Proposal penelitian

EFEKTIFITAS PENAMBAHAN VITAMIN E (Alfatokoferol)DALAM PENGENCER SUSU SKIM KUNING TELUR TERHADAP

KUALITAS SPERMATOZOA PERANAKAN KAMBING BOER SETELAH PEMBEKUAN

TAUFIK AKBAR

0402101010027

FAKUTAS KEDOKTERAN HEWAN UNIVERSITAS SYIAH KUALA

DARUSSALAM, BANDA ACEH2009

1

BAB 1. PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang Upaya perbaikan mutu genetik ternak kambing di propinsi NAD telah

dilakukan melalui perkawinan silang antara ternak kambing betina lokal dengan ternak kambing pejantan unggul. Namun perkawinan silang dengan pejantan unggul ternyata masih menghadapi kendala karena terbatasnya pejantan unggul dan mahalnya harga pejantan, sehingga sulit terjangkau oleh para peternak dipedesaan. Keterbatasan ini dapat diatasi melalui pemanfaatan teknologi reproduksi inseminasi buatan (IB), karena dengan teknologi IB di samping mampu meningkatkan produktivitas dan mempercepat penyebaran populasi dengan mutu genetik yang lebih baik, juga diharapkan akan dapat mengoptimalkan fungsi seekor pejantan.

Untuk lebih meningkatkan efisiensi serta lebih mempercepat dan memperluas penyebaran ternak unggul, penerapan IB dapat dilakukan dengan menggunakan semen beku. Semen beku dapat disimpan untuk jangka waktu yang lama dan dapat dimanfaatkan kapan saja bilamana diperlukan. Akan tetapi proses pembekuan semen pada ternak kambing masih banyak mengalami hambatan seperti rendahnya viabilitas dan fertilitas spermatozoa. Hambatan-hambatan tersebut disebabkan oleh banyaknya faktor yang berpengaruh dalam prose pembekuan semen seperti terjadinya cekaman dingin (cold shock), cekaman osmotik (osmotic shock), kerusakan intraselluler akibat terbentuknya kristal es dan perubahan permeabilitas membran yang menyebabkan kematian sel saat pencairan kembali (Toelihere, 1997). Disamping itu tingginya rasio antara asam lemak jenuh dan asam lemak tidak jenuh, komposisi fosfolipid membran serta rendahnya kolesterol membuat membran spermatozoa kambing mudah mengalami cekaman dingin dan menjadi lebih rentan terhadap kerusakan akibat peroksidasi yang dapat merusak komponen struktural membran (White, 1993 dan Dasrul 2006). Upaya untuk meminimalkan penurunan kualitas spermatozoa akibat peroksidasi lipid selama proses pembekuan dapat dilakukan dengan cara penambahan antioksidan pada bahan pengencer .

Vitamin E (alfa tocopherol) merupakan salah satu vitamin yang bersifat sebagai anti oksidan yang larut dalam lemak. Vitamin E mampu menangkap radikal bebas dan mencegah terjadinya reaksi berantai, sehingga dapat menghindari kerusakan peroksidatif yang berpengaruh terhadap viabilitas dan fertilitas spermatozoa (Halliwel dan Gutteridge, 1993). Vitamin E berfungsi sebagai anti oksidan intra seluler yang paling kuat dalam mengurangi atau mencegah peroksidasi asam lemak tak jenuh di dalam dan di dinding sel (Donelly et al., 1999). Penambahan vitamin E 200-500 milligram dalam medium pengencer semen kerbau dapat menghambat penurunan motilitas, viabilitas dan kerusakan DNA spermatozoa (Hughes et al., 1998). Namun penambahan vitamin E dalam medium pengencer susu skim kuning telur pada semen kambing peranakan Boer selama pembekuan laporannya masih terbatas, sehingga perlu dilakukan penelitian lebih lanjut.

Tujuan Penelitian1. Untuk mengamati efektivitas penambahan vitamin E di dalam medium

pengencer susu skim kuning telur terhadap motilitas dan viabilitas spermatozoa dalam proses pembekuan semen kambing peranakan Boer

2

2. Untuk menentukan dosis optimal vitamin E yang dapat digunakan dalam medium pengencer susu skim kuning telur terhadap kualitas spermatozoa kambing peranakan Boer

Hipotesa penelitian1. Penambahan vitamin E dalam medium pengencer susu skim kuning telur

dapat mempertahankan motilitas dan viabilitas spermatozoa dalam proses pembekuan semen kambing peranakan Boer

2. Dosi vitamin E di ditambahkan dalam medium pengencer susu skim kuning telur berpengaruh terhadap kualitas spermatozoa kambing peranakan Boer

Manfaat PenlitianManfaat penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi lebih lanjut

tentang bahan pengenceran yang tepat pada proses pembekuan semen kambing peranakan Boer dengan kualitas fungsional sperma yang tetap tinggi.

TINJAUAN PUSTAKA

Karakteristik Semen Kambing Boer. Semen kambing Boer yang sehat umumnya berwarna keabu-abuan, putih

susu atau putih kekuningan dengan konsistensi agak kental (Yonghong, 2001). Volume semen kambing Boer bervariasi menurut individu, umur, berat badan, pakan dan frekuensi penampungan. Volume semen kambing Boer yang dewasa di Indonesia berkisar antara 0,70 ml – 1,50 ml (Suyadi dkk. 2003). Konsentrasi spermatozoa pada kambing Boer di Indonesia berkisar antara 500 – 800 juta/ml dengan rata-rata 560 juta/ml (Gangyi dkk., 2001). Derajat keasaman (pH) semen kambing Boer relatif agak asam yaitu berkisar antara 6,4 – 7,6 atau pH netral rata-rata 6,8 (Suyadi, 2003). Derajad keasaman sangat menentukan status kehidupan spermatozoa di dalam semen. Semakin rendah atau semakin tinggi pH semen dari pH normal akan membuat spermatozoa lebih cepat mati (Suyadi dkk., 2002).

Secara umum semen terdiri dari dua bagian besar yang plasma seminalis dan spermatozoa. Plasma seminalis merupakan cairan yang disekresikan terutama oleh kelenjar vesikularis dan kelenjar aksesoris lainnya, berfungsi sebagai medium transport spermatozoa dari lingkungan saluran reproduksi jantan ke traktus reproduksi betina selama ejakulasi, sebagai medium aktivasi bagi spermatozoa non motil dan menyediakan penyangga serta kaya akan makanan yang penting untuk hidup spermatozoa setelah deposisi ke traktus reproduksi betina. Plasma seminalis sebagian besar terdiri dari air merupakan cairan netral dengan tekanan isotonik serta berisi substansi organik dan anorganik secagai cadangan makanan dan perlindungan spermatozoa. Zat organik yang terdapat dalam plasma semen adalah fruktosa, sarbitol, inositol, asam sitrat, gliserilfosforilkolin, fosfolipid, prostaglandin dan protein. Fruktosa merupakan sumber energi terbesar untuk spermatozoa dalam semen. Sedangkan zat anorganik utama plasma semen terdiri natrium, klorida, fosfor, bikarbonat, kalsium, fosfor asam sitrat, asam askorbat, magnesium, nitrogen dan kolesterol (Hafez, 2004).

3

Secara essensial struktur morfologi spermatozoa pada berbagai mammalia relatif sama, tetapi bentuk dan ukurannya berbeda-beda antar spesies. Gangyi dkk. (2001) melaporkan panjang keseluruhan spermatozoa kambing Boer berkisar antara 60 - 65 µm yang secara fungsional terdiri dari dua bagian utama yaitu kepala dan ekor. Kepala spermatozoa kambing Boer pada umumnya berbentuk oval dan lonjong dengan ujung depannya lebih lebar. Panjang kepala spermatozoa kambing berkisar antara 8,0 – 10,0 µm, lebar antara 4,0 – 4,5 µm dan tebal antara 0,5 – 1,5 µm.

Kepala spermatozoa sebagian besar terisi padat dengan DNA yang berfungsi sebagai pembawa informasi genetik termasuk penentuan jenis kelamin embrio. Ekor merupakan bagian terpanjang dari spermatozoa, berfungsi untuk produksi energi dan pergerakan serta pengendalian arah spermatozoa pada saat fertilisasi. Hafez (2004) menyatakan rata-rata panjang ekor spermatozoa kambing adalah 70,0 1,24 um yang terbagi dalam 3 daerah utama yaitu middle piece (ekor bagian tengah), principle piece (ekor bagian utama), dan end piece (ekor bagian ujung).

Komposisi dan fungsi Membran Spermatozoa Spermatozoa dari kepala sampai ekor diselaputi oleh membran sel, yang

mempunyai struktur sangat kompleks dalam susunan mozaik yang teratur dan memiliki peran biologik spesifik pada permukaannya (Jones, 1989). Membran sel berfungsi sebagai pembatas sel kontineus, mempertahankan integritas sel dan membentuk interfase dinamis antara sel dengan lingkungan sekitarnya (Curry and Watson, 1995). Permukaan membran spermatozoa mempunyai polaritas yang tinggi dengan struktur daerah yang secara geografis jelas pembagiannya. Membran akrosom kepala berfungsi untuk kapasitasi, reaksi akrosom dan penembusan ovum pada proses fertilisasi. Membran bagian belakang akrosom (post acrosomal region) berfungsi untuk mengadakan kontak pertama dan menjadi satu dengan oolema ovum pada proses fertilisasi, sedangkan membran pada bagian tengah (mid piece) ekor berfungsi untuk mendapatkan substrat untuk energi spermatozoa dan menghantarkan gelombang gerak, serta membran bagian utama (principle piece) berfungsi untuk pergerakan spermatozoa.

Secara umum membran spermatozoa tersusun dari lipid, protein dan karbohidrat serta zat lain yang bergabung bersama secara non kovalen dan sangat sensitive terhadap faktor-faktor ekstrinsik seperti suhu, kekuatan ionik dan polaritas pelarut ( Kelso dkk., 1997). Lipid merupakan komponen utama penyusun struktur membran spermatozoa, yang berperan penting dalam menjaga stabilitas dan kelangsungan hidup spermatozoa secara keseluruhan, termasuk kemampuan spermatozoa untuk mengkapasitasi serta membuahi sel telur (Darnel, 1990).

Fosfolipid merupakan komponen lipid utama pembentuk struktur dasar membran yang bersifat amfipatik. Sifat amfipatik dari molekul-molekul ini memungkinkan pembentukan membran lapis ganda kepala fosfolipid hidrofilik dan kepala fosfolipid hidropobik (Hammerstedt, 1992). Selanjutnya Kelso dkk. (1997) menyatakan bahwa fosfolipid membran spermatozoa mammalia mengandung asam lemak poli tak jenuh (poli unsaturated acide) dalam konsentrasi yang sangat tinggi. Decoxahexanoyl acide (DHA) merupakan asam lemak poli tak jenuh terpenting pada membran spermatozoa, mewakili 30 % total asam lemak dan 70 % asam lemak poli tak jenuh terikat fosfolipid (Alvarez and Storey, 1995). DHA selain penting dalam meregulasi fluiditas membran yang dibutuhkan untuk memelihara berbagai aktivitas

4

enzim dan penyempurnaan peristiwa fusi membran dengan oosit. juga merupakan substrat utama dari peroksidasi lipid. Hampir 90% dari tingkat peroksidasi lipid pada spermatozoa dipengaruhi oleh tingginya konsentrasi DHA terikat fosfolipid. Oksidasi DHA terikat fosfolipid juga ditunjukan sebagai faktor utama yang menentukan lama hidup spermatozoa motil in vitro (Alvarez and Storey, 1984), merosotnya akrosom dan oksidasi DNA (Fraga dkk., 1996).

Pengenceran dan Pembekuan SemenSebelum semen dibekukan, terlebih dahulu dilakukan penambahan pengencer

dengan tujuan untuk memperbanyak volume semen dan menunjang daya hidup spermatozoa. Pengencer harus mengandung sumber energi untuk kelangsungan hidup spermatozoa, unsur penyanggah bertekanan osmosa isotonik, tidak meracuni spermatozoa, dapat melindungi spermatozoa dari pengaruh buruk pembekuan dan mengandung antibiotik untuk melindungi semen dari kontaminasi (Toelihere, 1985).

Pengencer yang banyak digunakan untuk pembekuan semen dan telah berhasil baik adalah pengencer yang menggunakan penyanggah tris yang dikombinasikan dengan gula monosakarida. Situmorang dan Sitepu, (1991) menyatakan tris kuning memberikan motilitas spermatozoa pasca thowing yang lebih tinggi dibandingkan dengan sitrat kuning telur. Tris selain mempunyai sistem penyangah yang baik juga memiliki toksisitas yang rendah. Telah banyak dibuktikan bahwa penggunaan pengencer tris untuk pengenceran semen kambingbaik untuk perlakuan cair maupun beku. Penggunaan bahan pengencer tris juga sering ditambah dengan kuning telur (Toelihere, 1981).

Kuning telur mengandung banyak bahan yang diperlukan oleh spermatozoa (Sorensen, 1979). Selain itu kuning telur mengandung kolesterol dan karoten yang menstimulasiaktivitas dehidrogenase suksinat, malat dan gliseral dehidrida -3- fosfat spermatozoa. Kuning telur juga mengandung komponen yang bekerja sebagai substrrak oksidasi, pelindung enzim sufhidril dan faktor aglutinat dalam plasma semen mamalia sebagai sumber untuk mencegah aglutinasi spermatozoa (Salisbury et.al., 1985). Pengencer semen cair atau semen beku secara praktis harus mengandung kuning telur atau susu sebagai unsur dasar. Kuning telur sebagai pengencer, mengandung lipoprotein dan lecitin yang mempertahankan dan melindungi integritas selubung protein dari spermatozoa dan mencegah cold shock. Kuning telur juga mengandung glukosa sebagai sumber energi bagi spermatozoa disamping protein dan vitamin-vitamin yang larut dalam air atau minyak, serta mampunyai viskositas yang mungkin menguntungkan spermatozoa (Toelihere, 1993).

Salah satu masalah yang dihadapi dalam pembekuan semen adalah pengaruh kejutan dingin (cold shock) terhadap sel yang dibekukan dan perubahan-perubahan intraselluler akibat pengeluaran air yang bertalian dengan pembentukan kristal-kristal es (Hafez, 2004). Untuk memperkecil resiko yang diakibatkan oleh kedua hal tersebut, terutama pada waktu melalui suhu kritis dilakukan penambahan krioprotektan. Salah satu bahan yang umum dipakai sebagai krioprotektan adalah gliserol. Gliserol akan masuk ke dalam sel dan menggantikan air yang bebas dan mendesak elektrolit keluar dari sel. Bahan krioprotektan lain yang dapat dipakai dalam pembekuan sel spermatozoa adalah DMSO dan etilen glikol (Storey et al., 1998). Untuk pembekuan semen penambahan 8 dan 12 % gliserol tidak menunjukan

5

perbedaan motilitas spermatozoa pasca thowing (Anhar et al., 2002). Ada tiga metode pemberian gliserol pada proses pembekuan yaitu metode 1; 2 dan 3 tahap. Dutta et al. (1999) melaporkan bahwa tidak ada perbedaan yang nyata antara ketiga metode tersebut terhadap motilitas sesudah thowing. Sedangkan menurut Anhar et al. (2002) metode pemberian 8 % gliserol dengan 3 tahap memberikan motilitas pasca thowing yang lebih baik.

Salah satu tahap dalam proses pembekuan semen adalah equilibrasi. Proses ini diperlukan agar spermatozoa dapat menyesuaikan diri dengan pengencer dan gliserol. Waktu equilibrasi yang umum digunakan untuk semen Kambing Boerminimal adalah 5 – 6 jam agar diperoleh motilitas maksimal pasca thowing (Singh et al., 1992). Pendinginan selama 1 jam dari 10 oC ke 5 oC menghasilkan motilitas yang sangat nyata lebih rendah dibandingkan dengan pendinginan selama 2 jam dari suhu 30 oC ke 5 oC (Dhami dan Sahni, 2003). Angka fertilitas yang diperoleh lebih baik pada pendinginan 2 jam dibandingkan dengan pendinginan 1 jam (Dhami et al., 1995). Selain faktor-faktor di atas motilitas setelah thowing juga dipengaruhi oleh metode thowing. Ahmad (194) melaporkan bahwa metode thowing dengan menggunakan suhu 37 oC selama 9 detik lebih tinggi motilitas spermatozoanya dibandingkan dengan metode 37 oC selama 15 detik.

Vitamin E atau α-tokoferol Menurut Meyes (1995) ada beberapa jenis vitamin E atau α-tokoferol yang

terdapat dalam bentuk alami, semuanya merupakan 6-hidroksikromana atau tokol yang terdistribusi isoprenoid dengan D-alfa-tokoferol (C29 H50 O2; BM = 430,7) mempunyai distribusi alami yang paling luas dan aktivitas biologik yang paling besar. Rumus bangun Vitamin E atau α-tokoferol dapat dilihat pada gambar 2.

Vitamin E atau α-tokoferol merupakan salah satu vitamin yang bersifat sebagai anti oksidan larut dalam lemak yang mampu menghambat aktivitas senyawa oksigen reaktif dan mencegah terjadinya reaksi berantai antara senyawa oksigen reaktif dengan senyawa asam lemak tak jenuh majemuk yang terdapat pada membran plasma sel (Suryohudoyo, 2000). Vitamin E merupakan antioksidan yang berfungsi menangkap radikal bebas dan mencegah reaksi rantai.melalui proses non enzimatis dan termasuk dalam kelompok antioksidan yang larut dalam lemak (Mayes, 1995). Vitamin E juga dikelompokan sebagai anti oksidan intra seluler yang paling kuat, mampu bekerja di dalam dan di luar dinding sel sehingga dapat mengurangi atau mencegah peroksidasi lipid secara lebih luas (Mayes, 1995 dan). Vitamin E sangat efesien dalam menghentikan proses peroksidasi lipid, satu molekul vitamin E akan melindungi 1000 molekul lipid (Ukeda et al., 2000).

6

Menurut Ukeda et al. (2000) vitamin E merupakan baris pertama pertahanan terhadap proses peroksidasi asam lemak tak jenuh dalam fosfolipid membran seluler dan subseluler. Fosfolipid pada mitokondria, retikulum endoplasmik dan membran plasma mempunyai afinitas terhadap vitamin E dan terlihat teroksidasi pada tempat-tempat ini. Vitamin E bertindak sebagai pemutus reaksi rantai radikal bebas dengan kemampuannya untuk memindahkan hidrogen fenolat pada radikal bebas peroksil dari asam lemak tak jenuh ganda yang telah mengalami peroksidasi. Radikal bebas peroksi yang terbentuk kemudian bereaksi dengan radikal bebas peroksil selanjutnya, sehingga vitamin E tidak mudah terikat dalam reaksi oksidasi yang dapat mambalik; cincin kromana dan rantai samping akan teroksidasi menjadi produk bukan radikal bebas. Produk tersebut kemudian mengalami konjugasi dengan asam glukoronat melalaui gugus 2-hidroksil dan diekresikan kedalam getah empedu. Seperti yang dilaporkan oleh Krinsky (1992) bahwa vitamin E mempunyai kemampuan pencegahan sebagai inhibitor yang efektif terhadap tahap perkembangan lipid-peroksidasi, dimana setiap mlekul tokoferol dapat bereaksi dengan dua radikal peroksil.

Hasil pertama adalah radikal alfa tokoferoksil (alfa tokoferol yang dapat bereaksi dengan radikal peroksil lainnya) menghasilkan bentuk yang stabil yang dapat diisolasi. Vitamin E atau alfa tokoferol relatif efektif sebagai antioksidan pada liposom dan diperlukan hanya sedikit dalam membran dan berkemampuan besar menghambat perambatan rantai peroksidasi pada lingkungan dengan struktur membran yang sangat kuat. Pada sapi antioksidan alami vitamin E pada konsentrasi tinggi (1 mg/ml alfa tokoferol asetat) nyata memberi efek yang melindngi membran spermatozoa berkualitas baik, menurunkan kerentanan terhadap peroksidasi pada saat kriopreservasi dan pasca pencairan kembali, sedangkan pada spermatozoa berkualitas rendah tidak menunjukan pengaruh yang nyata sebagai pelindung membran terhadap peroksidasi lipid (Beconi et al., 1993). Pada domba, vitamin E dalam dosis 10 mM relatif efektif untuk mempertahankan motilitas spermatozoa selama kriopreservasi (Upreti et al., 1997).

METODE PENELITIAN

Penelitian ini menggunakan semen kambing yang dikoleksi dari satu ekor kambing Boer berumur ± 2 tahun, satu betina dewasa pemancing, pengencer semen (tris amino methan, citric acid, fruktosa, kuning telur, aquades, streptomisin, penisilin, gliserol), pewarna eosin 2%, NaCl 0,9%, gliserol, a-tokoferol, nitrogen cair, vaselin, alkohol 70%, dan air.

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah: satu set vagina buatan kambing, kontainer, mikroskop, spektrofotometer, termometer, termos, gelas obyek dan penutup, tabung Eppendorf, labu erlenmeyer, beker glass, counter number, gelas ukur, timbangan Ohauss, lemari es, pengaduk, kertas saring, kertas lakmus, pipet hisap, pipet ukur, dan tabung reaksi.

Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratorium menggunakan sejumlah sampel semen segar kambing peranakan Boer yang diencerkan dalam pengencer susu skim kuning telur dengan penambahan vitamin E. Rancangan yang

7

digunakan adalah rancangan acak lengkap (RAL) satu arah dengan lima kelompok penambahan vitamin E (0,00 g/100 ml; 0,10 g/100 ml; 0,20 g/100 ml; 0,30 g/100 ml dan 0,40 g/100 ml) yang di ulangi sebanyak 5 kali.

Prosedur Penelitian

1. Pembuatan Bahan Pengenceran Semen Larutan pengencer yang digunakan adalah susu skim – kuning telur, yang

terdiri dari susu skim; kuning telur; fruktosa; penicillin dan streptomisin. Susu skim sebelum digunakan terlebih dahulu dilarutkan dengan aquades dengan perbandingan 1 : 9 dan dipanaskan hingga 92 oC selama 10 menit untuk menghilangkan biopotensi laktenin. Selanjutnya susu skim tersebut didinginkan dan ditambahkan fruktosa 3 g/100ml; penicillin 1000 IU/ml, streptomisin 1000 ug/ml dan kuning telur 20 %. Semua bahan pengencer yang dibuat volumenya 100 ml.

2. Penampungan SemenSampel semen yang akan digunakan diambil dari Kambing Perananan Boer

Jantan, sehat berumur 4 – 5 tahun dengan cara penampungan menggunakan vagina buatan. Penampungan semen dilakukan pada pagi hari jam 8.00 – 9.00 WIB, sebanyak 1 kali dalam seminggu. Prosedur penampungan semen dilakukan berdasarkan metode yang biasa dilakukan pada balai inseminasi Buatan.

Segera setelah penampungan semen dilakukan pemeriksaan kualitas secara makroskopis (volume, warna, konsistensi, bau, dan pH) dan mikroskopis (konsentrasi spermatozoa, persentase motilitas spermatozoa, persentase spermatozoa hidup, persentase membran plasma spermatozoa utuh dan persentase tudung akrosom spermatozoa utuh). Semen yang mempunyai konsentrasi spermatozoa > 600 x 106/ml dan motilitas progresif > 70 % , abnormalitas < 20 % digunakan sebagai sampel.

3. Pengenceran Semen Segera setelah dilakukan evaluasi terhadap kualitas semen segar, dibagi

dalam 5 kelompok perlakuan pengencer susu skim kuning telur yang telah ditambahkan vitamin E berbagai dosis perlakuan. Semen yang diencerkan pada pengencer dasar susu skim kuning telur (SSKT) tanpa penambahan vitamin E (To); pengencer Susu skim kuning telur dengan penambahan vitamin E dosis 0,1 g/100 ml (T1); pengencer Susu skim kuning telur dengan penambahan vitamin E dosis 0,2 g/100 ml (T2); pengencer Susu skim kuning telur dengan penambahan vitamin E dosis 0,3 g/100 ml (T3) dan pengencer Susu skim kuning telur dengan penambahan vitamin E dosis 0,4 g/100 ml (T4).

No Perlakuan Volume Komposisi Vitamin E

12345

ToT1T2T3T4

100100100100100

0,00,10,20,30,4

8

Jumlah bahan pengencer yang akan ditambahkan ke masing-masing semen dihitung dengan rumus:

Jumlah Pengencer =

Volume masing-masing pengenceran yang pertama kali ditambahkan pada semen sesuai dengan volume semen yang diperoleh. Selanjutnya ditambahkan sedikit demi sedikit sampai volume yang diinginkan terpenuhi. Konsentrasi semen yang diinginkan adalah 10 juta spermatozoa/ml. Jarak waktu antara penampungan semen sampai pengenceran tidak lebih dari 15 menit seperti yang dianjurkan oleh Balai Inseminasi Buatan (BIB)

4. Penambahan Gliserol Penambahan gliserol dilakukan pada saat semen sudah diencerkan, baik dengan

pengencer tris kuning telur; sitrat kuning telur atau susu skim (BIB Singosari, 2002). Gliserol dicampur dulu dengan setengah volume larutan pengencer sampai mencapai konsentrasi dua kali konsentrasi akhir, kemudian tuangkan ke dalam semen yang sudah dilarutkan dalam setengah volume pengencer. Sebagai contoh setengah volume yang kedua dalam pengencer kuning telur-sitrat harus mengandung 14% gliserol, sehingga larutan akhir akan mengandung 7% gliserol. Kedua larutan dicampurkan pada temperatur 4 ºC- 5 ºC, dimana larutan yang mengandung gliserol dituangkan tetes demi tetes sambil dikocok secara hati-hati (Herliantin dkk., 2002).

5. Equilibrasi dan Pembekuan SemenSemen yang sudah diencerkan dan penambahan gliserol, kemudian dimasukan

kedalam mini straw (0,25 ml) dan ditutup dengan serbuk polyvinylchloride (PVC). Konsentrasi spermatozoa motil didalam ministraw dibuat sebanyak 15 – 20 juta ekor. Ministraw-ministraw yang telah berisi semen disusun pada rak khusus dan kemudian semen tersebut diequilibrasi pada suhu 5 ºC selama 2 – 4 jam didalam ruang pendingin, kemudian diperiksa persentase motilitas dan persentase hidup spermatozoa. Selanjutnya straw tersebut dibekukan dengan cara konvensional yaitu menempatkan rak yang berisi ministraw pada uap nitrogen cair (6 cm di atas permukaan nitrogen cair) selama 10 - 20 menit, kemudian dimasukkan ke dalam nitrogen cair (-196 ºC). Selanjutnya ministraw tersebut disimpan dalam kontainer yang berisi nitrogen. Evaluasi kualitas spermatozoa dilakukan setelah 1 atau 2 minggu penyimpanan dengan cara pencairan kembali ministraw semen beku ke dalam air hangat dengan suhu 37 ºC selama 15 samapi 30 detik.

6. Pemeriksaan Kualitas Spermatozoaa. Pemeriksaan Persentase Motilitas Spermatozoa

Pemeriksaan motilitas spermatozoa dilakukan menurut standart baku BIB singosari (Zenichero dkk. 2002). Perhitungan motilitas spermatozoa dilakukan menggunakan gelas obyek yang ditetesi 10-15 µl semen dan tutup dengan gelas penutup. Siapan diperiksa dengan pembesaran 400 kali menggunakan mikroskop cahaya biasa atau mikroskop fase kontras. Spermatozoa yang motil akan nampak bergerak maju ke depan. Selanjutnya spermatozoa yang motil dihitung dan diberi

9

jumlah seluruh spermatozoa yang tampak dalam satu lapangan pandang, dan dinyatakan dalam persen (%).

b. Persentase Hidup atau Mati Spermatozoa: Pemeriksaan persentase hidup spermatozoa dilakukan menurut standart baku

BIB Singosari (Zenichero dkk. 2002). Perhitungan persentase hidup spermatozoa dilakukan melalui teknik pewarnana dengan cara mencampurkan semen dengan larutan eosin negrosin pada gelas obyek, kemudian dibuat preperat ulas dan dikeringkan. Spermatozoa yang mati akan menyerap warna sedangkan spermatozoa yang hidup tidak menyerap warna atau berwarna putih. Selanjutnya spermatozoa yang hidup dihitung dan dibagi jumlah seluruh spermatozoa (spermatozoa hidup + spermatozoa mati) yang tampak dalam satu lapangan pandang dan dinyatakan dalam persen (%).

c. Pemeriksaan Integritas Membran Plasma Spermatozoa: Pemeriksaan integritas membran plasma spermatozoa dilakukan berdasarkan

uji pembengkakan atau hypoosmotik swelling test (HOS-Test) sebagaimana yang dikembangkan oleh Rasul et al. (2001). Sebanyak 0,1 ml suspensi sperma hasil pencucian ditambahkan ke dalam 0,9 ml larutan hypoosmotik 0,032 m (yang dibuat dari 7,35gr Na Citrat 2H2O, 13,52 gr fruktosa yang dilarutkan dalam 1 liter aquadest) dan diinkubasikan selama 1 jam di dalam inkubator pada sushu 37o C, selanjutnya dibuat preparat ulas tipis dengan mencampurkan 1 tetes larutan di atas dengan 1 tetes eosin nigrosin, diamati dengan mikroskop cahaya dengan pembesaran 400X. Spermatozoa dihitung dengan cara berurutan atau zig zag sampai 10 lapang pandang atau jumlah spermatozoa 100 – 200. Spermatozoa yang memiliki integritas membran plasma yang utuh ditandai dengan adanya pembengkakan kepala yang diikuti dengan ekor berputar dengan pancaran warna terang, sedangkan spermatozoa yang membran plasmanya sudah rusak ditandai dengan tidak ada pembengkakan kepala dan ekor yang lurus.

Analisis Data

Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap pola searah dengan 5 kelompok perlakuan dosis vitamin E (0,0 g/100ml; 0,1 g/100ml; 0,2 g/100ml; 0,3 g/100ml dan 0,4 g/100ml), tiap kelompok diulang sebanyak 10 kali. Data persentase kualitas spermatozoa, angka konsepsi dan kebuntingan yang diperoleh dianalisa dengan uji beda ANAVA, dan bila terdapat perbedaan, maka selanjutnya dilakukan uji berganda Duncant (Steel dan Torrie, 1990).

DAFTAR PUSTAKA

Agarwal, A., R. A. Saleh and M.A. Bedaiwy 2003. Role of reactive oxygen species in the pathophysiology of human reproduction. Fertility and Sterility 79: 829 – 843

Alvarez, J.G., and B.T. Strorey, 1995. Differential incorporation of fatty acids into and peroxidative loss of fatty acids from phospholipids of human spermatozoa Mol. Reprod. Dev. 42 : 334 – 345

10

Anhar, M., E.F., Graham, and N. Iqbal. 1997. Post-thaw plasma membrane integrity of bull spermatozoa separated with a sephadex ion – exchange column, Theriogenology 10 (4) : 261 – 265

Anonimus, (2007). Laporan Tahunan Dinas Peternakan Propinsi Dearah Istimewa Aceh..

Curry, M.R and P.F. Watson, 1995. Sperm structure and function in Gametes the Spermatozoon. Gambridge Reviews in Human Reproduction, Ed. J.G. Grudzinskas & J.L. Yovich, Cambridge University Press

Dasrul, 2005. Peran Senyawa Oksigen Reaktif Dalam Mekanisme Kerusakan Integritas Membran Spermatozoa Kerbau Lumpur Hasil Sentrifugasi Gradient Densitas Percoll. Disertasi, Program Studi Ilmu Kedokteran Pasca Sarjana Universitas Airlangga, Surabaya

De Lamirande. E., H. Jiang, A. Zini, H. Kodana and C. Gagnon, 1997. Reactive Oxgyen species and sperm physiology. Rev. Reprod. Januari; 2 (1) : 48-54

Donnelly ET. N. McClure and S.E Lewis, !999. The Effects of ascorbate and alpha – tocoperol supplementation in vitro on DNA integrity and hydrogen peroxide – induced DNA damage ion human spermatozoa. Mutagenesis, Sep. 14 (5): 505 – 12

Darnell J., H. Lodish, and D. Baltimore, 1990. Moleculer Cell Biology. 2nd edition. Sci. Am. Books. Pp. 491 – 527

Fraga, C.G., P. A. Motchnik, A.J. Wyrobek and M.K. Shigenaga, 1996. Smoking and low antioxydant levels increase oxidation demage to sperm DNA. Mutat. Res., 351, 199 - 203

Gangyi, X., Z. Hongping, Z. Chanju, X. Xinghi dan Z. Ming, Z. Yi and Z. Li. 2001. Reserch on Quality, Preservation Dilutor, and Frozen Tecnology of Boer Goat Semen. Conference on Boer Goat in China.

Goyal, R.L., R.K. Tuli, G.C. Georgie and D. Chand. 1996. Comparison of quality and freezability of water buffalo semen after washing or sephandex filtration. Theriogenology, 46 : 679 – 686

Herrero M. B., E. de Lamirande and C. Gagnon, 1999. Nitrit oxide regulates human sperm capacitation and protein tyrosine. Bio of Reprod. 61 hal; 575 - 58

Halliwell, B. 1993. Free radicals and vascular disease; how much do we know ? Brit Med. J. 307; 885

Halliwell, B and J.M.C.Gutteridge, 1999. Free radicals in Biology and Medicine. Third edition, Oxford : Oxford University Press, pp: 1 – 35, 246 – 350; 664 – 667.

Herliantien, K. Zenichiro dan Sarastina. 2002. Teknologi Prosesing Semen Beku Pada Sapi. Balai Inseminasi Buatan. Singosari.

11

Hafez, E. S. E. (2000). Semen Evaluation. In: Reproduction in Farm Animals. Hafez, E. S. E. (Ed.) 7th ed. Lea & Febiger, Philadelphia.

Hafez, E.S.E. 2004. X- and Y-Chromosome-Bearing Spermatzoa dalam Reproduction in Farm Animal, 8th ed. Lea & Febiger Philadelphia, USA pp 440 – 446

Hughes CM., Lewis SE., McKelvey-Martin VJ. And Thompson W. 1998. The Effects of Antioxidant Supplementation During Percoll Preparation on Human Sperm DNA Integrity. Hum. Reprod. May. 13(5:1240-7)

Hammerstedt, H.R., 1993. Maintenance of bioenergetic balance in sperm and prevention of lipid peroxidation : A review of the effect on design of storage preservation systems. Reprod. Fertil. Dev. 5 : 675 – 690

Jones, R.T. Mann and R.J. Sherins, 1993. Demage to ram spermatozoa by peroxidation of endogenous phospholipids, J. Reprod. Fertil. 50 : 261 – 268

Kelso, K.A. A. Redpath, R.C. Noble and B.K. Speake, 1997. Lipid and antioxidant changes in spermatozoa and seminal plasma throughout the reproductive period of bull. Journal or Reproduction and Fertility. 109 : 1 – 9

Krinsky, N. 1992. Mechanisme of Action of Biological Antioxidants, Proc Soc Exp Biol and Med. 200.

Lu, C.D. 2001. Boer Goat Production: Progress and Perspective. www. Iga goatworld. Org/publication/boer.htm

Mayes, P.A. 1995. Struktur dan Fungsi Vitamin yang larut dalam lemak. Dalam Edisi 20. Adji Dharma dan A.S. Kurniawan (Penterjemah). EGC Penerbit Buku Kedokteran. Jakarta.

Ollero, M., E. Guzman, M. C. Lopez, R. K. Sharma, A. Agarwal, K. Larson, D. Evenson, A. J. Thomas and J. G. Alvarez. 2001. Characterization of subsets of human spermatozoa at different stages of maturation: implications in the diagnosis and treatment of male infertility. J. Human Reprod. Vol. 16; No.9 pp. 1912 -1921

Salisbury. G. W, Vandemark. N. L,. Djanuar. R. 1985. Fisiologi Reproduksi dan Inseminasi Buatan Pada Sapi, Gajah Mada Universitas Press, Jogjakarta

Singh, P., D. Chand and G.C. Georgic. 1992. Lipid peroxydation influence on release of glutamate oxaloacetate transaminase, free fatty acid and fructolytic index of buffalo (Bubalus Bubalis) spermatozoa. Indian Vet. J. 69: 718 – 720

Singh, D. M.K. Sharma and R.S. Panday. 1998. Changes in superoxyde dismutase activity and estradiol –17 content in folliceles of different size from ruminants. Indian J. Exp Biol. 36: 358 – 360

Steel, R.G.D and Torrie, 1990. Prinsip dan prosedur satistika suatu pendekatan biometrik. Alih bahasa Bambang Sumantri, PT. Gramedia Pustaka Utama; Jakarta

12

Suyadi, 2003. Pengenceran Semen Kambing Dengan Beberapa Pengencer Sederhana dan Aplikasinya Untuk Insiminasi Buatan. Penerbit Simetrika22. Malang.

Suyadi, T. Susilawati dan N. Isnaini.2004. Uji Pembekuan Semen Kambing Boer. Laporan Penelitian. Kerjasama Dotjen Pertenakan – Fakultas Peternakan Universitas Brawijaya. Malang.

Suryohudoyo, P. 2000. Ilmu Kedokteran Molekuler. Cetakan Pertama, Jakarta; CV. Sagung Seto. Hal 31 – 47

Sudjarwo, 2001. Peran Mitokondria pada fungsi Spermatozoa. Disertasi Pascasarjana Unair Surabaya.

Toelihere, M.R. 1985. Inseminasi Buatan pada Ternak. Angkasa. Bandung Hal 92 – 120

Toelihere, M.R. 1981. Biological aspects of reproduction and insemination of swamp buffalo. ASPAC. FFTC. Book Series. Taipei. 15 : 120 – 136

Zenichiro. K. Herlantien, Sarastina, 2002. Intruksi Praktis Teknologi Prosessing Semen Beku Pada Sapi, Jica - BIB Singosari, Malang

Wijaya, A. 1996. Radikal bebas dan parameter statur antioksidan. Forum Diagnostikum Prodia Diagnostics Education Services. Pp. 1 – 12

13