BIOREMEDIASI SENYAWA HIDROKARBON OLEH BAKTERI

Oleh:Nama : Ria Cahya LaniNIM : B1J012069Kelompok : 1Rombongan : IIAsisten : Kuntum Khairu Ummah

LAPORAN PRAKTIKUM BAKTERIOLOGI

KEMENTERIAN RISET TEKNOLOGI DAN PENDIDIKAN TINGGIUNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN FAKULTAS BIOLOGIPURWOKERTO

2014I. PENDAHULUANA. Latar BelakangKebutuhan energi hidrokarbon (fosil) untuk memenuhi kebutuhan hidup manusia terus meningkat, hal tersebut dikarenakan minyak bumi merupakan sumber energi utama manusia. Berbagai kegiatan eksplorasi, eksploitasi, transportasi, penyimpanan, pengolahan, dan distribusi minyak bumi yang berlebihan justru bukan lagi bermanfaat, namun justru menimbulkan masalah lingkungan yang serius karena terjadinya pencemaran. Pencemaran tersebut bisa berasal dari kebocoran pipa saluran, kecelakaan pengangkutan, kebocoran kapal pengangkut bahan bakar, dan tempat penyimpanan yang bocor. Pencemaran tanah oleh minyak bumi dan senyawa hidrokarbon lainnya dapat merusak ekosistem lokal (Hafsah, 2013).Minyak bumi mengandung 50-98% komponen hidrokarbon dan non hidrokarbon. Terdapat empat macam hidrokarbon minimal yang terkandung di dalam minyak bumi, yaitu n-alkana yang terdiri atas metana (CH4), aspal yang memiliki atom karbon (C) lebih dari 25 pada rantainya, isoalkana yang hanya terdapat sedikit dalam minyak bumi, neptena (sikloalkana) yang merupakan komponen kedua terbanyak setelah n-alkana, dan seri aromatik. Komposisi senyawa hidrokarbon pada minyak bumi berbeda tergantung pada sumber penghasil minyak bumi. Salah satu contoh fraksi minyak bumi yang diperoleh dengan cara destilasi, berwarna kuning kecoklatan jernih, berupa cairan pada suhu rendah, dan biasa disebut dengan gas oil adalah solar. Minyak solar mengandung 38% n-alkana, 38% alkana rantai cabang dan sikloalkana, 3% isoprenoid, 20% senyawa aromatik, dan 1% senyawa polar. Jumlah atom permolekulnya 15-18 dan rentang titik didihnya adalah 300-400oC (Pertamina, 1998).Bioremediasi adalah proses penguraian limbah organik atau non organik polutan, secara biologi dalam kondisi terkendali dengan tujuan mengontrol atau mereduksi bahan pencemar dari lingkungan. Bioremediasi adalah suatu teknik yang mengandalkan reaksi mikrobiologis di alam dengan cara mengondisikan mikroba sehingga mampu mendegradasi senyawa hidrokarbon. Bioremediasi dapat dilakukan dengan dua cara yaitu secara in situ dan ex situ. Teknik bioremediasi secara in situ dapat dilakukansecara langsung pada lokasi yang mengalami pencemaran, sehingga cenderung lebih mudah dan murah. Teknik bioremidiasi secara ex situ dilakukan dengan cara lahan yang tercemar dipindahkan ke dalam penampungan yang lebih terkontrol, lalu diberi perlakuan khusus dengan menggunakan mikroba (Hafsah, 2013).Penggunaan mikroba dalam bioremediasi minyak bumi melibatkan pengetahuan yang mendasar tentang perubahan minyak bumi yang dilakukan oleh miroba. Mikroba yang telah diketahui memiliki kemampuan yang tinggi dalam mendegradasi minyak bumi adalah bakteri. Beberapa jenis bakteri yang merupakan pendegradasi hidrokarbon yang efektif adalah Pseudomonas aeruginosa, P. Putida, Bacillus subtilis, B. Cereus, dan B. letrospor. Genus Pseudomonas merupakan mikroba yang memiliki kemampuan tinggi dalam mendegradasi minyak bumi, terutama fraksi alifatik, aromatik, dan resin (Ghazali, 2004).

B. TujuanTujuan dari praktikum kali ini adalah untuk mengisolasi bakteri pendegradasi senyawa hidrokarbon dan mengaplikasikannya untuk bioremediasi skala laboratorium.

II. MATERI DAN METODE

A. MateriAlat yang digunakan pada praktikum kali ini adalah labu erlenmeyer, cawan petri, tabung reaksi, pipet ukur, jarum ose, pembakar spritus, spektrofotometer, inkubator, dalt n shaker orbital.Bahan yang digunakan adalah isolat, akuades steril, media Standard Basal Salt padat, media Standard Basal Salt cair, solar, media Nutrient Agar, Na2CO3 , indikator PP, reagen katalase, crystal violet, lugols iodine, etanol, safranin, dan tissue.

B. MetodeMetode yang digunakan dalam praktikum adalah sebagai berikut :Pengkayaan Kultur BakteriIsolat diinokulasi ke 100 ml media SBS cair. Ditambah 1% solar.Sediaan diinkubasi selama 7x24 jam pada suhu 37oC di shacker inkubator 120 rpm.Pengukuran Kadar HidrokarbonSpektrofotometriInokulum hasil pengkayaan diambil 2%, 5%, dan 10% (1; 2,5; dan 5 ml), dimasukkan ke dalam 50 ml SBS cair ditambah 1% solar, diinkubasi 14x24 jam di shacjer inkubator 120 rpm.Kadar solar diukur setiap inkubasi hari ke-0, 7, 14, dan 21.Inokulum yang telah dishacker dipindahkan 4,5 ml ke eppendorf, disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 15 menit. Supernatan diambil, kemudian di spektrofotometri pada panjang gelombang 460 nm. Hasil dicatat.CO2 BebasInokulum hasil pengkayaan diambil 2%, 5%, dan 10% (1; 2,5; 5 ml), dimasukkan ke dalam 100 ml SBS cair ditambah 1% solar.Sediaan diinkubasi 14x24 jam dishacker inkubator 120 rpm.Kadar CO2 BebasInokulum ditambah 3-5 tetes indikator PP.Dititrasi dengan Na2CO3 0,01 N sampai larutan berubah warna menjadi merah muda.Jumalh titran yang digunakan dicatat dan dimasukkan dalam rumus :Kadar CO2 bebas = 1000/100 x p x q x 22P = jumlah Na2CO3 0,01 N yang digunakan dalam titrasiQ = normalitas larutan (0,01 N)22 = bobot setara dengan CO2Total Hidrokarbon PetroleumInokulum pada 50 ml SBS cair ditambah 1% solar diinokulasi ke media padat ditambah solar 1% dengan cara streak kontinyu.Diinkubasi 2x24 jam pada suhu 37oC.Pembuatan StokKultur bakteri pada media SBS padat diinokulasi ke media NA padat.Diinkubasi 2x24 jam pada suhu 37oC.Karakterisasi IsolatUji Pewarnaan Gram Isolat bakteri pada pembuatan stok diulas ke object glass, ditambahkan sedikit akuades, kemudian difiksasi 2-3 kali.Sediaan ditetesi crystal violet, didiamkan 60 detik, dicuci kering anginkan.Sediaan ditetesi lugols iodine, didiamkan 60 detik, dicuci kering anginkan.Sediaan ditetesi etanol sampai jernih, dicuci kering anginkan.Sediaan ditetesi safranin, didiamkan 45 detik, dicuci kering anginkan.Sediaan diamati sel yang terwarnai, dan bentuk sel.Uji Katalase Isolat bakteri pada pembuatan stok diulas ke object glass.Ditetesi H2O2.Diamati dibawah mikroskop.Uji OksidaseIsolat bakteri pada pembuatan stok diulas ke object glass,Ditutup dengan kertas tissue.Ditetesi D-phenylene diamine dihydrochloride.Diamati perubahan warna.

III. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. HasilTabel 3.1. Hasil Pengamatan Bakteri Tahan Asam Rombongan 2KelompokAbsorbansi SolarKadar CO2 bebas (mg/L)

Hari ke-0Hari ke-7Hari ke-14Hari ke-21

10,0130,1930,0800,14799

20,0470,1500,151-0,069110

30,1070,0890,0760,721111,1

40,0670,1210,2060,048110

50,0480,0990,103-0,06299

60,0780,1300,2270,029138,6

70,0570,1180,0620,08994,6

Tabel 3.2. Hasil Uji Biokimiawi Rombongan 2KelompokGramOksidaseKatalaseSBSA

+-

1(coccus)++

2(batang)++

3(batang)-+

4(batang)++

5(batang)-+

6(coccus)++

7(batang)++

Perhitungan Kadar CO2 bebas : = 1000 x p x qx 22 100= 1000 x 4,5 x 0,1 x 22 100= 99 mg/L

Gambar 3.1. Uji Katalase (+) Gambar 3.2. Uji Oksidae (+)

Gambar 3.3. Media NA Streak Kontinyu Gambar 3.4. Media SBSA Streak Kontinyu Gambar 3.5. Media SBSA Streak Kuadran Gambar 3.6. Uji Kadar CO2 Bebas Gambar 3.7. Pewarnaan Gram

B. PembahasanPencemaran lingkungan yang terjadi karena minyak bumi dapat menganggu eksosistem bahkan makhluk hidup yang berada di sekitar daerah yang tercemar. Hal tersebut dikarenakan hidrokarbon yang terdapat didalam minyak bumi bersifat rekalsitan terhadap biodegradasi, dan juga bersifat karsinogenik. Untuk mengatasi masalah tersebut, maka dapat dilakukan remediasi dengan beberapa metode yaitu metode fisik dengan isolasi dan pewadahan ke suatu tempat cemaran, metode kimia dengan solidifikasi dan ekstraksi kimia, dan metode biologi dengan biofilter dan bioventing. Remediasi adalah proses perbaikan dari kondisi lingkungan terkontaminasi cemaran, menjadi kondisi acuan. Remediasi dengan metode biologi dikenal dengan istilah bioremediasi. Bioremediasi adalah proses pemulihan lingkungan yang tercemar dengan penggunaan agen biologi, seperti mikroba. Aktivitas mikroba dapat mengakibatkan tranformasi struktur suatu senyawa sehingga terjadi perubahan integritas molekul dan toksisitas senyawa tersebut berkurang atau bahkan tidak toksik sama sekali (Nasikhin, 2013). Bioremediasi hidrokarbon adalah penggunaan mikroorganisme untuk menghilangkan atau mendetoksifikasi pencemaran lingkungan yang disebabkan senyawa hidrokarbon. Mikroorganisme tersebut mampu memecah dan menggunakan senyawa hidrokarbon untuk sumber nutrisi dan energi untuk pertumbuhan dan reproduksi. Senyawa hidrokarbon yang kompleks tersebut akan dirubah menjadi senyawa organik yang sederhana dan tidak toksik seperti CO2 dan H2O. Bioremediasi hirokarbon dapat dilakukan dengan dua cara yaitu memenfaatkan mikroorganisme alami yang berada pada sekitar lingkungan yang tercemar dan menginokulasikan mikroorganisme pendegradasi polutan pada daerah yang tercemar hidrokarbon (Priadie, 2012). Mikroorganisme yang menggunakan senyawa hidrokarbon sebagai sumber karbon dan energi ada yang bersifat aerob dan ada yang anaerob. Pseudomonas aeruginosa merupakan bakteri yang bersifat aerob. Mikroorganisme yang bersifat aerob akan mendegradasi secara beruntun senyawa hidrokarbon dengan menggunakan enzim dan oksigen bertindak sebagai akseptor eksternal. Tahap degradasi alkana melibatkan oksidasi alkana menjadi alkohol dengan bantuan enzim monooksigenase yang selanjutnya terjadi pembentukan aldehid melalui reaksi dehidrogenasi dengan bantuan enzim alkoho dehidroginase. Senyawa aldehid yang terbentuk akan dioksidasi dengan bantuan enzi aldehid dehidroginase menjadi asam lemak atau asam karboksilat yang bila dioksidasi lebih lanjut akan membentuk asetil-KoA (Mubarok, 2011).Menurut Munahak (2011), minyak bumi adalah senyawa kompleks hidrokarbon yang memiliki ribuan variasi senyawa. Minyak bumi memiliki komposisi yang tersusun atas karbon 84-87%, hidrogen 11-14%, oksigen 0-2%, nitrogen 0-1%, dan belerang 0-3%. Senyawa hidrokarbon biasanya ditemukan dalam minyak bumi berupa alkana, sikloalkana, maupun aromatis. Senyawa hidrokarbon dibedakan menjadi beberapa macam, yaitu :Hidrokarbon jenuh, yang termasuk dalam kelas ini adalah alkana. Hidrokarbon jenuh ini merupakan kandungan terbesar dalam minyak bumi. Contohnya adalah n-oktan.Hidrokarbon aromatik, yang termasuk dalam kelas ini adalah monosiklik aromatik (BTEX) dan polisiklik aromatik hidrokarbon (PAH : naftalen, antresen, dan fenantren).Resin, yang termasuk dalam kelas ini adalah senyawa polar berkandungan nitrogen, sulfur, oksigen (piridin dan tiopen), sehingga disebut pula sebagai senyawa NSO.Aspal, yang termasuk dalam kelas ini adalah senyawa dengan berat molekul besar dan logam berat nikel, vanadium, dan besi. Bakteri Pseudomonas dapat digunakan sebagai agen biologi yang dapat digunakan untuk mendegradasi senyawa hidrokarbon. Salah satu faktor yang sering menghambat keberhasilan degradasi adalah sifat kelarutannya yang rendah, sehingga sulit mencapai sel bakteri. Untungnya bakteri Pseudomonas dapat memproduksi biosurfaktan. Terdapat dua macam biosurfaktan yang dihasilkan, yaitu :Surfaktan dengan berat molekul rendah yang terdiri dari molekul hidrofobik dan hidrofilik. Kelompok ini bersifat aktif permukaan, ditandai dengan adanya penurunan tegangan permukaan medium cair.Polimer dengan berat molekul besar, yang dikenal dengan biomulsifier polisakarida amfifatik. Dalam medium cair, bioemulsifier ini mempengaruhi pembentukan emulsi serta kestabilannya tidak selalu menunjukkan penurunan tegangan permukaan medium. Bakteri yang memiliki kemampuan mendegradasi senyawa hidrokarbon untuk keperluan metabolismenya disebut dengan bakteri hidrokarbonoklastik. Bakteri hidrokarbonoklastik yang telah diketahui adalah Pseudomonas aeruginosa, P. putida, Bacillus subtilis, B.cereus, dan B. laterospor (Carvalho, 2005). Bakteri Bacillus memiliki kemampuan dalam mendegradasi minyak bumi, dimana bakteri ini menggunakan minyak bumi sebagai umber karbon untuk menghasilkan energi. Pada konsentrasi yang rendah, bakteri ini dapat merombak hidrokarbon minyak bumi dengan cepat. Bakteri Pseudomonas aeruginosa diketahui dapat menghasilkan rhamnolipid sebagai biosurfaktan yang dapat mendegradasi senyawa hidrokarbon (Yani, 1994). Biodegradasi senyawa hidrokarbon n-alkana dapat dilakukan oleh bakteri seperti Arthrobacter, Burkholderia, Mycobacterium, Pseudomonas, Sphingomonas, dan Rhodococus. Sedangkan sembilan strain yang dapat mendegradasi minyak bumi adalah Pseudomonas aeruginosa, P. flourecens, Bacillus subtilis, Bacillus sp. , Alcaligens sp. , Acinetobacter lwofi, Flavobacterium sp. , Micrococcus roseus, dan Corynebacterium sp (Das dan Chandran, 2010). Bakteri Pseudomonas aeruginosa memiliki bentuk batang atau coccus dengan ukuran sekitar 0,6x2 m. Bakteri ini terlihat sebagai bakteri tunggal, berpasangan, dan terkadang membentuk rantai yang pendek. P. aeruginosa merupakan bakteri gram negatif, bersifat aerob, katalase positif, oksidase positif, dan tidak mampu memfermentasi namun dapat mengoksidasi glukosa atau karbohidrat. Selain itu, bakteri P. aeruginosa tidak memiliki spora tidak memilki selubung atau sheat, dan memiliki flagel monotrik. Suhu optimum untuk pertumbuhannya adalah 42oC dan mampu membentuk biofilm untuk membantu kelangsungan hidupnya saat membentuk koloni. P. aeruginosa mampu menghasilkan biosurfaktan berupa rhamnolipid yang terdiri dari senyawa kimia dan terdiri dari dua molekul yaitu amfifilik dan hidrofilik. Molekul amfifilik terdiri dari dua gugus, dan molekul hidrofobik terdiri dari lapisan lemak yang memproses residu asam lemak (Nie, 2010).Pertumbuhan bakteri pendegradasi senyawa hidrokarbon dipengaruhi oleh beberapa faktor, yaitu :Suhu Viskositas minyak bumi meningkat dan volalitas senyawa toksik menurun apabila nerada pada suhu rendah, sehingga dapat menghambat proses biodegradasi (Atlas dan Bartha, 1981). Hidrokarbon rantai pendek seperti alkana lebih mudah larut dalam suhu rendah, tetapi senyawa aromatik justru mudah larut dalam suhu tinggi. Secara umum penaiikan suhu sampai batas optimum maka akan mempercepat laju biodegradasi. Laju biodegradasi laut dicapai pada suhu 15-20o C, laju biodegradasi tanah dicapai pada suhu 30-40oC, dan air tawar pada suhu 20-30oC (Dhas dan Chandran, 2010).pHBakteri pada umumnya memliki pH optimum pada pH alkalin, namun saat proses degradasi bakteri akan menghasilkan metabolit-metabolit asam dari proses metabolismenya (Notodarmojo, 2005).NutrisiPeningkatan jumlah dan reaksi metabolisme mikroorganisme dapat dilakukan dengan penambahan nutrien. Bakteri dapat mendegradasi senyawa hidrokarbon dengan laju yang lebih maksimum apabila dilakukan penambahan nutrisi organik seperti nitrogen, karbon, dan fosfor (Odu, 1978).Ketersediaan oksigenKetersediaan oksigen sangat dibutuhkan oleh mikroorganisme aerob dalam proses biodegradasi senyawa hidrokarbon jenuh dan aromatik. Namun mikroorganisme anaerob tanapa oksigen di air tanah tetap mampu mendegradasi senyawa benzena, toluena, etilbenzena, dan xylene (Johnson, 2003).Menurut Cookson (1995) bioremediasi dapat dilakukan untuk membersihkan lahan yang tekontaminasi bahan-bahan kimia berbahaya. Produk akhir bioremediasi berupa karbon dioksida, air, dan massa sel mikroorganisme. Kelebihan dari teknik bioremediasi adalah dapat mebersihkan pencemar hidrokarbon secara permanen, sementara teknik lainnya hanya memnidahkan saja; dapat dilakukan dilokasi tanah yang tercemar; proses yang terjadi merupakan proses alamiah; ramah lingkungan; dan relatif lebih murah. Menurut Zhang et al., (2012), bioremidiasi menggunakan menggunakan mikroba memiliki manfaat yang lebih baik jika dibandingkan secara fisika atau kimia. Kelebihan yang didapat antara lain harganya lebih murah, lebih efisien, dan tidak merusak lingkungan. Kekurangan teknik bioremidiasi adalah hasilnya sulit untuk diduga karena banyak faktor yang mempengaruhi; prosesnya lambat; hanya dapat dilakukan pada pencemar yang bersifat biodegradable; dan sulit menciptakan kondisi ideal untuk pertumbuhan mikroorganisme. Menurut Munawar (2012) terdapat dua teknik bioremediasi yaitu :Bioremediasi in situ, dimana pencemar dan media tercemarnya tetap berada pada tempat aslinya saat dilakukan proses bioremediasi.Bioremediasi ex situ, dimana pencemar dan media tercemarnya dipindahkan dari tempat aslinya ke tempat lain dimana proses bioremediasi dapat dilakukan. Sedangkan berdasarkan metode pengkayaannya, ada dua teknik bioremediasi yaitu :Bioremediasi augmentasi, dimana bioremediasi dilaksanakan dengan menggunakan mikroba khusus yang didatangkan dari tempat lain dan biasanya disertai dengan penambahan enzim.Bioremediasi simulasi, dimana bioremediasi dilakukan dengan mengandalkan mikroba asli tanah yang distimulasi metabolismenya (Munawar, 2012). Mikroorganisme yang menggunakan senyawa hidrokarbon sebagai sumber karbon dan energi ada yang bersifat aerob dan anaerob. Mikroorganisme aerob lebih cepat dan efektif dalam mendegradasi senyawa hidrokarbon karena reaksi aerob memerlukan lebih sedikit energi bebas untuk inisiasi dan menghasilkan lebih banyak energi. Secara aerob, hidrokarbon akan didegradasi secara beruntum oleh enzim, oksigen bertindak sebagai akseptor eksternal. Adapun degradasi alkana akan melibatkan pembentukan alkohol, aldehid, dan asam lemak. Asam lemak dipecah, CO2 dilepaskan dan membentuk asam lemak baru yang merupakan dua unti karbon yang lebih pendek dari molekul induk, proses ini dikenal sebagai beta oksidasi (Hamme, 2003).Degradasi senyawa hidrokarbon secara anaerob berbeda dengan aerob. Diketahui bahwa benzena, toluena, etil benzena, dan xylena dapat didegradasi tanpa O2. Xylena akan dirubah menjadi metilsuksinat, n-hexane dirubah menjadi 1-metilpentil suksinat, etil benzen akan dirubah menjadi 1-fenilmetil suksinat atau 1-fenoletanol, naftalen akan dirubah menjadi 2-naftoat. Pada reaksi aerob reseptor elektron dapat berupa NO3- , NO2- , SO42- , dan CO2 (Munawar, 2012).Berdasarkan hasil pengamatan didapatkan bahwa kelompok 1 dan 6 memiliki bentuk sel bakteri berupa coccus, sedangkan kelompok 2, 3, 4, 5, dan 7 berbentuk batang. Hasil uji oksidase didapatkan bahwa kelompok 3 dan 5 adalah negatif, sedangkan kelompok 1, 2, 4, 6, dan 7 adalah positif. Hasil uji katalase dan SBSA menunjukkan bahwa semua kelompok memberikan hasil positif. Hasil tersebut sesuai dengan pernyataan Nie (2010) bahwa bentuk atau morfologi bakteri Pseudomonas aeruginosa adalah batang atau coccus, oksidase positif, dan katalase positif. Berdasarkan hasil pengamatan didapatkan bahwa semua kelompok memiliki hasil absorbansi yang fluktuatif, hal ini tidak sesuai dengan Cooney et al., (1985) yang menyatakan bahwa senyawa hidrokarbon merupakan sumber C yang mampu didegradasi oleh bakteri-bakteri hidrokarbonoklastik yangb berasal dari lingkungan tercemar. Ktidakberhasilan proses degradasi senyawa hidrokarbon juga dapat disebabkan oleh faktor seperti temperatur, nutrisi, dan senyawa-senyawa yang terlarut dalam media.

IV. KESIMPULAN DAN SARAN

A. KesimpulanBerdasarkan pembahasan di atas dapat disimpulkan sebagai berikut :Bakteri Pseudomonas aeruginosa merupakan bakteri hidrokarbonoklastik, dimana bakteri ini mampu mendegradasi senyawa hidrokarbon dengan cara menghasilkan biosurfaktan. Pengaplikasian dalam skala laboratorium, bakteri Pseudomonas aeruginosa mampu mendegradasi solar yang dapat mencemari lingkungan.

B. SaranPraktikum sudah berjalan dengan baik, namun waktu pengamatan lebih diatur lagi sehingga semua bisa mengamati.

DAFTAR REFERENSICarvalho. 2005. Degradation of Hydrocarbons and Alkohols at Different Suhues and Salinitiesby Rhodococcus erythropolis DCL14. FEMS Microbiology Ecology Vol 5(1) : 389-399.Cooney, J. J. 1985. Factors Influencing Hydrocarbon Degradation In Three Freshwater Lakes. Microbial Ecology Vol 11 (2): 127-137. Cookson, J. T. 1995. Bioremediation Engineering : Design and Application. McGraw-Hill Inc, Toronto. Das, N. dan Preethy, C. 2010. Microbial Degradation of Petroleum Hydrocarbon Contaminants : An Overview. VIT University, India. Ghazali, M. F. 2004. Biodegradation of Hidrocarbons in Soil by Microbial Consortium. International Biodeteration and Biodegradation Vol 5(4) : 61-67.Hamme, D. J. 2003. Recent Advances in Petrolum Microbiology. Microbilogy and Molecular Biology Reviews Vol 6(7) : 503-548. Mubarok, Z. R. 2011. Pengaruh Penambahan Mn dan Mg pada Media Stone Mineral Salt Solution Extract Yeast Terhadap Kinerja Isolat BAKTERI DM-5. Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah, Jakarta. Hafsah. 2013. Isolasi Bakteri Pendegradasi Minyak Bumi Dari Pelabuhan Paotere Makassar. Fakultas Sains dan Teknologi UIN, Makassar. Johnson, J. S. Woolhouse J.K. 2003. Contribution of Anaerobic Microbial Activity to Natural Attenuation of Benzene in Groundwater. Engineering Geology Vol 70 : 343-349. Munawar, Ali. 2012. Tinjauan Proses Bioremediasi Melalui Pengujian Tanah Tercemar Minyak. UPN Press, Surabaya. Nasikhin, R. Maya, S. 2013. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Pendegradasi Solar dan Bensin dari Perairan Pelabuhan Gresik. Jurnal Sains dan Seni Pomits Vol 2 (2): 2337-3520.Nie, M. 2010. Novel Rhamnolipid Biosurfactants Prodeced By A Polycyclic Aromatic Hydrocarbon Degrading Bacterum Pseudomonas Aeruginosa Starin NY3. Agricultural University, China.Notodarmojo. 2005. Pencemaran Air dan Tanah. ITB Press, Bandung. Odu, C. T. I. 1978. The Effects of Nutrient Application and Aeration on Oil Degradation in Soil. Environ, Pollut Vol 15 : 235-240. Pertamina, Direktorat PPDN. 1998. Spesifikasi Bahan Bakar dan Gas. Priadie, B. 2012. Teknik Bioremediasi Sebagai Alternatif Dalam Upaya Pengendalian Pencemaran. Jurnal Ilmu Lingkungan Vol 10 (1): 38-48. Yani, Mohammad. 1994. Proses Biodegradasi Minyak Diesel Oleh Campuran Bakteri Pendegradasi Hidrokarbon. Jurnal Teknologi Indonesia Vol 19 (1): 40-44.Zhang, X. Dejun, Xu. Chunyan, Z.Tserenyam, L. Dan Kerstin, E. 2012. Isolation and Identification of Biosurfactant Producing and Crude Oil Degrading Pseudomonas aeruginosa strains. Journal Chemical Engineering 209: 138-146.