Laporan Praktikum Hari/tanggal : Senin, 17 Maret 2014Struktur Fungsi Subseluler Waktu : 08.00-11.00 WIB

PJP : Syaefudin, SSi, MSiAsisten : M. Maftuchin S.

Mustika Weni Rahma Dara Ayunda.

PENENTUAN KADAR PROTEIN DENGAN METODE BURET

Kelompok 26

Khairika Helyuputri G84120093Navia Belladina G84120059Saepul Rahmat G84120029

DEPARTEMEN BIOKIMIAFAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGORBOGOR

2014

PENDAHULUAN

Uji biuret untuk menunjukkan adanya senyawa-senyawa yang

mengandung gugus amida asam yang berada bersama gugus amida yang lain. Uji

ini memberikan reaksi positif yaitu ditandai dengan timbulnya warna merah violet

atau biru violet.Reagen biuret berfungsi untuk menguji kandungan protein dalam

suatu zat, apabila setelah ditetesi biuret, makanan/ sari makanan yang

mengandung protein akan berubah menjadi berwarna ungu. Metode biuret ini

telah banyak digunakan untuk penentuan protein dalam berbagai bidang, di

antaranya adalah penentuan protein total dalam serum atau plasma, cairan otak

dan tulang belakang, dan urin (Carpette 2005)

Uji ini didasarkan pada reaksi pembentukan kompleks Cu2+ dengan gugus

-CO dan -NH dari rantai peptida dalam suasana basa.Hasil positifnya akan

membentuk warna ungu. Uji Biuret adalah uji umum untuk protein(ikatan

peptida), tetapi tidak dapat menunjukkan asam amino bebas. Zat yang akan

diselidiki mula-mula ditetesi larutan NaOH, kemudian ditetesi larutan

tembaga(II)sulfat yang encer. Jika terbentuk warna ungu berarti zat itu

mengandung protein.Metode biuret banyak digunakan untuk penentuan protein

pada berbagai bidang, diantarany penentuan protein total dalam serum atau

plasma, cairan otak dan tulang belakang, dan urin (Septiani 2004).

Metode ini memiliki beberapa kelebihan dan kekurangan. Kelebihan

metode buret adalah hanya membutuhkan beberapa jenis pereaksi saja, metode ini

juga tergolong mudah dan cepat. Selain itu metode ini juga memiliki kelemahan

yaitu kurang sensitif jika dibandingkan dengan dua metode lainnya, yakni metode

Lowry dan Bradford. Metode Biuret ini juga memiliki kelemahan lain yaitu

membutuhkan sampel dengan konsentrasi yang cukup besar. Metode ini lebih

banyak membutuhkan bahan dan sedikit terganggu dengan adanya senyawa garam

seperti garam-garam ammonium (Soeharsono 2006).

Selain itu, menurut Fauzi (2010), kerugian penggunaan metode ini adalah

hasil penetapannya tidak murni menunjukkan kadar protein, melainkan bisa saja

kadar senyawa yang mengandung benzena, gugus fenol, gugus sulfhidrin, ikut

terbaca kadarnya waktu penetapan yang dipergunakan juga lama, sehingga sering

kali kurang effektif. Praktikum bertujuan menentukan kadar protein dalam suatu

sampel dengan metode spektrofotometri dengan menggunakan kurva standar.

Praktikum juga dapat mempraktikan prinsip metode Biuret dalam analisis protein.

METODE PRAKTIKUM

Waktu dan Tempat Praktikum

Praktikum dilakukan pada hari Senin, 24 Maret 2014 pukul 08.00-11.00

WIB di Laboratorium Pendidikan-1 Biokimia, Departemen Biokimia Fakultas

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor, Dramaga,

Bogor.

Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah spektrofotometer 20,

gelas piala, dan pipet. Bahan-bahan yang digunakan pada praktikum ini antara lain

reagen Bradford, BSA,air, dan sampel protein.

Prosedur Percobaan

Pembuatan kurva standar. Delapan tabung reaksi yang telah disiapkan,

diberi larutan standar BSA dan H2O dengan berbagai volume. Tabung pertama

diisi 1.3 mL H2O, tabung dua diisi dengan 0.1 mL standar BSA dan 1.3 mL H2O,

tabung tiga diisi dengan 0.2 mL standar BSA dan 1.1 mL H2O, tabung empat diisi

dengan 0.4 mL standar BSA dan 0.9 mL H2O, tabung lima diisi dengan 0.6 mL

standar BSA dan 0,7 mL H2O, tabung enam diisi dengan 0.8 mL standar BSA dan

0.5 mL H2O, tabung tuju diisi dengan 1.0 mL standar BSA dan 0.3 mL H2O,

serta tabung delapan diisi dengan 1.2 mL standar BSA dan 0.1 mL H2O. Setiap

tabung reaksi yang telah diberi larutan ditambahkan dengan 3 mL reagen Biuret.

Tabung satu hingga delapan divortex hingga homogen, lalu diinkubasi dengan

suhu 37oC selama 15 menit. Gunakan tabung satu sebagai blanko, kemudian baca

absorbansi dengan panjang gelombang 540 nm pada masing-masing tabung.

Penentuan konsentrasi protein sampel. Masukkan masing-masing 1.0

mL larutan sampel ke dalam dua tabung reaksi yang telah bersih dan 0.3 ml

aquades. Tambahkan 3 mL reagen Biuret pada dua tabung yang telah berisi

sampel. Inkubasi kedua tabung pada suhu 37oC selama 15 menit. Ukur absorbansi

dua tabung yang telah disiapkan menggunakan spektrofotometer dengan panjang

gelombang 540 nm.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Praktikum kali ini adalah penentuan protein dari suatu sampel dengan

metode buret. Percobaan yang dilakukan menghitung nilai absorbans dari larutan

yang berisi BSA dan HCl untuk menentukan kurva standar BSA serta

membandingkannya dengan larutan sampel yang ditujukan menentukan kadar

protein dari sampel tersebut. Berikut merupakan data hasil pecobaan yang

dilakukan.

Tabel 1 Analisis kuantitas standar BSA

Tabung Absorbansi Terukur Absorbansi Terkoreksi [BSA] (mg/mL)Blanko 0,222 0 0

1 0,236 0,014 0,1542 0,240 0,018 0,3083 0,280 0,058 0,6154 0,310 0,088 0,9235 0,342 0,120 1,2316 0,365 0,143 1,5387 0,388 0,166 1,846

Contoh Perhitungan :

Absorbansi terkoreksi = Absorbansi terukur-absorbansi blanko

= 0,236 - 0,222 = 0.014

Konsentrasi [BSA](mg/mL)Tabung 1: Vbsa M[BSA1] = VBSA+H2O M[BSA2]

0,1 ml x 2 mg/ml = 1,3 ml x M[BSA2]

M[BSA2 ] = 0,154 mg/ml

0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000 1.200 1.400 1.600 1.800 2.0000.000

0.020

0.040

0.060

0.080

0.100

0.120

0.140

0.160

0.180

f(x) = 0.0936931465363895 x − 0.00159752054227703R² = 0.993870726416282

[BSA] (mg/ml)

Abso

rban

si te

rkor

eksi

Gambar 1 Hubungan konsentrasi BSA dengan Absorbansi

Tabel 2 Analisis kuantitas protein

Sampel Absorbansi terukur

Absorbansi terkoreksi

[Protein] (µg/ml)

1 0,067 0,020 0,2262 0,089 0,042 0,462

Rerata konsentrasi protein 0,344

Contoh Perhitungan

Absorbansi terkoreksi = Absorbansi terukur - absorbansi blanko

= 0,067 – 0,047 = 0,02

[Protein]Y= a + bx Y = 0,093x-0,001 0,020= 0,093x-0,001 0,021 = 0,093x x = 0,226 mg/ml

Rerata konsentrasi protein (µg/ml) = Ulangan1+Ulangan 2

2

¿ 0,226 mg /ml+0,462m g/ml2

= 0,344g/ml

Percobaan penentuan kadar protein secara biuret ini, penentuan kadar

protein didasarkan pada pengukuran serapan cahaya oleh ikatan kompleks yang

bewarna ungu. Hal ini terjadi apabila protein bereaksi dengan tembaga dalam

suasana basa alkali. Reaksi ini dilakukan pada suasana basa alkali, dalam hal ini

digunakan NaOH, basa kuat memiliki ion OH- yang tinggi dalam larutan sehingga

mampu mengikat ion H+ pada larutan tersebut. Ion H+ yang lebih reaktif tersebut.

Ion H+ yang lebih reaktif tersebut dapat diikat dan tak akan bereaksi dengan

gugus amino, sehingga ion Cu+2 dapat bereaksi dengan 4 gugus amino dari ikatan

paptida protein (Lehninger 1982)

Protein yang telah diberi reagen biuret terlebih dahulu diinkubasi selama

15 menit dan pada suhu 37◦C. Hal tersebut dimaksudkan agar seluruh protein

bereaksi seluruhnya dengan reagen biuret sehingga dalam pembacaan nilai

absorbansi pada spektrofotometri tidak terdapat perbedan nilai absorbansi yang

besar (Mufida 2013).Warna merah muda atau merah jambu terbentuj apabila

larutan protein yang diselidiki mempunyai molekul yang kecil. warna violet akan

terbentuk apabila larutan protein yang diselidiki mempunyai molekul besar

(Poedjiadi 2007). Reaksi berikut secara singkatnya adalah:

CuSO4.5H20+2NaOH → Cu(OH)2+Na2SO4+5H2OCu(OH)2 ↔ Cu2++2OH-

Kurva standar yang telah dihasilkan menghasilkan persamaan regresi linier

yaitu Y = 0,093x-0,001 sehingga didapatkan nilai R2 sebesar 0,964. Hal ini

menandakan bahwa kurva standar yang telah dihitung memiliki hubungan yang

linier, semakin linier persamaan yang mendekati 1,00 maka semakin siginfikan

hubungan antara konsentrasi dari larutan. Larutan standar yang telah dibuat akan

dibandingkan dengan larutan protein sampel. Hasil percobaan didapatkan nilai

absorbansi terkoreksi sampel protein ulangan pertama sebesar 0,226 mg/mL dan

ulangan kedua sebesar 0,425 mg/mL sehingga didapatkan konsentrasi sampel

tersebut adalah 0,344 mg/mL. Nilai absorbansi sampel protein pada ulangan

kedua adalah 0,132 . Rerata konsentrasi dari kedua ulangan tersebut tidak jauh

berbeda menunjukkan ketelitian dalam penentuan kadar protein sampel ini cukup

teliti.

SIMPULAN

Metude uji buret dapat menentukan kadar protein. Praktikan menggunakan

kurva standar yang digunakan untuk menentukan konsentrasi sampel yang nilai

absorbansinya telah diketahui, kadar protein yang didapat daari sampel adalah

0,226 mg/ml pada ulangan pertama, 0,462 mg/ml dan pada ulangan kedua. Prinsip

metode Biuret ialah pembentukan kompleks ungu antara ikatan peptida dengan

penambahan garam kupri dalam suasana basa.

DAFTAR PUSTAKA

Carpette. 2005. An Introduction to Practical Biochemistry. London (UK) : McGraw HillBook Company.

Fauzi A. 2010. Uji kandungan protein serisin kokon Antheraea sp. (famili

Saturniidae) [skripsi]. Yogyakarta (ID): Fakultas Sains dan Teknologi UIN

Sunan Kalijaga

Herdyastuti N. 2006. Isolasi dan Karakterisasi Ekstrak Kasar Enzim Bromelin dari Batang Nanas. Jurnal Penelitian Hayati. Vol (12). Hal : 75-80.

Lehninger A. 1982. Dasar Biokimia Jilid 1. Erlangga: Jakarta

Mufida F. 2013. Mobilisasi Pektinase dari Bacillus subtilis Menggunakan Matriks Pasir Laut Yang Diaktivasi NaOH. Jurnal Kimia. Vol (1). Hal: 1-6.

Poedjiadi A. 2007.  Dasar Biokimia. Jakarta: UI Press

Septiani Y. 2004. Kadar Karbohidrat, Lemak dan Protein pada Kecap dari Tempe. Jurnal Bioteknologi. Vol (2). Hal: 48-53.

Soeharsono. 2006. Biokimia 1. Yogyakarta(ID): UGM Press.

.