BIOREMIDIASI SENYAWA HIDROKARBON OLEH BAKTERI

Oleh :Nama: Meyla KhasanahNIM: B1J012110Kelompok: 3Rombongan: IAsisten: Oktaviani Naulita

LAPORAN PRAKTIKUM BAKTERIOLOGI

KEMENTERIAN RISET TEKNOLOGI DAN PENDIDIKAN TINGGIUNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN FAKULTAS BIOLOGIPURWOKERTO

2014I. PENDAHULUANA. Latar BelakangMinyak bumi termasuk limbah bahan berbahaya dan beracun (B3) jika mengacu pada Peraturan Pemerintah (PP) no. 85 tahun 1999. PP tersebut menegaskan bahwa setiap produsen yang menghasilkan limbah B3 hanya diizinkan menyimpan limbah tersebut paling lama 90 hari sebelum diolah dan perlu pengelolaan lebih baik sehingga tidak menimbulkan pencemaran terhadap lingkungan. Pencemaran minyak bumi dapat berasal dari tumpahan dan ceceran minyak bumi selama kegiatan pengeboran, produksi, pengilangan, dan transportasi minyak bumi sehingga mengakibatkan gangguan pada keseimbangan ekosistem air, tanah, maupun laut. Peningkatan frekuensi pencemaran akan mengancam kebersihan lingkungan. Bila hal ini tidak segera ditanggulangi, pencemaran akan menjadi tidak terkendali dalam waktu yang singkat (Dirjen Migas, 2004). Salah satu kontaminan yang sulit diurai adalah senyawa hidrokarbon yang berasal dari minyak bumi atau lumpur minyak bumi. Senyawa ini dapat bersifat toksik apabila terakumulasi dalam tanah. Pencemaran tanah oleh hidrokarbon dapat menyebabkan kerusakan pada ekosistem secara meluas karena terjadi akumulasi senyawa tersebut pada jaringan hewan dan tumbuhan yang dapat mengakibatkan kematian dan mutasi (Ilyina, 2003). Banyak cara yang dapat dilakukan untuk mengatasi pencemaran minyak bumi. Salah satu cara penanggulangan limbah minyak bumi adalah dengan metode bioremediasi (Charlena, 2009).Bioremediasi telah menjadi teknologi alternatif yang digunakan untuk pengolahan limbah, baik limbah padat maupun cair (Charlena, 2009). Bioremediasi memiliki konsep dasar pendaurulangan seluruh material organik. Bakteri pengurai spesifik dapat diisolasi dengan menebarkannya pada daerah yang terkontaminasi dan dengan menambahkan nutrisi serta ketersediaan oksigen dapat mempercepat penurunan polutan. Metode tersebut dapat menguraikan limbah minyak bumi menjadi karbon dioksida, air, metana, dan senyawa lain yang lebih sederhana sehingga tidak mencemari lingkungan (Citroreksoko 1996).

B. TujuanTujuan dari pratikum Bioremediasi Senyawa Hidrokarbon oleh Bakteri adalah dapat mengisolasi bakteri pendegradasi senyawa hidrokarbon dan mengaplikasikannya untuk bioremediasi skala laboratorium.

II. MATERI DAN METODE

A. MateriAlat-alat yang digunakan dalam praktikum antara lain bunsen, tusuk sate, object glass, pipet tetes, pinset, sarung tangan, masker, dan mikroskop.Bahan-bahan yang digunakan meliputi karbol fuchsin, alkohol asam 3%, methylen blue, sputum dan minyak imersi.

B. MetodeIsolasi dan identifikasi Mycobacterium tuberculoseKultur

III. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. HasilTabel 1. Hasil Pengamatan Bakteri Tahan Asam Rombongan 1KelompokHasil

1.-

2.-

3.-

4.+

5.-

6.-

7.-

B. PembahasanLingkungan secara alami memiliki kemampuan untuk mendegradasi senyawa-senyawa pencemar melalui proses biologis dan kimiawi. Namun, seringkali beban pencemaran di lingkungan lebih besar dibandingkan dengan kecepatan proses degradasi. Akibatnya, zat pencemar akan terakumulasi sehingga dibutuhkan tindakan dan teknologi yang tepat untuk mengatasi pencemaran tersebut (Nugroho, 2009). Remediasi adalah kegiatan untuk membersihkan permukaan tanah yang tercemar. Bioremediasi merupakan penggunaan mikroorganisme untuk mendegradasi kontaminan disuatu lingkungan menjadi bentuk yang tidak mengandung racun (Dave, 1994). Bioremediasi adalah aplikasi dari prinsip-prinsip proses biologi untuk mengolah air, tanah dan lumpur yang terkontaminasi zat-zat kimia berbahaya. Tujuan akhir bioremediasi yaitu meminimalisir kontaminan dengan cara mengubahnya senyawa kimia berbahaya menjadi senyawa-senyawa seperti karbon dioksida atau beberapa gas lain, senyawa anorganik, air dan materi yang dibutuhkan oleh mikroba pendegradasi (Munawar et al., 2006).Keberadaan mikroorganisme (bakteri, jamur dan khamir) pendegradasi hidrokarbon tersebar luas dialam. Mikroorganisme tertentu dapat mendegradasi senyawa hidrokarbon dan menggunakannya sebagai sumber energi. Bioremediasi senyawa hidrokarbon itu sendiri merupakan proses pemulihan lingkungan yang tercemar oleh senyawa hidrokarbon minyak bumi dengan mengunakan mikroorganisme sebagai agensia pendegradasi hidrokarbon dan menggunakannya sebagai sumber energi untuk pertumbuhannya. Mikroba menggunakan hidrokarbon untuk pertumbuhannya dengan memotong hidrokarbon alifatik, sikloalifatik dan aromatik (Nurhariati et al., 2006). Pendegradasian senyawa hidrokarbon oleh bakteri dapat dilakukan dengan dua cara, cara pertama ialah dengan biodegradasi sempurna atau mineralisasi dan cara kedua dengan biodegradasi tidak sempurna (kometabolisme). Mineralisasi meliputi oksidasi dari senyawa hidrokarbon menjadi karbon dioksida dan air yang dapat digunakan untuk pertumbuhan sel. Masing-masing tahapan dalam proses degradasi dikatalisis oleh enzim spesifik yang disintesis oleh sel. Kometabolisme adalah peristiwa transformasi senyawa hidrokarbon oleh mikroorganisme. Kometabolisme merupakan reaksi degradasi tidak sempurna, berbeda dengan mineralisasi, pada kometabolisme mikroorganisme tidak dapat menggunakan hasil transformasi sebagai sumber karbon atau sumber energy untuk mendukung pertumbuhan (Meier, 2000).Menurut Mittal (2009), tahapan yang dilakukan dalam bioremidiasi hidrokarbon skala laboratorium dalam penelitiannya meliputi :Isolasi bakteri penegradasi dari sampelSampel tanah yang telah terkontaminasi minyak sejak 1986 (saat produksi minyak di mulai di Lingala, India) digunakan untuk mengisolasi bakteri pendegradasi hidrokarbon yang dikoleksi dari situs produksi minyak Lingala (ONGC). Kandungan yang terapat dalam minyak mentah tersebut adalah endapan API 35,6 %, minyak jenuh 67,3%, aromatik 21,2%, NSO (kandungan Nitrogen, Sulfur, Oksigen) 11,2%, asphaltens 0,3 %.Medium untuk menumbuhkan dan pemeliharaan inokulumSampel tanah sebanyak 1 gr disuspensikan dan divortex dengan air suling kemudian disentrifugasi dan supernatannya (5 ml) digunakan sebagai inokulum dalam 100 ml Luria bertani broth yang mengandung minyak mentah (1%) di dalam erlenmeyer, kemudian diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37oC pada shaker orbital 100 rpm. Tiga subkultur suksesif dibuat dengan medium yang sama dan mengandung 1% minyak mentah. Setelah itu, ketiga subkultur ini disentrifugasi 5000 rpm selama 10 menit dan pelet sel didapatkan. Pelet sel kemudian dicuci dengan 0,1M larutan buffer fosfat (pH 6,8) dua kali, setelah tersuspensi dengan larutan medium garam mineral, pelet sel dinokulasikan ke dalam 00 ml larutan garam mineral dalam erlenmeyer yang mengandung 1% minyak mentah sebagai satu-satunya sumber karbon dan energi. Media ini mengandung (dalam gram) KNO3 1,0, (MgSO4)7H2O 1,0, (CaCl2)6HO 0,1, FeSO4 0,05, trace element sol 250 ml, buffer fosfat (1M, pH 6-8) 20 ml dan air suling 980 ml.Penyimpanan dan subkultur strainStrain yang telah terisolasi disimpan pada 25% v/v larutan gliserol pada suhu -70oC. Eksperimen sehari-hari, subkultur dipertahankan dalam media nurient agar miring pada 4oC dalam lemari es dan subkultur bertahan dalam interval 30 hari.Studi biodegradasiStudi biodegradasi laboratorium dilakukan pada kondisi yang dioptimalkan seperti yang dijelaskan pada penelitian lain untuk menetukan status optimal degradasi hidrokarbon oleh strain isolat. Medium garam mineral (200ml) masing-masing, disiapkan 3 set dari 24 erlenmeyer (berkapasitas 1000ml) dan diautoklaf. Dua puluh empat erlenmeyer ini dikelompokan masing-masing terdiri dari 6 labu dan diberi perlakuan 15, 30, 45 dan 60 hari dan minyak mentah steril dimasukkan kedalam masing-masing labu (2,4 gram, disterilisasi menggunakan filtrasi, ukuran pori 0,25 mm). Satu ml inokulum dari setiap pendegradasi hidrokarbon, strain standar (Acinetobacter calcoaceticus) dan issolat tes (strain pseudomonas dan bacillus) diinokulasikan ke dalam masing-masing set. Labu-labu tersebut diinkubasi dalam shaker inkubator pada 30oC, 100 rpm. Setelah interval waktu yang diinginkan selesai, labu erlenmeyer dikeluarkan dan aktivitas bakteri dihentikan dengan penambahan 1% 1/v HCl kemudian dilakukan ekstraksi minyak mentah dengan penambahan 50 ml petroleum ether ke dalam 50ml kultur broth dan mencampurnya dengan acetone dengan perbandingan 1:1 dan dishake kuat untuk menghasilkan lapisan tunggal teremulsi. Estimasi gravimetrik sisa minyak yang tertinggal setelah biodegradasi dibuat dengan menimbang kuantitas minyak pada botol sisa.Bioegradasi hidrokarbon umumnya terdiri dari 2 jalur utama, yaitu jalur aerob dan jalur anaerob. Jalur aerob membutuhkan molekul oksigen sebagai akseptor elektron terakhirnya, sedangkan biodedgradasi anaerob menggunakan molekul selain oksigen sebagai akseptor elektron terakhirnya. Jalur anaerob dibagi menjadi 2 jalur lagi yaitu fakultatif anaerob dan strict anaerob (Atlas, 1992). Banyak bakteri menunjukkan kemampuan menguraikan senyawa hidrokarbon aromatik secara aerob (Miethling & Karison 1996), namun galur bakteri Pseudomonas dan Bacillus merupakan galur yang telah dipelajari secara intensif, baik kemampuan degradasi (Shen & Wang 1995). Di samping itu, beberapa jenis ganggang juga mempunyai kemampuan menguraikan senyawa hidrokarbon aromatik secara aerob. Kemampuan bakteri fotosintetik anoksigenik untuk turnbuh pada beberapa senyawa aromatik monosiklik, baik secara aerob maupun anaerob telah memungkinkan kelompok ini digunakan sebagai agen biodegradasi senyawa aromatik secara luas (Harwood & Gibson, 1988). Benzoat dan turunannya merupakan salah satu senyawa yang paling umum dilaporkan dapat diuraikan oleh bakteri fotosintetik anoksigenik (Harwood & Gibson, 1988). Beberapa penelitian juga menunjukkan kemampuan bakteri fotosintetik anoksigenik dalam rnengkatabolisme senyawa aromatik selain benzoat. Blasco & Castillo (1992) melihat bahwa Rhodobacter capsulatus E 1F1 dapat mendegradasi mononitrofenol dan dinitrofenol menggunakan asetat sebagai sumber karbon. Rhodopseudomonas palustris dapat memanfaatkan banyak jenis fenolat, asam aromatik terhidroksilasi dan termetoksilasi, aldehida aromatik, dan asam hidroaromatik (Harwood & Gibson 1988), dan juga mengkatabolisme senyawa piridin dan pirazin (Sasikala et al., 1994).Bakteri merupakan mikroorganisme yang umum digunakan dalam bioremediasi hidrokarbon. Bakteri dapat mendegradasi senyawa hidrokarbon dan menggunakan senyawa tersebut sebagai sumber karbon untuk pertumbuhan. Contoh bakteri pendegradasi hidrokarbon antara lain Pseudomonas, Comamonas, Acinobacter, Sphingomonas, Bacillus sp., Rhodococcus sp., Providencia sp., Citrobacter sp., dan Micrococcus sp (Ghazali, 2004)..Bakteri pendegradasi hidrokarbon dapat diisolasi dari tanah yang tercemar minyak bumi. Pseudomonas Fluorescens dapat mendegradasi n-alkana dengan jumlah karbon C14-C18. Pseudomonas yang telah diisolasi dari tanah tercemar dapat menggunakan naphthalene, fluorine, dan phemanthrene, senyawa yang termasuk ke dalam kelompok PAH (polyaromatic hydrocarbon) sebagai sumber karbon untuk pertumbuhan. Akan tetapi, bakteri tersebut tidak dapat menggunakan pyrene. Mycobacterium sp. strain CH1 dapat mendegradasi pyrene. Mycobacterium sp. strain CH1 juga dapat menggunakan alkana rantai lurus (dodecane dan hexadecane), alkana bercabang (pristane), dan alkane rantai panjang (octadecane, docosane, dan octacosane) sebagai sumber karbon utama yang dapat mendukung pertumbuhan, tetapi cyclohexane tidak dapat mendukung pertumbuhan bakteri tersebut. Pseudomonas aeruginosa dan Serratia marcescens sangat baik dalam mendegradasi alkane dengan jumlah karbon C9-C23. Pseudomonas putida PPO1 melakukan kometabolisme pada p-xylene dan o-xylene serta tumbuh pada benzene dan toluene (Hajar, 2012).Pseudomonas sp. merupakan bakteri hidrokarbonoklastik yang mampu mendegradasi berbagai jenis hidrokarbon. Genus Pseudomonas terdiri dari bakteri gram negatif, aerob, bergerak mengunakan flagel, katalase positif, oksidase positif, berbentk batang dengan ukuran 0,6-2, bergerak aktif dengan flagel monotrik (flagel tunggal pada kutub), tidak berspora dan tidak mempunyai selubung Suhu optimum untuk pertumbuhan Pseudomonas adalah 37oC-42oC. Bakteri ini mudah ditumbuhkan pada berbagai media pembiakan, karena kebutuhan nutrisinya sangat sederhana, bentuk koloni bulat, tepi rata dan transparan (Jawetz, 1996). Biodegradasi hidrokarbon alifatik biasanya terjadi pada kondisi aerob. Tahap awal degradasi hidrokarbon secara aerob adalah memasukkan molekul oksigen ke dalam hidrokarbon oleh enzim oksigenase. Menurut Atlas (1992), Jalur degradasi alkana yang paling umum adalah oksidasi rantai terminal. Alkana dioksidasi menjadi alkohol dan selanjutnya menjadi asam lemak. Jalur metabolisme asam lemak selanjutnya dapat melalui jalur lipid seluler, -oksidasi, dan -oksidasi. Melalui jalur -oksidasi asam lemak akan diubah menjadi asetil ko-A dan masuk ke dalam siklus TCA, diubah menjadi CO2 dan energi. Bila melalui jalur -oksidasi asam lemak akan diubah langsung menjadi CO2 dan turunan lemak (Nugroho, 2009). Gambar 1. Oksidasi n-alkana melalui Jalur Terminal: a. Monooksigenase; b. Alkoholdehidrogenase; c. Aldehid dehidrogenaseSelain oksidasi terminal, mikroba juga dapat mengoksidasi hidrokarbon alifatik melalui oksidasi subterminal. Molekul oksigen dimasukan ke dalam rantai karbon membentuk alkohol sekunder yamg selanjutnya dioksidasi menjadi keton pada jalur ini dan akhirnya ester. Kemudian ikatan ester dipecah membentuk alkohol primer dan asam lemak. Selanjutnya alkohol dioksidasi melalui aldehid membentuk asam lemak dan kedua fragmen asam lemak akan dimetabolisme lebih lanjut melalui -oksidasi. Degradasi alisiklik biasanya melalui oksidasi unit terminal menghasilkan alkohol primer. Biasanya mikroorganisme yang bisa mendegradasi komponen alifatik dapat juga mendegradasi komponen alisiklik (Nugroho, 2009).

Gambar 2. Oksidasi n-alkana Melalui Jalur Sub TerminalDegradasi komponen hidrokarbon minyak bumi, dalam prosesnya, hidroksilasi sangat penting untuk menginisiasi degradasi sikloalkana. Variasi komposisi minyak bumi menyebabkan kemampuan biodegradasi oleh mikroba berbeda pula. Faktor lingkungan sangat menentukan karena mikroba membutuhkan kondisi optimum agar biodegradabilitasnya tinggi. Produksi CH4 dapat melalui dua jalur yaitu reduksi CO2 dengan menggunakan H2 dan fermentasi komponen minyak bumi. CH4 dihasilkan dari dekomposisi minyak bumi secara anaerob. Gas metana dapat diubah menjadi karbondioksida melalui serangkaian reaksi enzimatis oleh sistem enzim metana mono-oksigenase menjadi senyawa lebih sederhana. Pada lingkungan mikroba yang aktif, produksi hidrogen selama fermentasi akan digunakan sebagai sumber energi dalam respirasi anaerob untuk reduksi nitrat dan sulfat, metanogenesis atau asetogenesis (Nugroho, 2009).

Gambar 3. Oksidasi Metana Menjadi KarbondioksidaMenurut Fermiani (2003), faktor lingkungan yang mempengaruhi keberhasilan degradasi TPH yaitu: kadar air, pH, suhu dan nutrisi. Kadar air tanah harus berada pada kondisi optimum yaitu 10 % 25 % agar transfer gas untuk proses oksigenase dapat berjalan dengan baik. Proses biodegradasi senyawa hidrokarbon juga dipengaruhi oleh faktor suhu dan pH. Pada suhu lebih dari 40 C dan pH < 6 akan menyebabkan aktivitas mikroorganisme terhambat. Mikroorganisme dapat tumbuh dan berkembang biak dengan baik pada kondisi pH netral. Pada pH netral zat-zat makanan bagi mikrorganisme mudah larut dalam air yang ada di tanah dan kerja enzim yang dihasilkan oleh mikroorganisme menjadi maksimal dalam mendegradasi hidrokarbon.

IV. KESIMPULAN DAN SARAN

A. KesimpulamClick here to enter text.

B. SaranClick here to enter text.

DAFTAR REFERENSIClick here to enter text.