Aplikasi Transfer Gen Dalam Akuakultur

Presented By:Naila Jazila

1005600321Ninda Rizkiyani

1005560321Robeto 1005630321

Latar Belakang• Tantangan untuk melipatgandakan produksi

pangan disektor pertanian (termasuk perikanan) ditahun 2025 dan 3x lipat ditahun 2050 meningkatnya populasi manusia ditahun 2050

• Peningkatan produksi perikanan, dalam hal ini seafood, diperlukan sekitar 7x lipat di tahun 2020 (Hew & Fletcher 1997)

• Produksi pertanian telah mencapai titik maksimum pemupukan dan selektif breeding kualitas tanah, air dan udara yg jelek

• Peluang pengembangan dibidang perikanan.

• Perbaikkan mutu genetik untuk meningkatkan produksi dan produktivitas ikan dapat dilakukan dengan berbagai cara :Melakukan persilangan/hibridisasi untuk

mendapatkan sifat unggul yang lebih baik dari populasi asal.

Memanfaatkan keunggulan jenis kelamin jantan. Ex : sex reversal, androgenesis/genogenesis, dan pembentukan pejantan super.

Melakukan seleksi terhadap karakter penting. Dengan “DNA recombinant”/“gene

transfer”/“transgenic”.  Gordon et al (1980) telah berhasil membuat “Tikus Transgenik”

Transgenik • Transgenik  Trans : pindah dan Gen: pembawa sifat.• Teknologi transgenik adalah suatu proses

mengintroduksikan satu atau lebih DNA asing ke hewan uji dengan tujuan untuk memanipulasi genotipenya kearah yang lebih baik dan selanjutnya dapat ditransmisikan ke keturunannya (Beamont & Hoare 2003).

• Teknologi transgenesis ini telah diaplikasikan pada bidang akuakultur sejak tahun 1985 di Cina dengan mengintroduksi gen pengkode hormon pertumbuhan yang berasal dari manusia pada ikan maskoki (Zhu et al. 1985).

• Transgenik atau teknologi DNA rekombinan (rDNA) merupakan rekayasa genetik yang memungkinkan kombinasi ulang (rekombinasi) atau penggabungan ulang gen dari sumber yang berbeda secara in vitro (Karim,2002).

• Organisme Genetically Modified Organism (GMO), atau disebut 

“ Organisme Transgenik “.

Menurut Hackettt (1993), ada tiga tahapan utama untuk menghasilkan ikan transgenik :1. mempersiapkan konstruksi gen

yang tersusun atas gen penyandi protein tertentu dan elemen regulator yang mengontrol/mengendalikan ekspresi gen

2. mengintroduksi konstruksi gen ke dalam inti sel embrio yang sedang berkembang supaya bisa didistribusikan ke semua jaringan tubuh ikan

3. mengidentifikasi individu ikan yang mengekspresikan gen asing atau transgen

Pembentukkan ikan Transgenik melalui transfer “ DNA contruct ” dapat dilakukan

dengan beberapa metode (Tsai, 2008)

1. Mikroinjeksi • Tekhnik Gen yg akan diintroduksikan

disuntikkan ke sel menggunakan mikropipet dan dilakukan dibawah mikroskop dengan bantuan mikromanipulator.

• Prinsip : memasukkan gen ke dalam sitoplasma embrio yang sudah dibuahi hingga terintegrasi dengan genom inang

• Penyuntikan dilakukan sebelum proses mitosis 1

• Keuntungan embrio ikan :– Jumlah telur ikan yang relatif banyak

Masalah

Inti telur ikan yg telah dibuahi relatif sulit diidentifikasi dimikroskop karena ukurannya kecil dan volume sitoplasma besar (Hacket, 1993).

fase satu sel dari embrio berlangsung dalam waktu singkat (antara 30 hingga 40 menit setelah pembuahan) tidak semua telur terinjeksi.

Korion telur sangat keras dan sulit ditembus oleh mikropipet.

Percobaan Menyuntikkan gen dengan jumlah copy

yang banyak ke sitoplasma telur yang dibuahi – Jumlah copy gen yang disuntikkan:• Sitoplasma : 106 sampai 108 • Inti telur : 5.000 – 10.000

Pada ikan rainbow korion yg telah dibuahi ditusuk dengan jarum metal dan gen disuntikkan melalui lubang yg terbentuk dengan menggunakan gelas mikropipet (Chourrout et al,1986)

Pada ikan cyprinids, korion dibuang dengan bantuan proteinase dan selanjutnya telur dapat disuntikkan dengan mudah (Ueno, et al 1994).,

Gen disuntikkan melalui mikrofil (Brem et al 1988)

Gen dilarutkan dalam beberapa pikoliter sampai nanoliter salin atau buffer Tris-EDTA.

Tahapan Mikroinjeksi

• Persiapan Gen : darah, daging, sirip ataupun sisik.– Isolasi dan purifikasi DNA.– Isolasi promotor (Restriksi DNA)

• Koleksi Telur, sperma dan Fertilisasi• Injeksi Gen ke Dalam Telur• Catatan: Dalam transgenik mikroinjeksi,

penginjeksian gen dapat dilakukan pada dua tempat,yaitu :– Pronukleus – Zygot, yaitu pada blastodisnya

Skematis Gen Pusher untuk Mikroinjeksi

Telur. 

Metode Mikroinjeksi Gen pada Pronukleus Telur 

Zebra fish flourescent

2. Elektroforesis• Tekhnik : serangkaian listrik arus pendek untuk

melemahkan membran sel untuk membantu transgen atau DNA rekombinan masuk dalam sel tertentu

• Tekhnik elektroforesis telah digunakan dalam beberapa spesies ekonomis penting seperti channel catfish, carp (powers et al. 1992), dan salmon (sin et al. 1993; sy monds et al. 1994)

• Metode ini mudah dan cepat dan memungkinkan untuk melakukannya pada ratusan oosit ikan atau telur ikan yang telah difertilisasi dalam satu kali kejutan (Inoue et al, 1990).

• Prinsip : gamet atau embrio ditempatkan pada suatu cuvet yang mana membran selnya permiabel terhadap molekul DNA bila mendapatkan aliran (pulsa) listrik pendek (beberapa saat) aliran listrik dihilangkan dan membran selnya kembali seperti semula, beberapa fragment DNA asing akan tinggal dalam gamet atau embrio

Kelebihan metode elektroporasi

(1)Teknik transfer gen secara masal (2)Mengatasi beberapa kekurangan

karakter telur warna yang kabur/buram, menempel, melayang, pronukleus yang tidak tampak, dan korion yang keras

(3)Sperma ikan mudah ditangani karena penambahan air secara sederhana mampu untuk mengaktifkan sperma

(4)Sperma dari hewan akuatik dapat dikriopreservasi sehingga sperma dapat selalu tersedia untuk digunakan.

3. Retroviral Infection (Infeksi pada Virus)

• Tekhnik : virus ditumpangi oleh gen yang dikehendaki dan diintroduksikan kedalam embrio hewan.

• Sel diinfeksi dengan retrovirus maka akan menghasilkan DNA virus, setelah DNA ditranskripsikan akan berintegrasi dan menjadi bagian dari genome induk

• Ikan yang telah diuji coba dengan tekhnik ini adalah ikan gapy dan cray fish menyuntikkan vektor ke daerah gonad

4. Sperm-mediated Gene Transfer (Sperma sebagai

Pembawa Gene)• Prinsip : Pengikatan gen oleh sperma

sperma dalam keadaan motil dan konsentrasi DNA cukup tinggi

• Lu et al ( 2002) membuat ikan silver sea bream transgenik dengan menyuntikkan cDNA (hormone pertumbuhan ikan rainbow trout dengan promoter ikan mas ß-actin) yang dicampurkan dengan liposom ke gonad ikan Testis-Mediated Gene Transfer

5. Particle Bombardment  (Partikel Gun atau Biolistik)

• DNA diikat pada miropartikel• Keuntungan :–Mudah ditangani dengan satu

kali tembakan akan menghasilkan beberapa sasaran–Partikel dapat mencapai sasaran

yang lebih dalam –Dapat digunakan pada berbagai

macam jaringan (Potrykus, 1996)• Pada ikan telah dicobakan oleh

Kolenikov et al (1990).

Aplikasi Transfer Gen Dalam Akuakultur

• Peningkatan pertumbuhan

• Peningkatan terhadap daya tahan terhadap suhu dingin

• Peningkatan daya tahan tubuh terhadap pathogen

Peningkatan pertumbuhan ikan transgenik spesies ekonomis penting

menggunakan GHSpesies

IkanPromo

terSumber Fgen

GHPeningktn Pertmbhn

Ikan mas

Lele Tilapia

Atlantic salmon

Pacific salmon

MMTRSVRSVCMVOp-AFP

op-AFP

op-AFP

GH manusiaRainbouw trout GH cDNACoho GH cDNAGH cDNA ChinookGH cDNA tilapiaGH cDNA salmon

GH minigene GH cDNA salmon

1,1 1,2-1,4

1,22,51,81

2 3-10

3-103-11

Sumber : Hew dan Fletcher, 2001 : Hinits dan Moav, 1999