisi dari
tempat pembelahan pada substrat in vitro.
Hal ini sangat bertentangan bahwa sebuah molekul mRNA berupa lurus
seperti jarum rajut. Kebanyakan RNases bertindak sebagai pematangan nukleus
RNA. Sebagian beser molekul RNA pada organisme ditranskripsi sebagai
molekul prekursor biologis yang tidak aktif, dalam rangka sebagai tugas biologis,
pertama mereka yang membutuhkan pengolahan secara luas, secara internal atau
dengan cara mereka sendiri. Seperti halnya bagi sebagian besar interaksi protein-
RNA, pengenalan antara substrat RNA dan aktifitas pembentukan nucleolytic
selama pematangan serta degradasi tidak hanya mengandalkan pengenalan dari
urutan utama. Sangat sering tempat terjadinya pembelahan nucleolytic sebenarnya
sudah dikemas dengan cukup banyak di sekitar struktur sekunder dan tersier.
Ragam standar struktur elemen sekunder seperti batang, lekukan, tonjolan dan
daerah ss di berbagai stabilitas termodinamika cukup untuk menciptakan
bermacam-macam sinyal RNA yang terstruktur.
Untuk memahami pengaturan ekspresi dari produk gen dapat diketahui
dengan mempelajari degradasi mRNA yang sesuai. Sebuah analisis kemungkinan
dari struktur sekunder, dibandingkan dengan daerah-daerah dalam genom
organisme lain yang sesuai dapat menunjukkan adanya kemungkinan dari fitur
pengaturan RNA ini. Setelah struktur tersebut adalah benar terbukti, mereka tentu
saja akan memerlukan verifikasi dengan menggunakan metode kimia dan enzim
padaa struktur RNA. Hasil struktur yang terbukti pada pengaturan stabilitas terkait
juga dapat diperoleh dengan menggunakan analisis mutasi.
2. Ujung 5´ dari mRNA
Untuk mengatur arah menuju degradasi mRNA kita memulai dari ujung 5´
pada messenger. Trifosfat dalam posisi 5´ dari nukleotida pertama merupakan
Universitas Syiah Kuala
6
awal dari messenger. Fragmen internal, yang dihasilkan dari transkrip
dirampingkan, bukan membawa monofosfat 5´. Hal yang sepele ini akan menjadi
jelas setelah kami melihat aktivitas enzim katalitik seperti RNase E. Pangkodean
daerah dengan terjemahan kodon awal didahului oleh 5´-UTR. 5´-UTR ini meluas
sampai beberapa ratus nukleotida dan dapat menunjukkan sedikit struktur
sekunder. Bagian dari 5´-UTR ini juga merupakan urutan Shine-Dalgarno (SD),
yang dekat dengan ruang pada 5´ ke kodon awal. Ujung 5´ tidak hanya berfungsi
sebagai titik masuk yang potensial untuk nukleus degradatif, tetapi juga otomatis
menjadi titik yang lebih disukai dalam menggunakan langkah-langkah protektif,
tetapi tentu juga titik masuk untuk ribosom selama terjadinya proses terjemahan.
Oleh karena itu tidak mengherankan bahwa penelitian tentang kemungkinan
penstabilan struktur dari 5´ selalu harus mengatasi kemungkinan adanya
pengaruh dalam menerjemahkan ribosom. Sebuah ribosom melindungi
sekumpulan messenger RNA ke tingkat 15 nt pertama ke tempat nukleotida P.20
Meskipun, bertentangan dengan eukariota, kegiatan exonuclease 5´3´ di
prokariota tidak pernah ditemukan, degradasi mRNA sering menunjukkan secara
langsung pada 5´3´. Selama bertahun-tahun model standar dari perusakan
mRNA prokariotik digambarkan kerusakan yang diakibatkan aksi gabungan dari
endo dan exoribonucleases.
Langkah pertama pada endonuclease – kita secara umum menganggap
pada RNase E akan mengenali tempat pembelahan dan tingkatan dalam
menentukan potongan terjadinya endonucleolytic. Sering daerah ini merupakan
bagian atas dari stem loop yang dilindungi oleh ujung 3´, tetapi sering terlalu
dekat dengan ujung 5´, bahkan dekat dengan bagian atas dari stem loop 5´. Dalam
kasus yang pertama, pembelahan kemudian diikuti dengan langkah kedua dari
degradasi yang cepat exonucleolytic melalui exoribonuclease 3´C5´. Dalam kasus
terakhir, RNase E mengenali akses dari ujung 5´ dan setelah dilakukan
pembelahan akhir, selanjutnya degradasi fragmen oleh exonuclease 3´5´.21,22
Setelah pemotongan awal pada ujung 5´, endonuclease akan mengikuti rantai
ribosom menuju ke depan tempat RNase E. Pembacaan mRNA dari ujung 5´
selama pada tempat pembelahan lanjutan, RNase E akan menciptakan kesan
kemajuan dalam degradasi 5´3´. Kegiatan pada ujung 5´ telah dipelajari dalam
Universitas Syiah Kuala
7
beberapa model. Salah satunya adalah RNA 1, regulator antisense dari ColE1.
RNA ini terdiri sembilan nukleotida untai tunggal pada ujung 5´, yang meliputi
daerah RNase E, diikuti oleh 99 nt yang dilipat menjadi tiga batang-loop (lihat
Gambar. 2). Pengantar stem loop pada daerah tertinggi 5´-terminus dapat
menstabilkan RNA ini, bahkan ketika peregangan untai tunggal diperpanjang.21
Seperti pada daerah stem loop oleh sebab itu akan bertindak sebagai stabilisator 5
´. Tingkat degradasi transkrip dengan ujung 5´ untai tunggal bersifat independen
dari urutan pada daerah ss, jarak ke tingkat atas dari tempat pembelahan internal
RNase E, dan potensi urutan yang mengarah ke tempat pembelahan ini dapat
membentuk struktur sekunder . Dengan sistem yang memiliki bukti cukup untuk
menyatakan bahwa endonuclease RNase E yang bertanggung jawab untuk pola
degradasi pada ujung 5´ messenger bakteri. Meskipun lebih mudah untuk
memahami bahwa pencernaan 3´5´ dari ujung 3´ ini sering dihalangi oleh stem
loop 3´, jauh lebih sulit untuk memahami inisiasi degradasi yang berasal dari
ujung 5´, karena exonucleases 5´3´ tidak dapat ditemukan di prokariota sampai
sekarang. Bakteri penstabil 5´ tidak dapat diarahkan ke exoribonucleases 5´3´.
Untuk memberikan hasil terhadap konsep 5´ yang stabil pada elemen RNA,
penstabil 5´ harus mampu untuk memberikan stabilitas pada jalur yang lain,
transkrip heterologous ketika melekat pada lainnya, stabilitas mungkin hanya
cukup mencerminkan situasi lokal tertentu dari messenger.
Gambar. 2. Penstabil 5´ di substrat RNA I. Substrat RNA I yang sangat terstruktur dapat distabilkan dengan jepitan penstabil 5´ ketika
Universitas Syiah Kuala
8
dimasukkan di dekat 5´-terminus. Dengan destabilisasi daerah ss minimal 3-5 nt pada ujung 5´ penstabil 5´ tidak lagi mampu memblokir degradasi.
Pada E. coli ompA 5´-UTR bertindak sebagai stabilisator mRNA cis dari
growth-rate-regulated ompA. Dalam kondisi pertumbuhan yang cepat waktu
paruh pesan dari approx. 17 menit diamati, sebagai lawan 4 menit di bawah
pertumbuhan yang lambat. Memang, 5´-UTR dari ompA mRNA bertindak sebagai
stabilisator mRNA ditransfer ketika berbatasan dengan ujung 5´ lainnya, bahkan
pada mRNA yang tidak stabil dan panjang.23,24 Sebagai contoh, pesan lacZ dapat
distabilkan sementara yang masih normal diterjemahkan. Hal ini terutama struktur
ompA 5´-UTR yang stabil, bukan perubahan dalam kepadatan ketika
menerjemahkan ribosom. Sebagai bagian dari chemeric gen ompA 5´- UTR-bla,
ompA 5´-UTR dapat menstabilkan pesan bla yang berumur pendek.25 Ribosom
dalam hal ini memulai di urutan ompA SD dan diterjemahkan ke dalam wilayah
pengkodean dari bla. Melampirkan seluruh unit transkripsi bla (termasuk 5´-UTR
sendiri) dengan gen ompA (termasuk penstabil 5´-UTR) menciptakan chimeric
dicistron. Bahkan di dicistron ini penerjemah independen pesan bla ditandai stabil
dibandingkan dengan tipe bla yang tidak teratur, bahkan ketika kodon awal pada
bla diganti dengan kodon henti, sehingga memaksa pelepasan prematur dari
ribosom.26 Dalam tipe bla yang tidak teratur mengganti kodon awal dengan kodon
henti selanjutnya dapat mendestabilkan pesan yang tidak stabil.27
Bagian penting dari struktural ompA 5´-UTR telah dipelajari dengan
menggunakan analisis mutasi dari bagian struktur ini (lihat Gambar. 3). Sebuah
stem loop, tidak lebih dari 2-4 nt dari ujung tertinggi 5´, dan di dekatnya
diposisikan SS daerah 2 yang merupakan hal penting. Wilayah SS2 ini berisi
domain pengikat ribosom dan AUG dari kodon awal. Lebih dari 4 nt 5´ untuk
menjepit I yang menyebabkan destabilisasi messenger. Fitur detail dari stem loop
merupakan hal yang penting selama stem loop di ujung langsung. Urutan utama
dari stem loop dan daerah ss tidak berevolusi pada ompA 5´-UTRs. Kehilangan
pada stem loop I dapat menyebabkan degradasi akhir AUG tersebut. Kedua stem
loop, 11 nt akhir yang pertama, bukan merupakan hal penting lagi.
Universitas Syiah Kuala
9
Gambar. 3. Struktur Organisasi dari 5´-UTR. ompA 5´-UTR terdiri dari dua wilayah fungsional penting: 5´ proksimal hairpin I dan untai tunggal wilayah SS2 yang berisi urutan Shine-Dalgarno dan kodon awal AUG
Analisis mutasi dari ss segmen 2 menunjukkan bahwa stabil dengan
saturasi hanya mengikat ribosom ke elemen SD yang kuat bukan oleh terjemaha
inisiasi. Mengganti AUG dengan kodon awal CUG yang tidak efisien mengurangi
penerjemahan secara dramatis tanpa mempengaruhi stabilitas messenger. Fakta
bahwa satu stem loop 5´ benar-benar dapat melindungi seluruh mRNA terhadap
peristiwa nucleolytic akhir yang sangat mendukung asumsi dari hubungan awal 5´
dari aktivitas endonucleolytic sebelum tindakan degradasi akhir. Tidak mungkin,
meskipun bahwa stem loop 5´ harus dibatalkan untuk memungkinkan lewatnya
nukleuse. Pertanyaan apakah aktivitas nucleolytic akhir dari RNase E akan tetap
terbuka untuk model sistem ini.24 Menggunakan pola bla yang terdiri dari ompA 5
´-UTR di daerah bla 5´-UTR, Arnold et al.24 menyatakan bahwa meskipun
kepadatan ribosom di wilayah yang tidak diterjemahkan lebih penting, ribosom
juga harus masuk ke wilayah pengkodean. Terminasi translasi dini yang
dipaksakan pada kodon awal dapat mendestabilkan messenger.
Penstabil 5´ juga telah dijelaskan pada messenger Rhodobacter pufBA dan
E. coli rnc operon RNA.28,29 Dalam kasus perinta pufBA yang ternyata lebih
kompleks dari struktur stem loop 5´ diperlukan dalam menstabilkan dicistron
internal yang dihasilkan melalui penghapusan tambahan cistrons bagian awal dan
akhir. Dalam operon rnc, 5´ menstabilkan kerja penjepit bersama dengan daerah
pembelahan RNase III pada bagian akhir.
Universitas Syiah Kuala
10
Model yang paling meyakinkan untuk degradasi yang berasal pada ujung
5´ adalah penstabil 5´, dan 5´3´ diarahkan pada degradasi telah dikembangkan
untuk transkrip rpsT yang mengkode protein ribosom S20.30,113 Jumlah rpsT sangat
dikendalikan oleh efisiensi translasi bahkan tanpa adanya kunci RNases. Langkah
inisiasi penerjemahan sendiri, bukan hanya meliputi seluruh panjang messenger
dengan ribosom, tetapi harus berfungsi sebagai penjelasan untuk stabilisasi.31 Hal
ini menjadi jelas bahwa stem loop 5´ dari rpsT dapt menghambat pembelahan
RNase E b lebih dari 20 nt pada bagian akhir. Awalnya RNase E mengetahui ss
ujung 5 berisi tempat pembelahan. Mackie dan rekannya mengusulkan bahwa
dalam langkah kedua diasumsikan RNase E dimer akan mulai memindai letak
pembelahan bagian awal sementara masih melekat pada daerah pertama.32 Baru-
baru ini, melalui serangkaian eksperimen yang agak rapi mengedarkan mRNA dan
5´ antisense oligos, Mackie dapat menunjukkan bahwa substrat dengan ujung 5´
yang terutup tidak efisien diproses oleh RNase E.30 Hasil yang jelas adalah bahwa
RNase E membutuhkan ujung 5´ yang tidak berpasangan untuk akses tak terbatas
ke situs pembelahan bagian akhir pada wilayah pengkodean. Hal ini tidak
membuat perbedaan apakah RNase E hadir sebagai enzim yang terisolasi atau
sebagai bagian dari multi-enzim yang kompleks, degradosome, katalis degradasi.
Hal ini juga menjadi jelas bahwa RNase E membutuhkan nukleotida terminal
untuk membawa monofosfat 5´. Efek yang sama dari status fosforilasi dasar
terminal telah dicatat sebelumnya, namun belum dikaitkan dengan RNase E.33
Data ini segera memperlihatkan perlunya aktivitas fosfatase khusus dalam
mengkonversi 5´ trifosfat untuk monofosfat, sehingga mengalokasikan
messengertersebut untuk pengenalan oleh RNase E. Oleh karena itu akan muncul
untuk menjadi pembenaran untuk memanggil prokariotik 5'trifosfat yang setara
dengan pelindung struktur penutup 5' eukariotik. Model ini akan membuat
penjelasan elegan untuk pengamatan5´3´ secara langsung dari RNase E dan
pengaruh efisiensi translasi pada stabilitas messenger. RNase E akan diarahkan ke
ujung 5´ melalui pengenalan monofosfat. Pembacaan pada daerah pembelahan
dari posisi akan mengganggu proses terjemahan inisiasi atau terjemahan kodon
awal. Fragmen internal yang dihasilkan prose nucleolytic dari transkrip
Universitas Syiah Kuala
11
polisistronik memiliki 5´ monofosfat di masing-masing ujung 5´. Hal ini mungkin
memerlukan strategi yang berbeda untuk perlindungan 5´ terhadap degradasi.28
Saat ini tidak ada konsensus apakah model penstabil 5´ umumnya berlaku
untuk sebagian besar mRNA dan untuk semua bakteri. Joyce dan Dreyfus34
mengambil keputusan yang berbeda dalam menggambarkan perlindungan 5´
terhadap lacZ mRNA dari E. coli yang membutuhkan ribosom untuk perjalanan
setidaknya 1 kb ke wilayah pengkodean untuk stabilisasi transkripsi lengkap.
Dengan tidak adanya terjemahan,penstabil 5´ tidak ditawarkan perlindungan yang
efektif terhadap RNase E akhir pada pembelahan messenger ini. Para peniti
mempertanyakan konsep E. coli penstabil 5´ dalam melindungi mayoritas
messenger terhadap degradasi. Menurut pendapat mereka perlindungan degradasi
pada E. coli bergantung pada terjemahan utama. Serangkaian kondisi dikutip di
mana efisiensi pergeseran penurunan dari terjemahan menyebabkan
ketidakstabilan mRNA. Dalam Bacillus sebaliknya, beberapa kasus dilaporkan di
mana ribosom terhenti di 5´-UTR dalam menstabilkan rangkain panjang pada
bagian akhir, apakah diterjemahkan atau tidak.35
3. Endoribonuclease E
Enzim ini telah telah disebutkan beberapa kali sebagai enzim kunci yang
tampak dalam inisiasi degradasi mRNA. Sudah ada penelitian tentang RNase E
yang telah memberikan kemajuan yang paling besar dalam pemahaman kita
tentang degradasi mRNA selama beberapa tahun terakhir. Dalam review baru
pada RNase E, enzim tersebut sebagai “enzim yanag masih sangat misterius”.36
Gen penting rne yang terdapat pada E. coli mengkodekan enzim dari 1061 asam
amino (lihat Gambar. 4). rne autoregulates mensintesis diri sendiri dengan
menekan konsentrasi transkrip melalui peningkatan tingkat kerusakan.37 Massa
molekul yang dihitung dari protein kode sebesar 118 kDa, tapi RNase E berjalan
pada posisi 180 kDa, mungkin karena terdapat daerah C-terminal yang memiliki
banyak prolin.38 Keanehan ini adalah merupakan banyaknya kebingungan di masa
lalu. Setengah dari N-terminal berisi pusat katalitik. Meskipun pada awalnya bukti
disajikan bahwa RNA pusat mengikat dearah dari asam amino 580 hingga 700
yang diperlukan untuk aktivitas katalitik, sekarang umum diasumsikan bahwa
Universitas Syiah Kuala
12
kehadiran domain pengikat RNA kaya arginin ini tidak diperlukan lagi untuk
aktifitas.39-41 Domain ini memiliki kesamaan dengan domain pengikat RNA dari
70 kDa protein U1 snRNP pada manusia.38,42
Gambar. 4. RNase E sebagai enzim kunci dalam degradasi RNA bakteri. N-terminal membawa daerah homologi signifikan dengan CafA dan protein S1(lihat teks). Setengah C-terminal menunjukkan bukan hanya sedikit konservasi pada bagian-bagian komposisi preferensi asam amino yang jelas. Hal ini didedikasikan untuk interaksi protein-protein dengan komponen degradosome lain dan pengikat RNA
Aktifitas pembelahan RNA dari RNase E telah dipelajari dengan berbagai
substrat standar seperti prekursor 9S rRNA dari 5S rRNA, RNA I (regulator
antisense dari ColE1), mRNA yang mengkode OmpA, TrxA, dan protein ribosom
S20 dan S15 (rpsT dan rpsO). Produk pembelahan mengandung 5´ fosfat dan 3´
gugus hidroksil, pembelahan lebih endrung terjadi di daerah-daerah untaui
tunggal yang banya terdapat daerah A/U.43 Proposal asli menggambarkan kendala
struktural dari tempat pembelahan RNase E pada E. coli diperlukan urutan
konsensus beruntai tunggal yang longgar (A /G)AUU(A /U) dan tambahan lateral
dalam menstabilkan stem loop jangkar.44,45 Stem loop akan sama fungsinya sebagai
titik masuk atau menyimpan daerah target untai tunggal.46 Menariknya, daerah
pembelahan pada jenis ini juga diidentifikasi dalam R. capsulatus, suatu
organisme dengan kandungan GC jauh lebih tinggi daripada E. coli.47 McDowall
et al.48,49 baru-baru ini mengkaji ulang persyaratan pembelahan menggunakan
oligonucleotida dengan meniru tempat pembelahan RNase E pada RNA I.
Meskipun enzim menunjukkan pemilihan daerah A/U pada rantai tunggal, urutan
konsensus yang sederhana atau kebutuhan struktur sekunder (stem loop) di sekitar
5´ atau 3´ pada tempat pembelahan tidak bisa dikonfirmasi dengansistem in vitro.
Pengaruh dari pembentukan substrat secara keseluruhan mungkin terjadi. Sebuah
Universitas Syiah Kuala
13
survei sistematis oleh Arraiano et al.50 dari tempat pembelahan endonucleolytic
pada E. coli dicistronic transkrip pyrF-Orff mengungkapkan total 27 tempat dan
urutan konsensus 12-nt potensial dengan 4-nt inti kaya A/U, tanpa kebutuhan
yang jelas untuk tambahan struktur sekunder. Pertanyaan apakah RNase E
mengenalai secara jelas pentingnya perhatian lebih di masa depan. Mungkin
pendekatan berbasis SELEX (evolusi sistematis ligan dengan pengayaan
eksponensial) akan membantu untuk menentukan struktur RNA yang berfungsi
sebagai substrat yang sempurna. Sekali lagi, struktur dan yang bukan urutan
utama tampaknya menjadi kunci untuk ini pengenalan RNA-protein.
Bagi mereka yang tertarik dalam struktur protein RNase E menawarkan
kekayaan tertentu, tidak mengherankan untuk protein sebesar ini. Setengah N-
terminal menunjukkan homologi yang luas dengan protein CafA pada E. coli
(protein untuk filamen aksial sitoplasma)51. CafA adalah protein 50 kDa yang
fungsinya belum diketahui yang mungkin bertindak atas unsur-unsur
cytoskeletal .52 RNase E mungkin memiliki fungsi tambahan dalam transportasi
RNA intraseluler. Reaksi silang dengan myosin rantai berat AB dan menunjukkan
kesamaan urutan dengan molekul tipe myosin.38,51 Homolog pada daerah CafA
juga mencakup sebuah domain S1 homologi. Ketika Bycroft dkk.53 menentukan
struktur E. coli PNPase S1 pada domain pengikat RNA (approx. 70 asam amino
yang panjang) mereka menunjukkan bahwa domain ini, yang awalnya
diidentifikasi dalam Protein ribosom S1, juga hadir dalam langsung N-terminal
dari RNase E dan pada C-terminal PNPase dan RNase II. Fakta bahwa S1 RBD
(untuk domain pengikat RNA) hadir dalam tiga RNases yang berbeda dapat
menunjukkan bahwa mereka berbagi fitur umum pengaturan. Para penulis
selanjutnya menunjukkan bahwa domain S1 yang terlipat memiliki kesamaan
yang tinggi terhadap domain cold shock (CSD) yang ditemukan dalam protein
cold shock (CSP). Protein ini ternyata berfungsi sebagai pendamping RNA dalam
sel eubacterial dalam berbagai situasi stres. CSD, dalam hubungannya dengan
domain pengikat RNA lainnya, memediasi RNA pengikat spesifik. Mungkin,
CSPs mengunci RNAs dalam keadaan linier yang membuat mereka dapat diakses
untuk terjemahan atau degradasi.54
Universitas Syiah Kuala
14
Tak lama setelah itu, Py dkk. memurnikan dari E. coli 500-kDa kompleks
yang berisi RNase E, PNPase, dan protein yang tidak teridentifikasi lainnya.57
Immunoprecipitation kompleks dengan antibodi anti-PNPase diendapkan pada
pita 180 (RNase E), 104, 85 (PNPase K subunit), 74, dan 49 kDa. Pita-pita kecil
dari 92, 74, 52, 47, 45, dan 30 kDa juga diamati. Di kompleks ini penulis juga bisa
mengidentifikasi kegiatan yang menghambat exoribonuclease 3´5´yang paling
penting, PNPase. Faktor penghambat exoribonuclease ini tampaknya tidak
menjadi protein pengikat RNA dirinya sendiri melainkan copurifies dengan
PNPase.58 Efek yang sama dari exonuclease 3´5´ mengulur-ulur pada stem loop
yang terletak di ujung 3´dari RNA messenger yangj uga telah diamati pada B.
subtilis.59 Kebutuhan faktor protein tambahan untuk menjelaskan kinetika
perlindungan yang kuat terhadap prosses exonucleolytic 3´5´ oleh stem loop 3´
sudah diungkapkan oleh McLaren dkk.60 Dua pita protein dari persiapan
Carpousis yang asli kemudian diidentifikasi sebagai protein 50-kDa RhlB (untuk
RNA seperti helikase), dan 48-kDa enolase.61 Hal ini akan membuat enolase L
subunit PNPase, namun nomenklatur ini telah dipertanyakan.62 Kami akan
membahas peran helicases degradasi mRNA lebih lanjut.
4. PNPase
E. coli PNPase (pnp) umumnya digambarkan sebagai homotrimer dari 78-
kDa subunit, berjalan pada posisi gel yang sedikit lebih tinggi dari 86 kDa.63
PNPase dan RNase II (rnb) adalah dua exonucleases 3´5´ paling penting dalam
E. coli.64 PNPase adalah processif exonuclease Pi-dependent dengan aktivitas
polyadenylation. Enzim dalam mode phosphorolytic yang membuat difosfat
mononukleotida yang menghambat protein. RNase II bukan merupakan protein
monomer 70-kDa yang menciptakan 5´ NMP. Distribusi total aktivitas
exonuclease di E. coli antara kedua enzim adalah 90% untuk RNase II vs 10%
untuk PNPase.65 Kedua enzim tampaknya diatur dalam E. coli.66 Sebuah mutan
minus-ganda pada E. coli itu mematikan.67 Dalam B. subtilis pentingnya kedua
enzim agak terbalik.68 Kami juga akan kembali ke PNPase, setelah kami
membahas reaksi kompleks degradosome pada ujung 3´ dari mRNA.
Universitas Syiah Kuala
15
5. Kinase Polyphosphate
Kinase polifosfat (PPK) merupakan komponen yang paling baru ini
diidentifikasi dari degradosome.69 Enzim homotetrameric, dibentuk dari 80-kDa
subunit, mengkatalisis konversi reversibel poly(P) dan ADP menjadi ATP.70 E.
coli merupakan sumber enzim yang banyak enzim. Menariknya, urutan protein
sangat dilestarikan diantara berbagai bakteri, sementara itu belum ditemukan di
beberapa genom bakteri benar-benar diurutkan.71 Blum dkk.69 menunjukkan
bahwa PPK berinteraksi dengan RNase E dan strain PPK minus menunjukkan
peningkatan stabilitas mRNA. Polifosfat yang bisa berasal dari berbagai sumber
memiliki efek penghambatan yang kuat pada degradasi RNA.70 PPK dapat
menghapus penghambatan poly(P) dan NDPS pada degradosome tersebut.
Protein lain yang dibahas sebagai komponen yang diduga dari
degradosome adalah GroEL dan DnaK.62,69,72,73
Tidak dibahas sebagai komponen potensial dari degradosome, dan agak
penting dalam degradasi mRNA, adalah RNase III (lihat tiinjauan Nicholson pada
buku ini). RNase III adalah RNase dsRNA-spesifik. Urutan konsensus daerah
pembelahan tejradi agak awal.74 RNase ini memotong hanya satu set kecil mRNA,
yang paling menonjol pada haipins dalam 5´-UTR dari pnp dan rnc. Pembelahan
inisial pada penstabil 5´ ini merupakan prasyarat untuk degradasi lebih lanjut
berikutnya.
6. Helicases
Ketika Py dkk.61 mengidentifikasi protein 50-kDa dari degradosome
sebagai protein RhlB yang juga mampu menunjukkan fungsi dari ATP-dependent
DEAD-box helicases (DEAD ada untuk mempertahankan motif dari asam amino
Asp-Glu-Ala-Asp yang ditemukan dalam keluarga protein ini). Helicases adalah
protein yang membuka asam nukleat beruntai ganda, apakah itu DNA ataupun
RNA. Berdasarkan urutan homologi mereka dapat dikelompokkan menjadi lima
superfamilies (SF).75,76 Helicases RNA jatuh ke SF I dan II. Mereka memiliki
tujuh motif rangkaian urutan dalam keterlibatan Mg2+, ATP, dan pngikat RNA.
Helicases ini mungkin adalah protein dimer dan mereka membutuhkan untai
tunggal yang menggangtung untuk menyerang dupleks. DEAD-box helicases
Universitas Syiah Kuala
16
RNA adalah bagian dari helicases SF II dan berbagi wilayah inti sekitar 300 asam
amino, dengan delapan motif yang sangat.77 Subfamilies dari protein DExH- atau
DEAH-box. Berdasarkan hal ini penulis menggunakan substrat RNA dengan
hairpins memisahkan 5´ dan 3´ pada bagian beruntai tunggal. Substrat ini berasal
dari daerah intercistronic malE-malF. Ketika diinkubasi dengan fraksi
degradosome dalam ketiadaan ATP, substrat ini terdegradasi oleh proses PNPase
3´5´ sampai PNPase mengani pangkal batang (lihat Gambar. 5). Degradasi
lebih lanjut hanya diamati ketika ATP ditambahkan. Ternyata, RhlB yang terurai
pada hairpin dalam reaksi ATPconsuming dan dengan demikian membantu
degradasi RNA terstruktur oleh PNPase, yang dinyatakan ditangkap ketika
bertemu struktur sekunder seperti haripin. Helicases sebagai bagian dari
degradosome, oleh karena itu harus diberi peran utama dalam pergantian RNA.78
Gambar. 5. Tindakan helicase di degradosome. Degradosome-dependent degradasi 3´5´ stabil pada stem loop 3´ yang membutuhkan aktivitas pembalikan ATP-dependent dari komponen helicase degradosome.
Alternatif pilihan dari RNase E untuk ujung 5´ monofosfat, kekuatan
katalitik dari degradosome dalam konteks ini tampaknya diarahkan terutama pada
ujung 3´ RNA.30 Bagaimana organisasi struktural kompleks sesuai ke dalam
gambar?
Universitas Syiah Kuala
17
7. Struktur dari degradosome
Pusat katalitik untuk kegiatan endonucleolytic di RNase E secara eksklusif
terletak di paruh protein N-terminal protein (lihat Gambar. 4 dan 6).40,41,79 Dalam
sebuah penelitian untuk memahami struktur domain dari RNase E, Vanzo dkk.62
menganalisis peran RNase E dalam pertemuan degradosome E. coli. Separuh C-
terminal dari RNase E mengandung daerah pengikat yang berbeda untuk tiga
komponen degradosome DEAD-box helicase RhlB, enolase, dan PNPase.
Pertemuat tampaknya dibuat pada dasar 1-1 antara RNase E dan ligan, sementara
tidak ada interaksi langsung antara ketiganya. Secara khusus, tidak ada interaksi
antara PNPase K subunit dan enolase yang diamati, membuat lebih
mepertanyakan fakta bahwa enolase awal bernama L subunit PNPase.61 Vanzo
dkk. juga menunjukkan bukti langsung untuk oligomerisasi RNase E, yang sudah
diusulkan oleh Mackie.32 RhlB helicase sangat aktif ketika bertemu dengan
domain pengikat RNase E. RNase E, selain kemampuan katalitik sendiri, dengan
C-terminal platform pertemun untuk degradosome tersebut. Separuh C-terminal
dipotong dari E. coli RNase E dapat mengikat komponen degradosome PNPase,
RhlB, dan enolase.80
Gambar. 6. Degradosome prokariotik. Skema ini menyajikan model untuk organisasi struktural degradosome yang bekerja pada ujung 3´. Berbagai jenis genangan pada fosfat dalam lingkungan mikro ini adalah ortho-phosphate Pi, poly-phosphate (Pi)n, mononucleotide diphosphates NDP, dan ATP. Penghambatan atau stimulasi di pengaruhi dari genangan ini pada degradasi mRNA ditunjukkan dengan + atau - . NDPS penghambat PNPase, poli-fosfat mungkin menghambat helicase. Model menampilkan dari ide-ide saat ini tentang interaksi yang dikenal komponen degradosome. PPK, poli-fosfat kinase; PNPase, polinukleotida kinase.
Universitas Syiah Kuala
18
Lab kami baru-baru ini memurnikan degradosome dari R. capsulatus
(Fuhrmann, Rauhut dan Klug, hasil tidak dipublikasikan). Sebuah RNase E dari
`tipe 180'-kDa, RhlB helicase, enolase, dan PNPase hadir di kompleks dan, yang
paling menarik, sebuah DEAD-box RNA helicase kedua 65 kDa. Kompleks ini
akan dapat beroperasi dalam mode yang sama seperti yang dicoba pada E. coli.
Sekarang saatnya untuk melihat saat ini dikenal RNases E untuk melihat
apakah semuanya cocok untuk bertindak sebagai degradosome perakit. Sebuah
kompilasi terbaru dari RNases E membandingkan enzim dari E. coli,
Haemophilus influenzae, Synechocystis, Porphyria kloroplas, dan Mycobacterium
tuberculosis80 Enzim dari Synechocystis dan Porphyria kloroplas dilaporkan
hanya memiliki panjang sekitar 50% dari protein E. coli dan H. influenzae. Bagian
yang dilaporkan jelas homolog dengan N-terminal dari dua terakhir. Enzim E.
coli, H. influenzae, dan M. tuberculosis memiliki panjang yang. Dua sebelumnya
sangat homolog N-termini, C-termini mereka menjadi sangat berbeda. M.
tuberculosis menunjukkan homologi terbatas atas panjang seluruhnya.
Penerbitkan dari genom Rickettsia prowazekii menunjukkan adanya satu-satunya
panjang asam amino 683 RNase E. Hanya N-terminal duapertiga menunjukkan
homologi yang biasa (dengan memasukkan asam amino 90 di akhir N-terminal) .
Jika situasi tiba-tiba dipersingkat C-termini saja harus sudah memberikan alasan
untuk meragukan kehadiran umum dari degradosome RNase E-dimediasi, maka
lebih jadi ketika kita mempertimbangkan fakta bahwa hampir semua genom
bakteri benar-benar diurutkan kekurangan terdeteksi RNase E seperti protein.
Evolusi tidak hanya ditemukan solusi di¡erent untuk C-terminus dari RNase E,
tetapi juga untuk seluruh kegiatan dicontohkan oleh RNase E. 13,3 kDa protein
ARD-1 dari sel manusia adalah analog fungsional E. coli RNase E, saham fitur
struktural, dan dapat menyelamatkan RNE-kekurangan strain E. coli.81,82
Sangat menarik, meskipun, untuk melihat degradosome kompleks yang
telah dijelaskan dalam organel seluler seperti kloroplas dan mitokondria, baik asal
bakteri. Sebuah kompleks massa molekul kloroplas tinggi dengan PNPase dan
enzim RNase E-seperti telah dijelaskan 83,84 Kegiatan RNase E memiliki massa
molekul 67 kDa dan dikenali oleh E. coli anti-RNase E antibodi. Dalam ragi
mitokondria kompleks mtEXO berisi tiga protein utama dengan aktivitas
Universitas Syiah Kuala
19
exonuclease 3´5´ dan terlibat dalam degradasi mtRNA.85 Kompleks
menunjukkan persyaratan NTP untuk kegiatan dan aktivitas nuklease NTPase,
baik menunjukkan adanya sebuah helicase. Salah satu komponen baru-baru ini
diidentifikasi sebagai DexH-box RNA helicase.86 Inti Ragi berisi perbedaan jenis
dengan kompleks massa molekul tinggi, exosome.87 Kompleks 300-400 kDa ini
terdiri lima tempat singgah pada exonucleases 3´5´, sebagian besar homolog E.
coli exonucleases 3´5´, tapi tidak ada helicases. Semua nukleus merupakan
bagian penting yang dibutuhkan untuk pemrosesan prekursor rRNA. Berinteraksi
dengan tergantung ATP helicases RNA seperti Dob1p ragi dan Ski2p, exosome
mungkin memiliki peran penting dalam omset mRNA dari semua eukariota.88-90.
Juga degradosome E. coli ditunjukkan baru-baru ini terlibat dalam degradasi
rRNA pada E.coli.91
8. Ujung 3´-
Selama perjalanan kami melalui molekul RNA, kita sekarang harus bisa
melihat ke dalam struktur dan proses khusus pada ujung 3´. Dan itu mungkin ini
akhirnya yang menjalani pemikiran ulang yang paling jauh jangkauannya. Stem
loop pada unit transkripsi pada ujung 3´ dan pada daerah intercistronic merupakan
fitur menonjol dalam prokariota.92 Kedua jenis dapat berfungsi sebagai ukuran
perlindungan terhadap exonucleases 3´5´.12,93,94 Sebagian mRNA prokariotik
menampilkan 3´-UTR pada bagian akhir dari translasi kodon henti. 3´-UTRs
mengandung unsur intrinsik rho-independent terminasi transkripsi stem loop yang
sulit untuk dibedakan dari benar penstabil 3´.60,64,95 Sebuah analisis komputer baru-
baru ini menyelesaikan proyek genom prokariotik mengungkapkan bahwa
sebagian besar organisme tidak membentuk hairpin pada 3´-UTRs.96 Akhirnya
memiliki implikasi yang mendalam, tidak hanya untuk terminasi transkripsi, tetapi
juga untuk degradasi mRNA.
Anehnya, ada terdapat hal lebih di akhir. Selama beberapa tahun terakhir
telah menjadi jelas bahwa j mRNA prokariotik juga polyadenylated.97 Dalam
prokariota ekor poly (A) mRNA bisa sampai panjang 60 nt. Pada E. coli ekor poly
(A) mungkin memiliki panjang antara 15 dan 50 nt.98 Li dkk.99 mengusulkan
bahwa polyadenylation adalah fitur umum pada E. coli, bahkan untuk RNA kecil
Universitas Syiah Kuala
20
yang stabil. Sementara ekor poly (A) pada eukariota mempengruhi kestabilan
pada messenger RNA, mereka tampaknya melakukan hal yang berlawanan dalam
RNA prokariotik (lihat juga artikel tentang polyadenylation eukariotik dalam
buku ini).100 Dua poly (A) polimerase dari 53 dan 35 kDa telah diidentifikasi di E.
coli, PAPI dan PAPII.101,102 Situasi yang sama diamati di B. subtilis.103
PNPase dan RNase II hanya bisa mengerahkan proses 3´5´ pada ujung 3
´ lebih dari selusin atau nukleotida yang tidak berpasangan, yang terletak 3´ ke
stem loop 3´.104 Dan ini adalah di mana polyadenylation memasuki daerah kerja.
Mungkin itu adalah polyadenylation yang memudahkan akses ke transkrip untuk
satu atau lebih exonucleases 3´5´. Di hadapan ekor poly (A) jumlah urutan
substrat diakses untuk PNPase pencernaan meningkat secara dramatis. Dengan
tidak adanya polimerase poly(A) degradasi ompA, trxA, dan rpsO mRNA di E.
coli melambat.98,105 Demikian pula, kerusakan RNA I mempercepat melalui
adenilasi 3´.33 Kekurangan PNPase atau RNase II pada strain E.coli menunjukkan
peningkatan tajam dalam jumlah dan panjang pada ekor poly(A).106
Menambahkan 3´ sehingga merekrut PNPase dan kompleks degradosome ke
ujung 3´ menyediakan model yang menarik untuk mengatasi hambatan dari
struktur 3´ stabil. Oleh karena itu mengumpan untuk berspekulasi tentang protein
pengikat poly (A) dan polimerase poly (A) dirinya sebagai bagian dari
degradosome tersebut. Sampai sekarang tidak ada telah ditemukan di
degradosome.61 Di sisi lain, telah dilaporkan untuk substrat RNA I yang
menambahkan ekor poly (A) yang panjang mencegah pembelahan substrat
endonucleolytic ini dengan RNase E. RNase E dapat memperpendek ekor poly(A)
3´5´ dalam exonucleolytic tetapi tidak dalam proses yang ketat! Dalam hal ini,
pemendekan ekor poly(A) ke ambang batas panjang kritis membuat RNA yang
dapat diakses untuk degradasi.41
Bagian penting dari pengetahuan kita tentang kegiatan di ujung 3P berasal
dari pengamatan yang dilakukan dalam organel trunan prokariotik, kloroplas.
Sebagian mRNA kloroplas memiliki stem loop dalam 3P-UTR mereka yang
berfungsi sebagai penstabil pada bagian awal, tetapi mereka tidak polyadenylated.
Mereka yang dapat menunjukkan panjang ekor poly(A) (atau lebih tepatnya ekor
kaya akan poli (A) -rich dengan diselingi Gs) yang cukup.107 Dalam kloroplas
Universitas Syiah Kuala
21
bayam polyadenylation tampaknya berakhir untuk degradasi RNA oleh
exonucleases. Sebuah homolog protein PNPase bakteri, yang exoribonuclease
100RNP, yang secara khusus memotong ekor poly(A), dan kegiatanseperti pada
PAP telah ditemukan di kloroplas. Kloroplas PNPase itu terbukti berhubungan
dengan protein seperti RNase E di pada kompleks massa molekul tinggi.
Kompleks ini mengandung protein tambahan yang mengikat stem loop 3´
sehingga memberikan perlindungan dari degradasi.84 PNPase menunjukkan
afinitas tinggi pada ekor poly(A) dan sangat erat kaitannya dengan PAP.83,108
Polyadenylation dan adanya struktur seprti degradosomei pada kloroplas
meminjamkan kepercayaan bahwa kloroplas dan bakteri masih menggunakan
mekanisme umum untuk degradasi mRNA. Pertama, pembelahan endonucleolytic
pada pengkodean 3´ atau 3´-UTR oleh RNA matang pada endonuclease seperti
RNase E akan menghasilkan RNA tanpa stem loop 3´. Polyadenylation berikutnya
berada `bebas 'pada ujung 3´ akan membuat mereka lebih menyukai afinitas
substrat yang tinggi untuk PNPase.83,109
Jika bakteri stem loop 3´ sangat stabil atau berhubungan dengan faktor
penghambat exonuclease, sehingga sangat kuat melindungi terhadap degradasi
dengan mengulur-ulur exonucleases di pangkal batang 3´, pembelahan tingkat
pembatasan RNA pada daerah RNase E bagian awal stem loop adalah cara lain
untuk menghilangkan hambatan ini.58,60,110 Tanpa perlindungan tempat masuk 3´
memimpin untuk degradasi cepat dari messenger oleh RNase II dan PNPase.
Coburn dan Mackie111 baru-baru ini mencoba untuk menempatkan model ujung 3´
untuk tes dalam in vitro dengan sistem degradasi yang dilarutkan. Mereka
menggunakan degradasi fragmen 3´-terminal rpsT mRNA (protein ribosom S20).
Fragmen ini merupakan produk degradasi RNase E-tergantung dan merupakan
bagian dari wilayah pengkodean dan 3´-UTR. Degradosomes tidak dapat
menurunkan fragmen ini bahkan ketika adenylated. Sebaliknya, siklus
polyadenylation dan tindakan PNPase sepenuhnya menurunkan fragmen in vitro.
Jadi in vitro dilarutkan sistem degradasi hanya membutuhkan RNase E
(pemotongan internal yang awal), PNPase, PAP I, ATP dan Pi. Fakta bahwa ATP
dapat diganti dengan ATPQS non-terhidrolisis, cocok untuk PAP I tetapi tidak
untuk RhlB, menunjukkan bahwa aksi RhlB helicase tidak diperlukan. Anehnya,
Universitas Syiah Kuala
22
RNase II dapat menangkal degradasi jalur dengan menghapus ekor poly (A) dari
intermediet PNPase-degradable.110 Tanpa ekor poly (A) degradosomes seharusnya
tidak lagi bertindak dari ujung 3´, tetapi terpaksa menggunakan jalur
endonucleolytic yang tergantung pada letak pembelahan RNase E dari bagian
RNase E awal. Telah dilaporkan untuk RNA I RNA bahwa kehadiran ekor
poly(A) yang panjang memang mencegah pembelahan endonucleolytic dari
transkrip primer dengan RNase E. Transkrip dengan ekor pendek atau tanpa ekor
yang akan di lakukan pembelahan.41
Mengutip antara bukti lain, bahwa dalam vivo yang setengah hidup dan
tingkat mRNA untuk rpsT adalah sama di strain yang kekuranagn PAP I, Coburn
dan Mackie111,113 tidak percaya polyadenylation yang merupakan prasyarat umum
untuk kerusakan mRNA.
Tergantung pada stabilitas struktur 3´-terminal dengan baik alat degradatif
diterapkan sebagai gantinya: berakhir terstruktur yang tersedia untuk serangan
exonucleolytic (RNase II, PNPase), lebih stabil struktur stem-loop seperti di RNA
saya memerlukan satu satu polyadenylation-waktu.33 Stem loops stabil, seperti
dalam rpsT, memerlukan pengulangan aksi PAP I dan PNPase seperti ditunjukkan
pada Gambar. 7. Hanya struktur yang paling stabil memerlukan degradosome
degradasi, lengkap dengan helicases dan hidrolisis ATP.61 Pembelahan diprakarsai
oleh RNase E sini pada ujung 3´ dapat juga dikombinasikan dengan perlindungan
degradasi dengan menerjemahkan ribosom.112 rpsO messenger (protein ribosom
encoding S15) membentuk dicistron dengan pesan pnp akhir. RNase E memotong
10 nukleotida akhir dari rpsO kodon henti. Pembelahan ini menghapus sebuah
hairpin bagian akhir dari tempat pembelahan yang pada gilirannya merupakan
prasyarat untuk degradasi berikutnya oleh 3´5´ PNPase. Jarak antara kodon
henti dan tempat pembelahan sangat penting untuk stabilitas. Memperluas
mendestabilkan messenger, akan membawa ke tempat pembelahan yang di luar
jangkauan dari perlindungan dari ribosom yang terikat.
Universitas Syiah Kuala
23
Gambar. 7. Polyadenylation sebagai alternatif untuk degradosome. Skema ini, diadaptasi dari111, menggambarkan interaksi yang kompleks dari exonucleases 3´5´ dan PNPase pada ujung 3´ rpsT mRNA (protein ribosom S20). Aktifitas polyadenylation dan exonuclease yang yang cukup untuk mendegradasi, sementara aktivitas helicase tidak diperlukan untuk hairpin ini. RNase II digambarkan sebagai ekor poly(A) yang memperpendek exonuclease, sehingga membuat RNA kurang rentan terhadap degradasi. PAP I, poli (A) polimerase I
8. Prospek
Apa yang akan menjadi arah masa depan penelitian degradasi RNA? Jika
degradasi RNA adalah proses yang benar-benar responsif terhadap perubahan
lingkungan, mekanisme harus dipahami yang mengirimkan sinyal lingkungan
tertentu seperti suhu yang lebih rendah atau penurunan tekanan parsial oksigen ke
target molekul yang berbeda dari proses degradatif, sehingga perubahan tertentu
dalam waktu paruh dari RNA tertentu saja dapat dicapai.
Kemajuan telah dibuat dalam pemurnian dan karakterisasi fisik dari
beberapa enzim kunci yang terlibat, terutama RNase E. Sekarang, setelah
bertahun-tahun sejarah pemurnian bermasalah, kita memiliki pemahaman yang
lebih baik dari protein daripada yang kita miliki dari substrat dari RNase E.
persyaratan struktural yang menentukan kebutuhan tempat pembelahan untuk
diselidiki secara lebih rinci menggunakan teknik baru dan kumpulan substrat agak
terbatas saat ini digunakan untuk studi degradasi RNA perlu diperpanjang.
Masa depan akan menunjukkan apakah mesin degradosomelike benar-
benar prototipe untuk degradasi RNA bakteri. Organisme lebih harus dipelajari
untuk memperbaiki gambar sangat bias oleh E. coli. Degradosome yang mungkin
Universitas Syiah Kuala
24
berisi lebih komponen yang perlu diidentifikasi. Berbagai pita protein kecil dalam
pemurnian saat protokol kation adalah kandidat yang menjanjikan untuk
menemukan fungsi baru, untuk memberikan jawaban atas pertanyaan-pertanyaan
seperti apa yang menarik degradosome ke 3´-UTR, 5´ monofosfat atau tempat
pembelahan internal.
Universitas Syiah Kuala