degradasi mrna pada bakteri

37
Degradasi mRNA pada Bakteri Oleh: Reinhard Rauhut, Gabriele Klug Abstrak RNA messenger pada prokariotik menunjukkan paruh waktu yang pendek bila dibandingkan dengan mRNA eukariotik. Sudah ada kemajuan selama beberapa tahun terakhir dalam pemahaman tentang degradasi mRNA pada bakteri. Terdapat dua aspek utama dalam menentukan masa hidup messenger pada sel bakteri. Di sisi substrat, fitur struktural mRNA memiliki pengaruh besar pada stabilitas molekul. Di sisi lain, terdapat komponen degradasi pada bakteri. Kemajuan dalam karakterisasi biokimia protein yang terlibat dalam degradasi mRNA telah terlihat jelas bahwa degradasi RNA adalah proses selular yang sangat terorganisir di mana terdiri dari beberapa komponen protein, dan tidak hanya inti sel yang terlibat. Pada bakteri Escherichia coli, protein ini mengatur kompleks massa molekul tinggi, yaitu degradosome. Enzim yang menjadi kunci untuk proses awal degradasi mRNA dan untuk pembuatan degradosome adalah endoribonuclease E. Kami membahas komponen pengidentifikasian degradosome dan cara kerjanya. Sejak penelitian degradasi mRNA yang sering melibatkan E. coli kami juga meneliti pada organisme lain untuk melihat apakah bakteri lain mungkin bisa mengikuti standar model seperti pada E. coli. Kata Kunci: Degradasi mRNA; Degradosome; Rnase E; PNPase; Ribonuclease 1. Degradasi mRNA pada bakteri Dibandingkan dengan eukariot, menunjukkan messenger RNA (mRNA) paruh berada dalam kisaran jam, bakteri menunjukkan ketidakstabilan mRNA yang cukup besar pada in vivo dengan rata-rata waktu paruh dalam beberapa menit saja. Konsentrasi yang bagus pada messenger berbanding lurus dengan waktu paruhnya. Messenger adalah bagian dari strategi bakteri untuk merespon dengan cepat untuk segera mengubah parameter lingkungan. Untuk memenuhi persyaratan dalam perubahan isi selular, 1 Universitas Syiah Kuala

Upload: muhammad-abzar-ghifahri

Post on 09-Dec-2015

63 views

Category:

Documents


7 download

DESCRIPTION

degradasi

TRANSCRIPT

Page 1: Degradasi MRNA Pada Bakteri

Degradasi mRNA pada BakteriOleh: Reinhard Rauhut, Gabriele Klug

AbstrakRNA messenger pada prokariotik menunjukkan paruh waktu yang pendek bila dibandingkan dengan mRNA eukariotik. Sudah ada kemajuan selama beberapa tahun terakhir dalam pemahaman tentang degradasi mRNA pada bakteri. Terdapat dua aspek utama dalam menentukan masa hidup messenger pada sel bakteri. Di sisi substrat, fitur struktural mRNA memiliki pengaruh besar pada stabilitas molekul. Di sisi lain, terdapat komponen degradasi pada bakteri. Kemajuan dalam karakterisasi biokimia protein yang terlibat dalam degradasi mRNA telah terlihat jelas bahwa degradasi RNA adalah proses selular yang sangat terorganisir di mana terdiri dari beberapa komponen protein, dan tidak hanya inti sel yang terlibat. Pada bakteri Escherichia coli, protein ini mengatur kompleks massa molekul tinggi, yaitu degradosome. Enzim yang menjadi kunci untuk proses awal degradasi mRNA dan untuk pembuatan degradosome adalah endoribonuclease E. Kami membahas komponen pengidentifikasian degradosome dan cara kerjanya. Sejak penelitian degradasi mRNA yang sering melibatkan E. coli kami juga meneliti pada organisme lain untuk melihat apakah bakteri lain mungkin bisa mengikuti standar model seperti pada E. coli.

Kata Kunci: Degradasi mRNA; Degradosome; Rnase E; PNPase; Ribonuclease

1. Degradasi mRNA pada bakteri

Dibandingkan dengan eukariot, menunjukkan messenger RNA (mRNA)

paruh berada dalam kisaran jam, bakteri menunjukkan ketidakstabilan mRNA

yang cukup besar pada in vivo dengan rata-rata waktu paruh dalam beberapa

menit saja. Konsentrasi yang bagus pada messenger berbanding lurus dengan

waktu paruhnya. Messenger adalah bagian dari strategi bakteri untuk merespon

dengan cepat untuk segera mengubah parameter lingkungan. Untuk memenuhi

persyaratan dalam perubahan isi selular, sintesis protein dapat dengan cepat

diprogram dengan perubahan yang cepat dalam pola mRNA.

Degradasi mRNA tampaknya merupakan peran utama dalam regulasi

ekspresi gen dalam dua cara. Pertama, saat sebuah molekul mRNA dapat

berfungsi sebagai template untuk menterjamahkan ribosom ditentukan oleh

stabilitas yang terkandung di dalamnya. Perlengkapan dari degradasi RNA selular

akan menghilangkan setiap messenger secara cepat atau lambat dari sirkulasi sel,

tergantung dalam menstabilkan atau destabilisasi fitur struktural RNA. Kedua,

mRNA degradasi, diatur sendiri oleh parameter lingkungan, dapat menyediakan

sarana untuk secara aktif beradaptasi menterjemahkan selular dengan perubahan

sesuai kebutuhan bakteri. Meskipun tidak ada bukti bahwa parameter lingkungan

secara langsung mengendalikan tingkat translasi pada prokariota, seperti pengaruh

1 Universitas Syiah Kuala

Page 2: Degradasi MRNA Pada Bakteri

2

pada stabilitas spesies mRNA yang telah diamati. Tingkat peluruhan puf mRNA

misalnya pada bakteri Rhodobacter capsulatus secara signifikan ditingkatkan

dengan adanya oksigen.1 Messenger polisistronik ini mengkode beberapa

komponen protein kompleks fotosintesis pada bakteri ungu ini dan optimal

dinyatakan hanya di bawah kondisi tekanan oksigen yang rendah. Stabilitas CSPA

mRNA, pengkodean protein besar cold-shock pada Escherichia coli, sementara

meningkat setelah menurunkan suhu pertumbuhan.2 mRNA pada RNA binding

protein Rbp dari Anabaena variabilis secara khusus stabil setelah menurunkan

suhu pertumbuhan.3 E. coli pada kucing dan Bacillus subtilis thrS mRNA

menunjukkan peningkatan stabilitas dalam kondisi kelaparan.4,5 Ini mungkin

mengisyaratkan fenomena umum untuk mRNA lainnya, ketika sel-sel di bawah

kondisi C atau N kelaparan.6,7 Perlu dicatat bahwa dalam sistem eukariotik urutan

RNA telah diidentifikasi sebagai sensor langsung pada keadaan stres lingkungan.8

Banyaknya transkrip primer polisistronik adalah keganjilan pada

prokariotik. Tidak hanya 5´ dan 3´ yang diterjemahkan tetapi juga daerah

intercistronic yang mengatur urutan daerah pengkodean. Asosiasi beberapa gen

dalam satu transkrip tidak berarti bahwa jumlah molar yang sama dari masing-

masing protein yang diterjemahkan. Ribosom mungkin mengikat secara

independen untuk setiap awal cistron individu dan melepaskan diri dari transkrip

di berbagai situs pemutusan internal. Fine tuning pada perbedaan terjemah

inisiasi, elongasi, dan terminasi kinetik dari segmen individu dapat menyebabkan

jumlah molar yang berbeda yang diterjemahkan oleh protein. Pengaturan

autogenous subset dari protein dalam messengers polisistronik menambah

khasanah mekanisme dari kontrol translasi. Mekanisme tersebut telah dipelajari

secara ekstensif dalam operon seperti protein E. coli ribosom atau E. coli operon

ATP (ATPase).9,10

Dalam transkrip polisistronik degradasi mRNA membuat kontribusi yang

signifikan untuk perbedaan ekspresi gen. Studi ekstensif selama bertahun-tahun

terakhir pada puf mRNA polisistronik R. capsulatus mengungkapkan bahwa

stabilitas perbedaan segmental diberikannya salah satu pengaruh yang

menentukan stoikiometri protein selama terjemahan dari fragmen yang

bersangkutan (Gambar. 1).11 Protein dikodekan dalam transkrip polisistronik ini

Universitas Syiah Kuala

Page 3: Degradasi MRNA Pada Bakteri

3

dibutuhkan dalam jumlah stoikiometri yang berbeda untuk merakit fotosintesis

kompleks yang fungsional. Sebagai konsekuensi dari banyaknya mRNA

menstabilkan dan mendestabilisasi elemen struktur dalam transkrip primer,

kegiatan nucleolytic membagi RNA polisistronik menjadi mRNA yang lebih

kecil. Segmen ini menunjukan paruh waktu yang sangat berbeda, yang pada

gilirannya menyebabkan jumlah molar berbeda yang diterjemahkan oleh protein.

Gambar. 1. Operon puf sebagai contoh dalam menstabilkan dan mendestabilisasi struktur RNA. Struktur ini mempengaruhi stabilitas segmental diferensial dari messanger polisistronik. Operon ini mengkodekan protein LH I dan RC pad fotosintesis kompleks di R. capsulatus. Protein kode oleh B dan A yang dibutuhkan dalam perbandingan molar 15:1 atas protein kode oleh segmen L dan M. Hal ini terlihat kembali pada paruh segmen mRNA yang sesuai. Sementara transkrip primer dan transkrip tersebut dipangkas menjadi 2,7 kb memiliki paruh kurang dari setengah menit atau 8 menit masing-masing, dirampingkan pufBA memiliki paruh 33 menit dan karena itu tersedia lebih lama untuk terjemahan. Jepitan merah menstabilkan urutan hulu. Jepitan hijau membentuk kompleks penstabil 5´. Kotak kuning menandakan pembelahan internal pada RNase E yang bertanggung jawab untuk membatasi tingkat kerusakan dari messenger 2,7 kb.

Efek serupa telah dipelajari di sejumlah transkrip polisistronik lainnya

seperti pada E. coli mal-EFG, Salmonella histadin pada transportasi operon,

transkrip E. coli ftsA-ftsZ, Acinetobacter calcoaceticus hapusan operon, dan

Alcaligenes eutrophus hoxS mRNA.12 -16

Untuk menggambarkan perlengkapan degradasi mRNA dalam sel bakteri

perlu melihat dua aspek. Pertama, kita harus memahami sifat dan distribusi

menstabilkan atau mendestabilisasi elemen struktural dalam mRNA. Kemudian

kami juga harus menyelidiki mana ribonucleases yang terlibat dalam degradasi Universitas Syiah Kuala

Page 4: Degradasi MRNA Pada Bakteri

4

mRNA. Meskipun pembelahan ikatan internucleotide memerlukan tindakan dari

endo atau exoribonuclease, hasil terakhir telah menyatakan dengan jelas bahwa

degradasi RNA juga memerlukan enzim selain itu.

Sejak subjek dari stabilitas mRNA telah diteliti dengan hasil penelitian

terakhir kali telah memberikan gambaran umum tentang degradasi mRNA yang

sangat berpengaruh dalam sel bakteri.17,18 Di lapangan, terdapat sedikit fakta

meskipun bahwa E. coli mendominasi penelitian. Hasil yang diperoleh dari E.

coli, menggunakan beberapa model RNA, mungkin tidak dapat mewakili sama

sekali untuk bakteri lainnya.

Percobaan degradasi pada mRNA sangat sering dibutuhkannya

pengukuran paruh waktu pada mRNA. Hal ini dapat dicapai baik dengan

percobaan pada in vivo ataupun in vitro. Selama studi in vivo, inisiasi transkripsi

dari mRNA pada sel hidup akan terhenti dengan adanya penambahan inhibitor

transkripsi pada kultur hidup dengan waktu nol. Kultur aliquots tersebut

kemudian dihapus pada berbagai titik waktu untuk mengisolasi RNA dan

memisahkan dengan gel. Teknik hibridisasi menggunakan probe berlabel, khusus

untuk mRNA tertentu yang penting, yang kemudian digunakan untuk mendeteksi

dan mengukur keberadaan dan pembusukan kinetika mRNA ini (kimia paruh).

Sejak RNases menunjukkan kegiatan yang tumpang tindih atau bahkan bisa saling

menggantikan, sulit untuk membedakan efek secara individu yang mungkin

dimiliki pada degradasi mRNA. Penghapusan satu atau lebih gen nuklease dari

strain dengan latar belakang genetik yang identik dapat meningkatkan interpretasi

pola degradasi kompleks dari model substrat. Strain bakteri yang membawa gen

mutan dengan protein yang sensitif pada temperatur dapat terlibat dalam degradasi

mRNA dikarenakan pergeseran suhu sehingga memperlihatkan dampak dari gen

ts pada jalur degradasi dan kinetika kerusakan dari mRNA.19 Dalam percobaan in

vitro terdapat keuntungan dari kemudahan tersedianya RNA transkrip, yang

pernah menjadi RNA kloning di bawah kendali promotor fag seperti T7 atau SP6.

Pencetakan transkrip berlabel dapat dibuat dengan transkripsi in vitro. Tergantung

pada konstruksi, hanya bagian dari messenger, 5´ dan daerah 3´ diterjemahkan

(UTR), atau wilayah polisistronik lengkap dapat dimasukkan. Substrat in vitro ini

kemudian diinkubasi dengan ekstrak bakteri atau protein dan dimurnikan selama

Universitas Syiah Kuala

Page 5: Degradasi MRNA Pada Bakteri

5

uji degradasi in vitro. Pendekatan ini adalah keuntungan besar ketika mempelajari

efek letak mutasi pada substrat RNA dan pada degradasi mRNA. Menggunakan

ekstrak daripada melakukan pemurnian dapat menyebabkan hasil yang tidak jelas

karena adanya aktifitas tumpang tindih dari berbagai komponen. Ujung 5´- dan 3´-

pada fragmen RNA yang diamati dapat ditentukan dengan menggunakan analisis

ekstensi primer dan pemetaan S1 nuklease, sehingga memperlihatkan posisi dari

tempat pembelahan pada substrat in vitro.

Hal ini sangat bertentangan bahwa sebuah molekul mRNA berupa lurus

seperti jarum rajut. Kebanyakan RNases bertindak sebagai pematangan nukleus

RNA. Sebagian beser molekul RNA pada organisme ditranskripsi sebagai

molekul prekursor biologis yang tidak aktif, dalam rangka sebagai tugas biologis,

pertama mereka yang membutuhkan pengolahan secara luas, secara internal atau

dengan cara mereka sendiri. Seperti halnya bagi sebagian besar interaksi protein-

RNA, pengenalan antara substrat RNA dan aktifitas pembentukan nucleolytic

selama pematangan serta degradasi tidak hanya mengandalkan pengenalan dari

urutan utama. Sangat sering tempat terjadinya pembelahan nucleolytic sebenarnya

sudah dikemas dengan cukup banyak di sekitar struktur sekunder dan tersier.

Ragam standar struktur elemen sekunder seperti batang, lekukan, tonjolan dan

daerah ss di berbagai stabilitas termodinamika cukup untuk menciptakan

bermacam-macam sinyal RNA yang terstruktur.

Untuk memahami pengaturan ekspresi dari produk gen dapat diketahui

dengan mempelajari degradasi mRNA yang sesuai. Sebuah analisis kemungkinan

dari struktur sekunder, dibandingkan dengan daerah-daerah dalam genom

organisme lain yang sesuai dapat menunjukkan adanya kemungkinan dari fitur

pengaturan RNA ini. Setelah struktur tersebut adalah benar terbukti, mereka tentu

saja akan memerlukan verifikasi dengan menggunakan metode kimia dan enzim

padaa struktur RNA. Hasil struktur yang terbukti pada pengaturan stabilitas terkait

juga dapat diperoleh dengan menggunakan analisis mutasi.

2. Ujung 5´ dari mRNA

Untuk mengatur arah menuju degradasi mRNA kita memulai dari ujung 5´

pada messenger. Trifosfat dalam posisi 5´ dari nukleotida pertama merupakan

Universitas Syiah Kuala

Page 6: Degradasi MRNA Pada Bakteri

6

awal dari messenger. Fragmen internal, yang dihasilkan dari transkrip

dirampingkan, bukan membawa monofosfat 5´. Hal yang sepele ini akan menjadi

jelas setelah kami melihat aktivitas enzim katalitik seperti RNase E. Pangkodean

daerah dengan terjemahan kodon awal didahului oleh 5´-UTR. 5´-UTR ini meluas

sampai beberapa ratus nukleotida dan dapat menunjukkan sedikit struktur

sekunder. Bagian dari 5´-UTR ini juga merupakan urutan Shine-Dalgarno (SD),

yang dekat dengan ruang pada 5´ ke kodon awal. Ujung 5´ tidak hanya berfungsi

sebagai titik masuk yang potensial untuk nukleus degradatif, tetapi juga otomatis

menjadi titik yang lebih disukai dalam menggunakan langkah-langkah protektif,

tetapi tentu juga titik masuk untuk ribosom selama terjadinya proses terjemahan.

Oleh karena itu tidak mengherankan bahwa penelitian tentang kemungkinan

penstabilan struktur dari 5´ selalu harus mengatasi kemungkinan adanya

pengaruh dalam menerjemahkan ribosom. Sebuah ribosom melindungi

sekumpulan messenger RNA ke tingkat 15 nt pertama ke tempat nukleotida P.20

Meskipun, bertentangan dengan eukariota, kegiatan exonuclease 5´3´ di

prokariota tidak pernah ditemukan, degradasi mRNA sering menunjukkan secara

langsung pada 5´3´. Selama bertahun-tahun model standar dari perusakan

mRNA prokariotik digambarkan kerusakan yang diakibatkan aksi gabungan dari

endo dan exoribonucleases.

Langkah pertama pada endonuclease – kita secara umum menganggap

pada RNase E akan mengenali tempat pembelahan dan tingkatan dalam

menentukan potongan terjadinya endonucleolytic. Sering daerah ini merupakan

bagian atas dari stem loop yang dilindungi oleh ujung 3´, tetapi sering terlalu

dekat dengan ujung 5´, bahkan dekat dengan bagian atas dari stem loop 5´. Dalam

kasus yang pertama, pembelahan kemudian diikuti dengan langkah kedua dari

degradasi yang cepat exonucleolytic melalui exoribonuclease 3´C5´. Dalam kasus

terakhir, RNase E mengenali akses dari ujung 5´ dan setelah dilakukan

pembelahan akhir, selanjutnya degradasi fragmen oleh exonuclease 3´5´.21,22

Setelah pemotongan awal pada ujung 5´, endonuclease akan mengikuti rantai

ribosom menuju ke depan tempat RNase E. Pembacaan mRNA dari ujung 5´

selama pada tempat pembelahan lanjutan, RNase E akan menciptakan kesan

kemajuan dalam degradasi 5´3´. Kegiatan pada ujung 5´ telah dipelajari dalam

Universitas Syiah Kuala

Page 7: Degradasi MRNA Pada Bakteri

7

beberapa model. Salah satunya adalah RNA 1, regulator antisense dari ColE1.

RNA ini terdiri sembilan nukleotida untai tunggal pada ujung 5´, yang meliputi

daerah RNase E, diikuti oleh 99 nt yang dilipat menjadi tiga batang-loop (lihat

Gambar. 2). Pengantar stem loop pada daerah tertinggi 5´-terminus dapat

menstabilkan RNA ini, bahkan ketika peregangan untai tunggal diperpanjang.21

Seperti pada daerah stem loop oleh sebab itu akan bertindak sebagai stabilisator 5

´. Tingkat degradasi transkrip dengan ujung 5´ untai tunggal bersifat independen

dari urutan pada daerah ss, jarak ke tingkat atas dari tempat pembelahan internal

RNase E, dan potensi urutan yang mengarah ke tempat pembelahan ini dapat

membentuk struktur sekunder . Dengan sistem yang memiliki bukti cukup untuk

menyatakan bahwa endonuclease RNase E yang bertanggung jawab untuk pola

degradasi pada ujung 5´ messenger bakteri. Meskipun lebih mudah untuk

memahami bahwa pencernaan 3´5´ dari ujung 3´ ini sering dihalangi oleh stem

loop 3´, jauh lebih sulit untuk memahami inisiasi degradasi yang berasal dari

ujung 5´, karena exonucleases 5´3´ tidak dapat ditemukan di prokariota sampai

sekarang. Bakteri penstabil 5´ tidak dapat diarahkan ke exoribonucleases 5´3´.

Untuk memberikan hasil terhadap konsep 5´ yang stabil pada elemen RNA,

penstabil 5´ harus mampu untuk memberikan stabilitas pada jalur yang lain,

transkrip heterologous ketika melekat pada lainnya, stabilitas mungkin hanya

cukup mencerminkan situasi lokal tertentu dari messenger.

Gambar. 2. Penstabil 5´ di substrat RNA I. Substrat RNA I yang sangat terstruktur dapat distabilkan dengan jepitan penstabil 5´ ketika

Universitas Syiah Kuala

Page 8: Degradasi MRNA Pada Bakteri

8

dimasukkan di dekat 5´-terminus. Dengan destabilisasi daerah ss minimal 3-5 nt pada ujung 5´ penstabil 5´ tidak lagi mampu memblokir degradasi.

Pada E. coli ompA 5´-UTR bertindak sebagai stabilisator mRNA cis dari

growth-rate-regulated ompA. Dalam kondisi pertumbuhan yang cepat waktu

paruh pesan dari approx. 17 menit diamati, sebagai lawan 4 menit di bawah

pertumbuhan yang lambat. Memang, 5´-UTR dari ompA mRNA bertindak sebagai

stabilisator mRNA ditransfer ketika berbatasan dengan ujung 5´ lainnya, bahkan

pada mRNA yang tidak stabil dan panjang.23,24 Sebagai contoh, pesan lacZ dapat

distabilkan sementara yang masih normal diterjemahkan. Hal ini terutama struktur

ompA 5´-UTR yang stabil, bukan perubahan dalam kepadatan ketika

menerjemahkan ribosom. Sebagai bagian dari chemeric gen ompA 5´- UTR-bla,

ompA 5´-UTR dapat menstabilkan pesan bla yang berumur pendek.25 Ribosom

dalam hal ini memulai di urutan ompA SD dan diterjemahkan ke dalam wilayah

pengkodean dari bla. Melampirkan seluruh unit transkripsi bla (termasuk 5´-UTR

sendiri) dengan gen ompA (termasuk penstabil 5´-UTR) menciptakan chimeric

dicistron. Bahkan di dicistron ini penerjemah independen pesan bla ditandai stabil

dibandingkan dengan tipe bla yang tidak teratur, bahkan ketika kodon awal pada

bla diganti dengan kodon henti, sehingga memaksa pelepasan prematur dari

ribosom.26 Dalam tipe bla yang tidak teratur mengganti kodon awal dengan kodon

henti selanjutnya dapat mendestabilkan pesan yang tidak stabil.27

Bagian penting dari struktural ompA 5´-UTR telah dipelajari dengan

menggunakan analisis mutasi dari bagian struktur ini (lihat Gambar. 3). Sebuah

stem loop, tidak lebih dari 2-4 nt dari ujung tertinggi 5´, dan di dekatnya

diposisikan SS daerah 2 yang merupakan hal penting. Wilayah SS2 ini berisi

domain pengikat ribosom dan AUG dari kodon awal. Lebih dari 4 nt 5´ untuk

menjepit I yang menyebabkan destabilisasi messenger. Fitur detail dari stem loop

merupakan hal yang penting selama stem loop di ujung langsung. Urutan utama

dari stem loop dan daerah ss tidak berevolusi pada ompA 5´-UTRs. Kehilangan

pada stem loop I dapat menyebabkan degradasi akhir AUG tersebut. Kedua stem

loop, 11 nt akhir yang pertama, bukan merupakan hal penting lagi.

Universitas Syiah Kuala

Page 9: Degradasi MRNA Pada Bakteri

9

Gambar. 3. Struktur Organisasi dari 5´-UTR. ompA 5´-UTR terdiri dari dua wilayah fungsional penting: 5´ proksimal hairpin I dan untai tunggal wilayah SS2 yang berisi urutan Shine-Dalgarno dan kodon awal AUG

Analisis mutasi dari ss segmen 2 menunjukkan bahwa stabil dengan

saturasi hanya mengikat ribosom ke elemen SD yang kuat bukan oleh terjemaha

inisiasi. Mengganti AUG dengan kodon awal CUG yang tidak efisien mengurangi

penerjemahan secara dramatis tanpa mempengaruhi stabilitas messenger. Fakta

bahwa satu stem loop 5´ benar-benar dapat melindungi seluruh mRNA terhadap

peristiwa nucleolytic akhir yang sangat mendukung asumsi dari hubungan awal 5´

dari aktivitas endonucleolytic sebelum tindakan degradasi akhir. Tidak mungkin,

meskipun bahwa stem loop 5´ harus dibatalkan untuk memungkinkan lewatnya

nukleuse. Pertanyaan apakah aktivitas nucleolytic akhir dari RNase E akan tetap

terbuka untuk model sistem ini.24 Menggunakan pola bla yang terdiri dari ompA 5

´-UTR di daerah bla 5´-UTR, Arnold et al.24 menyatakan bahwa meskipun

kepadatan ribosom di wilayah yang tidak diterjemahkan lebih penting, ribosom

juga harus masuk ke wilayah pengkodean. Terminasi translasi dini yang

dipaksakan pada kodon awal dapat mendestabilkan messenger.

Penstabil 5´ juga telah dijelaskan pada messenger Rhodobacter pufBA dan

E. coli rnc operon RNA.28,29 Dalam kasus perinta pufBA yang ternyata lebih

kompleks dari struktur stem loop 5´ diperlukan dalam menstabilkan dicistron

internal yang dihasilkan melalui penghapusan tambahan cistrons bagian awal dan

akhir. Dalam operon rnc, 5´ menstabilkan kerja penjepit bersama dengan daerah

pembelahan RNase III pada bagian akhir.

Universitas Syiah Kuala

Page 10: Degradasi MRNA Pada Bakteri

10

Model yang paling meyakinkan untuk degradasi yang berasal pada ujung

5´ adalah penstabil 5´, dan 5´3´ diarahkan pada degradasi telah dikembangkan

untuk transkrip rpsT yang mengkode protein ribosom S20.30,113 Jumlah rpsT sangat

dikendalikan oleh efisiensi translasi bahkan tanpa adanya kunci RNases. Langkah

inisiasi penerjemahan sendiri, bukan hanya meliputi seluruh panjang messenger

dengan ribosom, tetapi harus berfungsi sebagai penjelasan untuk stabilisasi.31 Hal

ini menjadi jelas bahwa stem loop 5´ dari rpsT dapt menghambat pembelahan

RNase E b lebih dari 20 nt pada bagian akhir. Awalnya RNase E mengetahui ss

ujung 5 berisi tempat pembelahan. Mackie dan rekannya mengusulkan bahwa

dalam langkah kedua diasumsikan RNase E dimer akan mulai memindai letak

pembelahan bagian awal sementara masih melekat pada daerah pertama.32 Baru-

baru ini, melalui serangkaian eksperimen yang agak rapi mengedarkan mRNA dan

5´ antisense oligos, Mackie dapat menunjukkan bahwa substrat dengan ujung 5´

yang terutup tidak efisien diproses oleh RNase E.30 Hasil yang jelas adalah bahwa

RNase E membutuhkan ujung 5´ yang tidak berpasangan untuk akses tak terbatas

ke situs pembelahan bagian akhir pada wilayah pengkodean. Hal ini tidak

membuat perbedaan apakah RNase E hadir sebagai enzim yang terisolasi atau

sebagai bagian dari multi-enzim yang kompleks, degradosome, katalis degradasi.

Hal ini juga menjadi jelas bahwa RNase E membutuhkan nukleotida terminal

untuk membawa monofosfat 5´. Efek yang sama dari status fosforilasi dasar

terminal telah dicatat sebelumnya, namun belum dikaitkan dengan RNase E.33

Data ini segera memperlihatkan perlunya aktivitas fosfatase khusus dalam

mengkonversi 5´ trifosfat untuk monofosfat, sehingga mengalokasikan

messengertersebut untuk pengenalan oleh RNase E. Oleh karena itu akan muncul

untuk menjadi pembenaran untuk memanggil prokariotik 5'trifosfat yang setara

dengan pelindung struktur penutup 5' eukariotik. Model ini akan membuat

penjelasan elegan untuk pengamatan5´3´ secara langsung dari RNase E dan

pengaruh efisiensi translasi pada stabilitas messenger. RNase E akan diarahkan ke

ujung 5´ melalui pengenalan monofosfat. Pembacaan pada daerah pembelahan

dari posisi akan mengganggu proses terjemahan inisiasi atau terjemahan kodon

awal. Fragmen internal yang dihasilkan prose nucleolytic dari transkrip

Universitas Syiah Kuala

Page 11: Degradasi MRNA Pada Bakteri

11

polisistronik memiliki 5´ monofosfat di masing-masing ujung 5´. Hal ini mungkin

memerlukan strategi yang berbeda untuk perlindungan 5´ terhadap degradasi.28

Saat ini tidak ada konsensus apakah model penstabil 5´ umumnya berlaku

untuk sebagian besar mRNA dan untuk semua bakteri. Joyce dan Dreyfus34

mengambil keputusan yang berbeda dalam menggambarkan perlindungan 5´

terhadap lacZ mRNA dari E. coli yang membutuhkan ribosom untuk perjalanan

setidaknya 1 kb ke wilayah pengkodean untuk stabilisasi transkripsi lengkap.

Dengan tidak adanya terjemahan,penstabil 5´ tidak ditawarkan perlindungan yang

efektif terhadap RNase E akhir pada pembelahan messenger ini. Para peniti

mempertanyakan konsep E. coli penstabil 5´ dalam melindungi mayoritas

messenger terhadap degradasi. Menurut pendapat mereka perlindungan degradasi

pada E. coli bergantung pada terjemahan utama. Serangkaian kondisi dikutip di

mana efisiensi pergeseran penurunan dari terjemahan menyebabkan

ketidakstabilan mRNA. Dalam Bacillus sebaliknya, beberapa kasus dilaporkan di

mana ribosom terhenti di 5´-UTR dalam menstabilkan rangkain panjang pada

bagian akhir, apakah diterjemahkan atau tidak.35

3. Endoribonuclease E

Enzim ini telah telah disebutkan beberapa kali sebagai enzim kunci yang

tampak dalam inisiasi degradasi mRNA. Sudah ada penelitian tentang RNase E

yang telah memberikan kemajuan yang paling besar dalam pemahaman kita

tentang degradasi mRNA selama beberapa tahun terakhir. Dalam review baru

pada RNase E, enzim tersebut sebagai “enzim yanag masih sangat misterius”.36

Gen penting rne yang terdapat pada E. coli mengkodekan enzim dari 1061 asam

amino (lihat Gambar. 4). rne autoregulates mensintesis diri sendiri dengan

menekan konsentrasi transkrip melalui peningkatan tingkat kerusakan.37 Massa

molekul yang dihitung dari protein kode sebesar 118 kDa, tapi RNase E berjalan

pada posisi 180 kDa, mungkin karena terdapat daerah C-terminal yang memiliki

banyak prolin.38 Keanehan ini adalah merupakan banyaknya kebingungan di masa

lalu. Setengah dari N-terminal berisi pusat katalitik. Meskipun pada awalnya bukti

disajikan bahwa RNA pusat mengikat dearah dari asam amino 580 hingga 700

yang diperlukan untuk aktivitas katalitik, sekarang umum diasumsikan bahwa

Universitas Syiah Kuala

Page 12: Degradasi MRNA Pada Bakteri

12

kehadiran domain pengikat RNA kaya arginin ini tidak diperlukan lagi untuk

aktifitas.39-41 Domain ini memiliki kesamaan dengan domain pengikat RNA dari

70 kDa protein U1 snRNP pada manusia.38,42

Gambar. 4. RNase E sebagai enzim kunci dalam degradasi RNA bakteri. N-terminal membawa daerah homologi signifikan dengan CafA dan protein S1(lihat teks). Setengah C-terminal menunjukkan bukan hanya sedikit konservasi pada bagian-bagian komposisi preferensi asam amino yang jelas. Hal ini didedikasikan untuk interaksi protein-protein dengan komponen degradosome lain dan pengikat RNA

Aktifitas pembelahan RNA dari RNase E telah dipelajari dengan berbagai

substrat standar seperti prekursor 9S rRNA dari 5S rRNA, RNA I (regulator

antisense dari ColE1), mRNA yang mengkode OmpA, TrxA, dan protein ribosom

S20 dan S15 (rpsT dan rpsO). Produk pembelahan mengandung 5´ fosfat dan 3´

gugus hidroksil, pembelahan lebih endrung terjadi di daerah-daerah untaui

tunggal yang banya terdapat daerah A/U.43 Proposal asli menggambarkan kendala

struktural dari tempat pembelahan RNase E pada E. coli diperlukan urutan

konsensus beruntai tunggal yang longgar (A /G)AUU(A /U) dan tambahan lateral

dalam menstabilkan stem loop jangkar.44,45 Stem loop akan sama fungsinya sebagai

titik masuk atau menyimpan daerah target untai tunggal.46 Menariknya, daerah

pembelahan pada jenis ini juga diidentifikasi dalam R. capsulatus, suatu

organisme dengan kandungan GC jauh lebih tinggi daripada E. coli.47 McDowall

et al.48,49 baru-baru ini mengkaji ulang persyaratan pembelahan menggunakan

oligonucleotida dengan meniru tempat pembelahan RNase E pada RNA I.

Meskipun enzim menunjukkan pemilihan daerah A/U pada rantai tunggal, urutan

konsensus yang sederhana atau kebutuhan struktur sekunder (stem loop) di sekitar

5´ atau 3´ pada tempat pembelahan tidak bisa dikonfirmasi dengansistem in vitro.

Pengaruh dari pembentukan substrat secara keseluruhan mungkin terjadi. Sebuah

Universitas Syiah Kuala

Page 13: Degradasi MRNA Pada Bakteri

13

survei sistematis oleh Arraiano et al.50 dari tempat pembelahan endonucleolytic

pada E. coli dicistronic transkrip pyrF-Orff mengungkapkan total 27 tempat dan

urutan konsensus 12-nt potensial dengan 4-nt inti kaya A/U, tanpa kebutuhan

yang jelas untuk tambahan struktur sekunder. Pertanyaan apakah RNase E

mengenalai secara jelas pentingnya perhatian lebih di masa depan. Mungkin

pendekatan berbasis SELEX (evolusi sistematis ligan dengan pengayaan

eksponensial) akan membantu untuk menentukan struktur RNA yang berfungsi

sebagai substrat yang sempurna. Sekali lagi, struktur dan yang bukan urutan

utama tampaknya menjadi kunci untuk ini pengenalan RNA-protein.

Bagi mereka yang tertarik dalam struktur protein RNase E menawarkan

kekayaan tertentu, tidak mengherankan untuk protein sebesar ini. Setengah N-

terminal menunjukkan homologi yang luas dengan protein CafA pada E. coli

(protein untuk filamen aksial sitoplasma)51. CafA adalah protein 50 kDa yang

fungsinya belum diketahui yang mungkin bertindak atas unsur-unsur

cytoskeletal .52 RNase E mungkin memiliki fungsi tambahan dalam transportasi

RNA intraseluler. Reaksi silang dengan myosin rantai berat AB dan menunjukkan

kesamaan urutan dengan molekul tipe myosin.38,51 Homolog pada daerah CafA

juga mencakup sebuah domain S1 homologi. Ketika Bycroft dkk.53 menentukan

struktur E. coli PNPase S1 pada domain pengikat RNA (approx. 70 asam amino

yang panjang) mereka menunjukkan bahwa domain ini, yang awalnya

diidentifikasi dalam Protein ribosom S1, juga hadir dalam langsung N-terminal

dari RNase E dan pada C-terminal PNPase dan RNase II. Fakta bahwa S1 RBD

(untuk domain pengikat RNA) hadir dalam tiga RNases yang berbeda dapat

menunjukkan bahwa mereka berbagi fitur umum pengaturan. Para penulis

selanjutnya menunjukkan bahwa domain S1 yang terlipat memiliki kesamaan

yang tinggi terhadap domain cold shock (CSD) yang ditemukan dalam protein

cold shock (CSP). Protein ini ternyata berfungsi sebagai pendamping RNA dalam

sel eubacterial dalam berbagai situasi stres. CSD, dalam hubungannya dengan

domain pengikat RNA lainnya, memediasi RNA pengikat spesifik. Mungkin,

CSPs mengunci RNAs dalam keadaan linier yang membuat mereka dapat diakses

untuk terjemahan atau degradasi.54

Universitas Syiah Kuala

Page 14: Degradasi MRNA Pada Bakteri

14

Tak lama setelah itu, Py dkk. memurnikan dari E. coli 500-kDa kompleks

yang berisi RNase E, PNPase, dan protein yang tidak teridentifikasi lainnya.57

Immunoprecipitation kompleks dengan antibodi anti-PNPase diendapkan pada

pita 180 (RNase E), 104, 85 (PNPase K subunit), 74, dan 49 kDa. Pita-pita kecil

dari 92, 74, 52, 47, 45, dan 30 kDa juga diamati. Di kompleks ini penulis juga bisa

mengidentifikasi kegiatan yang menghambat exoribonuclease 3´5´yang paling

penting, PNPase. Faktor penghambat exoribonuclease ini tampaknya tidak

menjadi protein pengikat RNA dirinya sendiri melainkan copurifies dengan

PNPase.58 Efek yang sama dari exonuclease 3´5´ mengulur-ulur pada stem loop

yang terletak di ujung 3´dari RNA messenger yangj uga telah diamati pada B.

subtilis.59 Kebutuhan faktor protein tambahan untuk menjelaskan kinetika

perlindungan yang kuat terhadap prosses exonucleolytic 3´5´ oleh stem loop 3´

sudah diungkapkan oleh McLaren dkk.60 Dua pita protein dari persiapan

Carpousis yang asli kemudian diidentifikasi sebagai protein 50-kDa RhlB (untuk

RNA seperti helikase), dan 48-kDa enolase.61 Hal ini akan membuat enolase L

subunit PNPase, namun nomenklatur ini telah dipertanyakan.62 Kami akan

membahas peran helicases degradasi mRNA lebih lanjut.

4. PNPase

E. coli PNPase (pnp) umumnya digambarkan sebagai homotrimer dari 78-

kDa subunit, berjalan pada posisi gel yang sedikit lebih tinggi dari 86 kDa.63

PNPase dan RNase II (rnb) adalah dua exonucleases 3´5´ paling penting dalam

E. coli.64 PNPase adalah processif exonuclease Pi-dependent dengan aktivitas

polyadenylation. Enzim dalam mode phosphorolytic yang membuat difosfat

mononukleotida yang menghambat protein. RNase II bukan merupakan protein

monomer 70-kDa yang menciptakan 5´ NMP. Distribusi total aktivitas

exonuclease di E. coli antara kedua enzim adalah 90% untuk RNase II vs 10%

untuk PNPase.65 Kedua enzim tampaknya diatur dalam E. coli.66 Sebuah mutan

minus-ganda pada E. coli itu mematikan.67 Dalam B. subtilis pentingnya kedua

enzim agak terbalik.68 Kami juga akan kembali ke PNPase, setelah kami

membahas reaksi kompleks degradosome pada ujung 3´ dari mRNA.

Universitas Syiah Kuala

Page 15: Degradasi MRNA Pada Bakteri

15

5. Kinase Polyphosphate

Kinase polifosfat (PPK) merupakan komponen yang paling baru ini

diidentifikasi dari degradosome.69 Enzim homotetrameric, dibentuk dari 80-kDa

subunit, mengkatalisis konversi reversibel poly(P) dan ADP menjadi ATP.70 E.

coli merupakan sumber enzim yang banyak enzim. Menariknya, urutan protein

sangat dilestarikan diantara berbagai bakteri, sementara itu belum ditemukan di

beberapa genom bakteri benar-benar diurutkan.71 Blum dkk.69 menunjukkan

bahwa PPK berinteraksi dengan RNase E dan strain PPK minus menunjukkan

peningkatan stabilitas mRNA. Polifosfat yang bisa berasal dari berbagai sumber

memiliki efek penghambatan yang kuat pada degradasi RNA.70 PPK dapat

menghapus penghambatan poly(P) dan NDPS pada degradosome tersebut.

Protein lain yang dibahas sebagai komponen yang diduga dari

degradosome adalah GroEL dan DnaK.62,69,72,73

Tidak dibahas sebagai komponen potensial dari degradosome, dan agak

penting dalam degradasi mRNA, adalah RNase III (lihat tiinjauan Nicholson pada

buku ini). RNase III adalah RNase dsRNA-spesifik. Urutan konsensus daerah

pembelahan tejradi agak awal.74 RNase ini memotong hanya satu set kecil mRNA,

yang paling menonjol pada haipins dalam 5´-UTR dari pnp dan rnc. Pembelahan

inisial pada penstabil 5´ ini merupakan prasyarat untuk degradasi lebih lanjut

berikutnya.

6. Helicases

Ketika Py dkk.61 mengidentifikasi protein 50-kDa dari degradosome

sebagai protein RhlB yang juga mampu menunjukkan fungsi dari ATP-dependent

DEAD-box helicases (DEAD ada untuk mempertahankan motif dari asam amino

Asp-Glu-Ala-Asp yang ditemukan dalam keluarga protein ini). Helicases adalah

protein yang membuka asam nukleat beruntai ganda, apakah itu DNA ataupun

RNA. Berdasarkan urutan homologi mereka dapat dikelompokkan menjadi lima

superfamilies (SF).75,76 Helicases RNA jatuh ke SF I dan II. Mereka memiliki

tujuh motif rangkaian urutan dalam keterlibatan Mg2+, ATP, dan pngikat RNA.

Helicases ini mungkin adalah protein dimer dan mereka membutuhkan untai

tunggal yang menggangtung untuk menyerang dupleks. DEAD-box helicases

Universitas Syiah Kuala

Page 16: Degradasi MRNA Pada Bakteri

16

RNA adalah bagian dari helicases SF II dan berbagi wilayah inti sekitar 300 asam

amino, dengan delapan motif yang sangat.77 Subfamilies dari protein DExH- atau

DEAH-box. Berdasarkan hal ini penulis menggunakan substrat RNA dengan

hairpins memisahkan 5´ dan 3´ pada bagian beruntai tunggal. Substrat ini berasal

dari daerah intercistronic malE-malF. Ketika diinkubasi dengan fraksi

degradosome dalam ketiadaan ATP, substrat ini terdegradasi oleh proses PNPase

3´5´ sampai PNPase mengani pangkal batang (lihat Gambar. 5). Degradasi

lebih lanjut hanya diamati ketika ATP ditambahkan. Ternyata, RhlB yang terurai

pada hairpin dalam reaksi ATPconsuming dan dengan demikian membantu

degradasi RNA terstruktur oleh PNPase, yang dinyatakan ditangkap ketika

bertemu struktur sekunder seperti haripin. Helicases sebagai bagian dari

degradosome, oleh karena itu harus diberi peran utama dalam pergantian RNA.78

Gambar. 5. Tindakan helicase di degradosome. Degradosome-dependent degradasi 3´5´ stabil pada stem loop 3´ yang membutuhkan aktivitas pembalikan ATP-dependent dari komponen helicase degradosome.

Alternatif pilihan dari RNase E untuk ujung 5´ monofosfat, kekuatan

katalitik dari degradosome dalam konteks ini tampaknya diarahkan terutama pada

ujung 3´ RNA.30 Bagaimana organisasi struktural kompleks sesuai ke dalam

gambar?

Universitas Syiah Kuala

Page 17: Degradasi MRNA Pada Bakteri

17

7. Struktur dari degradosome

Pusat katalitik untuk kegiatan endonucleolytic di RNase E secara eksklusif

terletak di paruh protein N-terminal protein (lihat Gambar. 4 dan 6).40,41,79 Dalam

sebuah penelitian untuk memahami struktur domain dari RNase E, Vanzo dkk.62

menganalisis peran RNase E dalam pertemuan degradosome E. coli. Separuh C-

terminal dari RNase E mengandung daerah pengikat yang berbeda untuk tiga

komponen degradosome DEAD-box helicase RhlB, enolase, dan PNPase.

Pertemuat tampaknya dibuat pada dasar 1-1 antara RNase E dan ligan, sementara

tidak ada interaksi langsung antara ketiganya. Secara khusus, tidak ada interaksi

antara PNPase K subunit dan enolase yang diamati, membuat lebih

mepertanyakan fakta bahwa enolase awal bernama L subunit PNPase.61 Vanzo

dkk. juga menunjukkan bukti langsung untuk oligomerisasi RNase E, yang sudah

diusulkan oleh Mackie.32 RhlB helicase sangat aktif ketika bertemu dengan

domain pengikat RNase E. RNase E, selain kemampuan katalitik sendiri, dengan

C-terminal platform pertemun untuk degradosome tersebut. Separuh C-terminal

dipotong dari E. coli RNase E dapat mengikat komponen degradosome PNPase,

RhlB, dan enolase.80

Gambar. 6. Degradosome prokariotik. Skema ini menyajikan model untuk organisasi struktural degradosome yang bekerja pada ujung 3´. Berbagai jenis genangan pada fosfat dalam lingkungan mikro ini adalah ortho-phosphate Pi, poly-phosphate (Pi)n, mononucleotide diphosphates NDP, dan ATP. Penghambatan atau stimulasi di pengaruhi dari genangan ini pada degradasi mRNA ditunjukkan dengan + atau - . NDPS penghambat PNPase, poli-fosfat mungkin menghambat helicase. Model menampilkan dari ide-ide saat ini tentang interaksi yang dikenal komponen degradosome. PPK, poli-fosfat kinase; PNPase, polinukleotida kinase.

Universitas Syiah Kuala

Page 18: Degradasi MRNA Pada Bakteri

18

Lab kami baru-baru ini memurnikan degradosome dari R. capsulatus

(Fuhrmann, Rauhut dan Klug, hasil tidak dipublikasikan). Sebuah RNase E dari

`tipe 180'-kDa, RhlB helicase, enolase, dan PNPase hadir di kompleks dan, yang

paling menarik, sebuah DEAD-box RNA helicase kedua 65 kDa. Kompleks ini

akan dapat beroperasi dalam mode yang sama seperti yang dicoba pada E. coli.

Sekarang saatnya untuk melihat saat ini dikenal RNases E untuk melihat

apakah semuanya cocok untuk bertindak sebagai degradosome perakit. Sebuah

kompilasi terbaru dari RNases E membandingkan enzim dari E. coli,

Haemophilus influenzae, Synechocystis, Porphyria kloroplas, dan Mycobacterium

tuberculosis80 Enzim dari Synechocystis dan Porphyria kloroplas dilaporkan

hanya memiliki panjang sekitar 50% dari protein E. coli dan H. influenzae. Bagian

yang dilaporkan jelas homolog dengan N-terminal dari dua terakhir. Enzim E.

coli, H. influenzae, dan M. tuberculosis memiliki panjang yang. Dua sebelumnya

sangat homolog N-termini, C-termini mereka menjadi sangat berbeda. M.

tuberculosis menunjukkan homologi terbatas atas panjang seluruhnya.

Penerbitkan dari genom Rickettsia prowazekii menunjukkan adanya satu-satunya

panjang asam amino 683 RNase E. Hanya N-terminal duapertiga menunjukkan

homologi yang biasa (dengan memasukkan asam amino 90 di akhir N-terminal) .

Jika situasi tiba-tiba dipersingkat C-termini saja harus sudah memberikan alasan

untuk meragukan kehadiran umum dari degradosome RNase E-dimediasi, maka

lebih jadi ketika kita mempertimbangkan fakta bahwa hampir semua genom

bakteri benar-benar diurutkan kekurangan terdeteksi RNase E seperti protein.

Evolusi tidak hanya ditemukan solusi di¡erent untuk C-terminus dari RNase E,

tetapi juga untuk seluruh kegiatan dicontohkan oleh RNase E. 13,3 kDa protein

ARD-1 dari sel manusia adalah analog fungsional E. coli RNase E, saham fitur

struktural, dan dapat menyelamatkan RNE-kekurangan strain E. coli.81,82

Sangat menarik, meskipun, untuk melihat degradosome kompleks yang

telah dijelaskan dalam organel seluler seperti kloroplas dan mitokondria, baik asal

bakteri. Sebuah kompleks massa molekul kloroplas tinggi dengan PNPase dan

enzim RNase E-seperti telah dijelaskan 83,84 Kegiatan RNase E memiliki massa

molekul 67 kDa dan dikenali oleh E. coli anti-RNase E antibodi. Dalam ragi

mitokondria kompleks mtEXO berisi tiga protein utama dengan aktivitas

Universitas Syiah Kuala

Page 19: Degradasi MRNA Pada Bakteri

19

exonuclease 3´5´ dan terlibat dalam degradasi mtRNA.85 Kompleks

menunjukkan persyaratan NTP untuk kegiatan dan aktivitas nuklease NTPase,

baik menunjukkan adanya sebuah helicase. Salah satu komponen baru-baru ini

diidentifikasi sebagai DexH-box RNA helicase.86 Inti Ragi berisi perbedaan jenis

dengan kompleks massa molekul tinggi, exosome.87 Kompleks 300-400 kDa ini

terdiri lima tempat singgah pada exonucleases 3´5´, sebagian besar homolog E.

coli exonucleases 3´5´, tapi tidak ada helicases. Semua nukleus merupakan

bagian penting yang dibutuhkan untuk pemrosesan prekursor rRNA. Berinteraksi

dengan tergantung ATP helicases RNA seperti Dob1p ragi dan Ski2p, exosome

mungkin memiliki peran penting dalam omset mRNA dari semua eukariota.88-90.

Juga degradosome E. coli ditunjukkan baru-baru ini terlibat dalam degradasi

rRNA pada E.coli.91

8. Ujung 3´-

Selama perjalanan kami melalui molekul RNA, kita sekarang harus bisa

melihat ke dalam struktur dan proses khusus pada ujung 3´. Dan itu mungkin ini

akhirnya yang menjalani pemikiran ulang yang paling jauh jangkauannya. Stem

loop pada unit transkripsi pada ujung 3´ dan pada daerah intercistronic merupakan

fitur menonjol dalam prokariota.92 Kedua jenis dapat berfungsi sebagai ukuran

perlindungan terhadap exonucleases 3´5´.12,93,94 Sebagian mRNA prokariotik

menampilkan 3´-UTR pada bagian akhir dari translasi kodon henti. 3´-UTRs

mengandung unsur intrinsik rho-independent terminasi transkripsi stem loop yang

sulit untuk dibedakan dari benar penstabil 3´.60,64,95 Sebuah analisis komputer baru-

baru ini menyelesaikan proyek genom prokariotik mengungkapkan bahwa

sebagian besar organisme tidak membentuk hairpin pada 3´-UTRs.96 Akhirnya

memiliki implikasi yang mendalam, tidak hanya untuk terminasi transkripsi, tetapi

juga untuk degradasi mRNA.

Anehnya, ada terdapat hal lebih di akhir. Selama beberapa tahun terakhir

telah menjadi jelas bahwa j mRNA prokariotik juga polyadenylated.97 Dalam

prokariota ekor poly (A) mRNA bisa sampai panjang 60 nt. Pada E. coli ekor poly

(A) mungkin memiliki panjang antara 15 dan 50 nt.98 Li dkk.99 mengusulkan

bahwa polyadenylation adalah fitur umum pada E. coli, bahkan untuk RNA kecil

Universitas Syiah Kuala

Page 20: Degradasi MRNA Pada Bakteri

20

yang stabil. Sementara ekor poly (A) pada eukariota mempengruhi kestabilan

pada messenger RNA, mereka tampaknya melakukan hal yang berlawanan dalam

RNA prokariotik (lihat juga artikel tentang polyadenylation eukariotik dalam

buku ini).100 Dua poly (A) polimerase dari 53 dan 35 kDa telah diidentifikasi di E.

coli, PAPI dan PAPII.101,102 Situasi yang sama diamati di B. subtilis.103

PNPase dan RNase II hanya bisa mengerahkan proses 3´5´ pada ujung 3

´ lebih dari selusin atau nukleotida yang tidak berpasangan, yang terletak 3´ ke

stem loop 3´.104 Dan ini adalah di mana polyadenylation memasuki daerah kerja.

Mungkin itu adalah polyadenylation yang memudahkan akses ke transkrip untuk

satu atau lebih exonucleases 3´5´. Di hadapan ekor poly (A) jumlah urutan

substrat diakses untuk PNPase pencernaan meningkat secara dramatis. Dengan

tidak adanya polimerase poly(A) degradasi ompA, trxA, dan rpsO mRNA di E.

coli melambat.98,105 Demikian pula, kerusakan RNA I mempercepat melalui

adenilasi 3´.33 Kekurangan PNPase atau RNase II pada strain E.coli menunjukkan

peningkatan tajam dalam jumlah dan panjang pada ekor poly(A).106

Menambahkan 3´ sehingga merekrut PNPase dan kompleks degradosome ke

ujung 3´ menyediakan model yang menarik untuk mengatasi hambatan dari

struktur 3´ stabil. Oleh karena itu mengumpan untuk berspekulasi tentang protein

pengikat poly (A) dan polimerase poly (A) dirinya sebagai bagian dari

degradosome tersebut. Sampai sekarang tidak ada telah ditemukan di

degradosome.61 Di sisi lain, telah dilaporkan untuk substrat RNA I yang

menambahkan ekor poly (A) yang panjang mencegah pembelahan substrat

endonucleolytic ini dengan RNase E. RNase E dapat memperpendek ekor poly(A)

3´5´ dalam exonucleolytic tetapi tidak dalam proses yang ketat! Dalam hal ini,

pemendekan ekor poly(A) ke ambang batas panjang kritis membuat RNA yang

dapat diakses untuk degradasi.41

Bagian penting dari pengetahuan kita tentang kegiatan di ujung 3P berasal

dari pengamatan yang dilakukan dalam organel trunan prokariotik, kloroplas.

Sebagian mRNA kloroplas memiliki stem loop dalam 3P-UTR mereka yang

berfungsi sebagai penstabil pada bagian awal, tetapi mereka tidak polyadenylated.

Mereka yang dapat menunjukkan panjang ekor poly(A) (atau lebih tepatnya ekor

kaya akan poli (A) -rich dengan diselingi Gs) yang cukup.107 Dalam kloroplas

Universitas Syiah Kuala

Page 21: Degradasi MRNA Pada Bakteri

21

bayam polyadenylation tampaknya berakhir untuk degradasi RNA oleh

exonucleases. Sebuah homolog protein PNPase bakteri, yang exoribonuclease

100RNP, yang secara khusus memotong ekor poly(A), dan kegiatanseperti pada

PAP telah ditemukan di kloroplas. Kloroplas PNPase itu terbukti berhubungan

dengan protein seperti RNase E di pada kompleks massa molekul tinggi.

Kompleks ini mengandung protein tambahan yang mengikat stem loop 3´

sehingga memberikan perlindungan dari degradasi.84 PNPase menunjukkan

afinitas tinggi pada ekor poly(A) dan sangat erat kaitannya dengan PAP.83,108

Polyadenylation dan adanya struktur seprti degradosomei pada kloroplas

meminjamkan kepercayaan bahwa kloroplas dan bakteri masih menggunakan

mekanisme umum untuk degradasi mRNA. Pertama, pembelahan endonucleolytic

pada pengkodean 3´ atau 3´-UTR oleh RNA matang pada endonuclease seperti

RNase E akan menghasilkan RNA tanpa stem loop 3´. Polyadenylation berikutnya

berada `bebas 'pada ujung 3´ akan membuat mereka lebih menyukai afinitas

substrat yang tinggi untuk PNPase.83,109

Jika bakteri stem loop 3´ sangat stabil atau berhubungan dengan faktor

penghambat exonuclease, sehingga sangat kuat melindungi terhadap degradasi

dengan mengulur-ulur exonucleases di pangkal batang 3´, pembelahan tingkat

pembatasan RNA pada daerah RNase E bagian awal stem loop adalah cara lain

untuk menghilangkan hambatan ini.58,60,110 Tanpa perlindungan tempat masuk 3´

memimpin untuk degradasi cepat dari messenger oleh RNase II dan PNPase.

Coburn dan Mackie111 baru-baru ini mencoba untuk menempatkan model ujung 3´

untuk tes dalam in vitro dengan sistem degradasi yang dilarutkan. Mereka

menggunakan degradasi fragmen 3´-terminal rpsT mRNA (protein ribosom S20).

Fragmen ini merupakan produk degradasi RNase E-tergantung dan merupakan

bagian dari wilayah pengkodean dan 3´-UTR. Degradosomes tidak dapat

menurunkan fragmen ini bahkan ketika adenylated. Sebaliknya, siklus

polyadenylation dan tindakan PNPase sepenuhnya menurunkan fragmen in vitro.

Jadi in vitro dilarutkan sistem degradasi hanya membutuhkan RNase E

(pemotongan internal yang awal), PNPase, PAP I, ATP dan Pi. Fakta bahwa ATP

dapat diganti dengan ATPQS non-terhidrolisis, cocok untuk PAP I tetapi tidak

untuk RhlB, menunjukkan bahwa aksi RhlB helicase tidak diperlukan. Anehnya,

Universitas Syiah Kuala

Page 22: Degradasi MRNA Pada Bakteri

22

RNase II dapat menangkal degradasi jalur dengan menghapus ekor poly (A) dari

intermediet PNPase-degradable.110 Tanpa ekor poly (A) degradosomes seharusnya

tidak lagi bertindak dari ujung 3´, tetapi terpaksa menggunakan jalur

endonucleolytic yang tergantung pada letak pembelahan RNase E dari bagian

RNase E awal. Telah dilaporkan untuk RNA I RNA bahwa kehadiran ekor

poly(A) yang panjang memang mencegah pembelahan endonucleolytic dari

transkrip primer dengan RNase E. Transkrip dengan ekor pendek atau tanpa ekor

yang akan di lakukan pembelahan.41

Mengutip antara bukti lain, bahwa dalam vivo yang setengah hidup dan

tingkat mRNA untuk rpsT adalah sama di strain yang kekuranagn PAP I, Coburn

dan Mackie111,113 tidak percaya polyadenylation yang merupakan prasyarat umum

untuk kerusakan mRNA.

Tergantung pada stabilitas struktur 3´-terminal dengan baik alat degradatif

diterapkan sebagai gantinya: berakhir terstruktur yang tersedia untuk serangan

exonucleolytic (RNase II, PNPase), lebih stabil struktur stem-loop seperti di RNA

saya memerlukan satu satu polyadenylation-waktu.33 Stem loops stabil, seperti

dalam rpsT, memerlukan pengulangan aksi PAP I dan PNPase seperti ditunjukkan

pada Gambar. 7. Hanya struktur yang paling stabil memerlukan degradosome

degradasi, lengkap dengan helicases dan hidrolisis ATP.61 Pembelahan diprakarsai

oleh RNase E sini pada ujung 3´ dapat juga dikombinasikan dengan perlindungan

degradasi dengan menerjemahkan ribosom.112 rpsO messenger (protein ribosom

encoding S15) membentuk dicistron dengan pesan pnp akhir. RNase E memotong

10 nukleotida akhir dari rpsO kodon henti. Pembelahan ini menghapus sebuah

hairpin bagian akhir dari tempat pembelahan yang pada gilirannya merupakan

prasyarat untuk degradasi berikutnya oleh 3´5´ PNPase. Jarak antara kodon

henti dan tempat pembelahan sangat penting untuk stabilitas. Memperluas

mendestabilkan messenger, akan membawa ke tempat pembelahan yang di luar

jangkauan dari perlindungan dari ribosom yang terikat.

Universitas Syiah Kuala

Page 23: Degradasi MRNA Pada Bakteri

23

Gambar. 7. Polyadenylation sebagai alternatif untuk degradosome. Skema ini, diadaptasi dari111, menggambarkan interaksi yang kompleks dari exonucleases 3´5´ dan PNPase pada ujung 3´ rpsT mRNA (protein ribosom S20). Aktifitas polyadenylation dan exonuclease yang yang cukup untuk mendegradasi, sementara aktivitas helicase tidak diperlukan untuk hairpin ini. RNase II digambarkan sebagai ekor poly(A) yang memperpendek exonuclease, sehingga membuat RNA kurang rentan terhadap degradasi. PAP I, poli (A) polimerase I

8. Prospek

Apa yang akan menjadi arah masa depan penelitian degradasi RNA? Jika

degradasi RNA adalah proses yang benar-benar responsif terhadap perubahan

lingkungan, mekanisme harus dipahami yang mengirimkan sinyal lingkungan

tertentu seperti suhu yang lebih rendah atau penurunan tekanan parsial oksigen ke

target molekul yang berbeda dari proses degradatif, sehingga perubahan tertentu

dalam waktu paruh dari RNA tertentu saja dapat dicapai.

Kemajuan telah dibuat dalam pemurnian dan karakterisasi fisik dari

beberapa enzim kunci yang terlibat, terutama RNase E. Sekarang, setelah

bertahun-tahun sejarah pemurnian bermasalah, kita memiliki pemahaman yang

lebih baik dari protein daripada yang kita miliki dari substrat dari RNase E.

persyaratan struktural yang menentukan kebutuhan tempat pembelahan untuk

diselidiki secara lebih rinci menggunakan teknik baru dan kumpulan substrat agak

terbatas saat ini digunakan untuk studi degradasi RNA perlu diperpanjang.

Masa depan akan menunjukkan apakah mesin degradosomelike benar-

benar prototipe untuk degradasi RNA bakteri. Organisme lebih harus dipelajari

untuk memperbaiki gambar sangat bias oleh E. coli. Degradosome yang mungkin

Universitas Syiah Kuala

Page 24: Degradasi MRNA Pada Bakteri

24

berisi lebih komponen yang perlu diidentifikasi. Berbagai pita protein kecil dalam

pemurnian saat protokol kation adalah kandidat yang menjanjikan untuk

menemukan fungsi baru, untuk memberikan jawaban atas pertanyaan-pertanyaan

seperti apa yang menarik degradosome ke 3´-UTR, 5´ monofosfat atau tempat

pembelahan internal.

Universitas Syiah Kuala