bio306 - ocw.usu.ac.idocw.usu.ac.id/course/download/8110000043-prinsip-bioteknologi/... · •...
TRANSCRIPT
![Page 1: BIO306 - ocw.usu.ac.idocw.usu.ac.id/course/download/8110000043-prinsip-bioteknologi/... · • Melakukan penyisipan bahan genetik operon galaktosa ... • Pemotongan DNA dengan cara](https://reader031.vdokumen.com/reader031/viewer/2022012919/5a7a76b37f8b9a27638dd2ff/html5/thumbnails/1.jpg)
Prinsip Bioteknologi
BIO306
![Page 2: BIO306 - ocw.usu.ac.idocw.usu.ac.id/course/download/8110000043-prinsip-bioteknologi/... · • Melakukan penyisipan bahan genetik operon galaktosa ... • Pemotongan DNA dengan cara](https://reader031.vdokumen.com/reader031/viewer/2022012919/5a7a76b37f8b9a27638dd2ff/html5/thumbnails/2.jpg)
KULIAH 6. TEKNIK DASAR KLONING
![Page 3: BIO306 - ocw.usu.ac.idocw.usu.ac.id/course/download/8110000043-prinsip-bioteknologi/... · • Melakukan penyisipan bahan genetik operon galaktosa ... • Pemotongan DNA dengan cara](https://reader031.vdokumen.com/reader031/viewer/2022012919/5a7a76b37f8b9a27638dd2ff/html5/thumbnails/3.jpg)
• Percobaan pertama penggabungan fragmen DNA secarain vitro dilakukan sekitar 30 tahun yang lalu olehJackson et al. (1972).
• Melakukan penyisipan bahan genetik operon galaktosa• Melakukan penyisipan bahan genetik operon galaktosadari Escherichia coli dan gen � ke dalam SV40.
• Pada tahun 1973, Cohen et al. melakukan konstruksiplasmid untuk pertama kalinya .
![Page 4: BIO306 - ocw.usu.ac.idocw.usu.ac.id/course/download/8110000043-prinsip-bioteknologi/... · • Melakukan penyisipan bahan genetik operon galaktosa ... • Pemotongan DNA dengan cara](https://reader031.vdokumen.com/reader031/viewer/2022012919/5a7a76b37f8b9a27638dd2ff/html5/thumbnails/4.jpg)
![Page 5: BIO306 - ocw.usu.ac.idocw.usu.ac.id/course/download/8110000043-prinsip-bioteknologi/... · • Melakukan penyisipan bahan genetik operon galaktosa ... • Pemotongan DNA dengan cara](https://reader031.vdokumen.com/reader031/viewer/2022012919/5a7a76b37f8b9a27638dd2ff/html5/thumbnails/5.jpg)
• Produksi komersial protein dalam jumlah sangat besar.• Hormon: insulin, hormon pertumbuhan manusia,
hormon pertumbuhan sapi, dan interferon.• Vaksin: hepatitis B, diare toksik, dan penyakit mulut
dan kaki pada hewan.
Produk Rekayasa Genetika
dan kaki pada hewan.• Faktor pembeku darah seperti plasminogen (pencair
beku darah) jaringan.
![Page 6: BIO306 - ocw.usu.ac.idocw.usu.ac.id/course/download/8110000043-prinsip-bioteknologi/... · • Melakukan penyisipan bahan genetik operon galaktosa ... • Pemotongan DNA dengan cara](https://reader031.vdokumen.com/reader031/viewer/2022012919/5a7a76b37f8b9a27638dd2ff/html5/thumbnails/6.jpg)
• Produksi bahan bakar pengganti minyak bumi melaluitransformasi sampah pertanian.
• Organisme pendegradasi untuk pengendalianpencemaran.
• Enzim seperti urokinase dan rennin. Antibodimonoklonal.
• Transfer gen pada tanaman untuk resistensi virus danherbisida, toleransi garam, dan peningkatan kandunganasam amino dll.
![Page 7: BIO306 - ocw.usu.ac.idocw.usu.ac.id/course/download/8110000043-prinsip-bioteknologi/... · • Melakukan penyisipan bahan genetik operon galaktosa ... • Pemotongan DNA dengan cara](https://reader031.vdokumen.com/reader031/viewer/2022012919/5a7a76b37f8b9a27638dd2ff/html5/thumbnails/7.jpg)
• Pemain utama dalam pengembangan teknik danaplikasi rekayasa genetika,
• Hampir seluruh metode rekayasa genetikadikembangkan melalui bantuan E. coli K12 yangberperan sebagai inang plasmid/fage rekombinan,
• Hingga saat ini hampir seluruh tahapan kloning,
E. coli sebagai Inang
• Hingga saat ini hampir seluruh tahapan kloning,karakterisasi, dan modifikasi fragmen DNA spesifikdilakukan dengan memanfaatkan sistem E. coli,
• Pengembangan vektor bolak-balik (shuttle vector) yangdiaplikasikan untuk organisme lain dikerjakan di dalamsistem E. coli,
• E. coli masih memainkan peran utama dalam industribioteknologi untuk memproduksi berbagai protein
![Page 8: BIO306 - ocw.usu.ac.idocw.usu.ac.id/course/download/8110000043-prinsip-bioteknologi/... · • Melakukan penyisipan bahan genetik operon galaktosa ... • Pemotongan DNA dengan cara](https://reader031.vdokumen.com/reader031/viewer/2022012919/5a7a76b37f8b9a27638dd2ff/html5/thumbnails/8.jpg)
• Bahan genetik berupa material DNA untuk tujuanrekombinasi harus memiliki berat molekul tinggi.
• DNA tersebut dipotong dengan cara mekanis ataudengan cara enzimatik (restriction endonuclease).
Isolasi fragmen DNA
dengan cara enzimatik (restriction endonuclease).• Pemotongan DNA dengan cara mekanik: pengocokan
atau sonikasi, ukuran fragmen DNA tidak seragam.
![Page 9: BIO306 - ocw.usu.ac.idocw.usu.ac.id/course/download/8110000043-prinsip-bioteknologi/... · • Melakukan penyisipan bahan genetik operon galaktosa ... • Pemotongan DNA dengan cara](https://reader031.vdokumen.com/reader031/viewer/2022012919/5a7a76b37f8b9a27638dd2ff/html5/thumbnails/9.jpg)
Teknik Isolasi DNA
![Page 10: BIO306 - ocw.usu.ac.idocw.usu.ac.id/course/download/8110000043-prinsip-bioteknologi/... · • Melakukan penyisipan bahan genetik operon galaktosa ... • Pemotongan DNA dengan cara](https://reader031.vdokumen.com/reader031/viewer/2022012919/5a7a76b37f8b9a27638dd2ff/html5/thumbnails/10.jpg)
![Page 11: BIO306 - ocw.usu.ac.idocw.usu.ac.id/course/download/8110000043-prinsip-bioteknologi/... · • Melakukan penyisipan bahan genetik operon galaktosa ... • Pemotongan DNA dengan cara](https://reader031.vdokumen.com/reader031/viewer/2022012919/5a7a76b37f8b9a27638dd2ff/html5/thumbnails/11.jpg)
• Strategi umum yang digunakan dalam menghasilkanfragmen sangat ditentukan oleh tujuan metodepengklonan.
• Pemotongan DNA dengan enzim tunggal akan• Pemotongan DNA dengan enzim tunggal akanmenghasilkan fragmen dengan ujung identik.
• Kombinasi enzim (2 atau lebih enzim) digunakan untukmenghasilkan fragmen dengan ujung yang berbeda-beda.
![Page 12: BIO306 - ocw.usu.ac.idocw.usu.ac.id/course/download/8110000043-prinsip-bioteknologi/... · • Melakukan penyisipan bahan genetik operon galaktosa ... • Pemotongan DNA dengan cara](https://reader031.vdokumen.com/reader031/viewer/2022012919/5a7a76b37f8b9a27638dd2ff/html5/thumbnails/12.jpg)
Sticky end Blunt end
Restriction endonuclease
Sticky end Blunt end
![Page 13: BIO306 - ocw.usu.ac.idocw.usu.ac.id/course/download/8110000043-prinsip-bioteknologi/... · • Melakukan penyisipan bahan genetik operon galaktosa ... • Pemotongan DNA dengan cara](https://reader031.vdokumen.com/reader031/viewer/2022012919/5a7a76b37f8b9a27638dd2ff/html5/thumbnails/13.jpg)
Ujung bangku (sticky end hasil pemotongan restriction endonuclease
![Page 14: BIO306 - ocw.usu.ac.idocw.usu.ac.id/course/download/8110000043-prinsip-bioteknologi/... · • Melakukan penyisipan bahan genetik operon galaktosa ... • Pemotongan DNA dengan cara](https://reader031.vdokumen.com/reader031/viewer/2022012919/5a7a76b37f8b9a27638dd2ff/html5/thumbnails/14.jpg)
• Pembentukan/pembuatan ujung yang komplemen, danpenyambungan melalui pembentukan ikatanfosfodiester yang dimediasi dengan menggunakan enzimpenyambung DNA (DNA-ligase mediated phosphodiester
Penyambungan molekul DNA
penyambung DNA (DNA-ligase mediated phosphodiesterbond formation).
![Page 15: BIO306 - ocw.usu.ac.idocw.usu.ac.id/course/download/8110000043-prinsip-bioteknologi/... · • Melakukan penyisipan bahan genetik operon galaktosa ... • Pemotongan DNA dengan cara](https://reader031.vdokumen.com/reader031/viewer/2022012919/5a7a76b37f8b9a27638dd2ff/html5/thumbnails/15.jpg)
Pemotongan DNA dan penyambungan dengan ligase
![Page 16: BIO306 - ocw.usu.ac.idocw.usu.ac.id/course/download/8110000043-prinsip-bioteknologi/... · • Melakukan penyisipan bahan genetik operon galaktosa ... • Pemotongan DNA dengan cara](https://reader031.vdokumen.com/reader031/viewer/2022012919/5a7a76b37f8b9a27638dd2ff/html5/thumbnails/16.jpg)
Pembentukan ujung bangku (sticky-ends) dengan memotong molekul DNAdengan menggunakan enzim pemotong yang sama.
Pemotongan DNA dengan enzim restriksi berbeda namun menghasilkan ujungkomplemen (kohesif) yang sama.
![Page 17: BIO306 - ocw.usu.ac.idocw.usu.ac.id/course/download/8110000043-prinsip-bioteknologi/... · • Melakukan penyisipan bahan genetik operon galaktosa ... • Pemotongan DNA dengan cara](https://reader031.vdokumen.com/reader031/viewer/2022012919/5a7a76b37f8b9a27638dd2ff/html5/thumbnails/17.jpg)
Pembuatan ujung bangku yang bersesuaian (compatible) dengan mengisi 5’-ujung menonjol (protruding) secara parsial
![Page 18: BIO306 - ocw.usu.ac.idocw.usu.ac.id/course/download/8110000043-prinsip-bioteknologi/... · • Melakukan penyisipan bahan genetik operon galaktosa ... • Pemotongan DNA dengan cara](https://reader031.vdokumen.com/reader031/viewer/2022012919/5a7a76b37f8b9a27638dd2ff/html5/thumbnails/18.jpg)
• Digunakan untuk mengangkut bahan genetik/fragmenDNA ke dalam sel hidup.
• Beberapa sistem vektor telah dikembangkan terutamauntuk inang E. coli. Vektor ini dibagi ke dalam 3 jenis,
Sistem Vektor
untuk inang E. coli. Vektor ini dibagi ke dalam 3 jenis,yaitu: vektor baktetiofaga, plasmid, dan cosmid.
![Page 19: BIO306 - ocw.usu.ac.idocw.usu.ac.id/course/download/8110000043-prinsip-bioteknologi/... · • Melakukan penyisipan bahan genetik operon galaktosa ... • Pemotongan DNA dengan cara](https://reader031.vdokumen.com/reader031/viewer/2022012919/5a7a76b37f8b9a27638dd2ff/html5/thumbnails/19.jpg)
Vektor bakteriofage
• Kemampuan fage menginfeksi dan memindahkaninformasi genetik dari satu inang ke inang lain dalamspesies yang sama (transduksi).
• Digunakan terutama untuk konstruksi pustaka DNA.• Efisiensi transfer yang tinggi, dapat diseleksi langsung,
dan efisiensi kloning fragmen DNA yang besar.• Mengepak DNA konkatemer yang mengandung paling
sedikit 2 situs cos.• Ukuran DNA yang dapat dipak antara 75-108% ukuran
genom normal fage.• Contoh vektor untuk E. coli yaitu �, misalnya
EMBL3, GEM-11, gt10, gt11, dan ZAP11 (Gambar23).
![Page 20: BIO306 - ocw.usu.ac.idocw.usu.ac.id/course/download/8110000043-prinsip-bioteknologi/... · • Melakukan penyisipan bahan genetik operon galaktosa ... • Pemotongan DNA dengan cara](https://reader031.vdokumen.com/reader031/viewer/2022012919/5a7a76b37f8b9a27638dd2ff/html5/thumbnails/20.jpg)
Transfer bahan genetik dengan vektor faga
![Page 21: BIO306 - ocw.usu.ac.idocw.usu.ac.id/course/download/8110000043-prinsip-bioteknologi/... · • Melakukan penyisipan bahan genetik operon galaktosa ... • Pemotongan DNA dengan cara](https://reader031.vdokumen.com/reader031/viewer/2022012919/5a7a76b37f8b9a27638dd2ff/html5/thumbnails/21.jpg)
• Mempunyai sistem replikasi.• Penanda seleksi (selection marker); gen resisten
antibitik (Ampr, Chlor, Knr/Neor, dan Trr) sertapenanda lainnya seperti gen lac,
• Posisi kloning; ditempatkan di luar sekuen esensial danmemiliki situs potong enzim pemotong yang dapatdigunakan untuk memasukkan fragmen DNA asing ke
Vektor plasmid
digunakan untuk memasukkan fragmen DNA asing kedalam plasmid.
![Page 22: BIO306 - ocw.usu.ac.idocw.usu.ac.id/course/download/8110000043-prinsip-bioteknologi/... · • Melakukan penyisipan bahan genetik operon galaktosa ... • Pemotongan DNA dengan cara](https://reader031.vdokumen.com/reader031/viewer/2022012919/5a7a76b37f8b9a27638dd2ff/html5/thumbnails/22.jpg)
Plasmid pBR322
![Page 23: BIO306 - ocw.usu.ac.idocw.usu.ac.id/course/download/8110000043-prinsip-bioteknologi/... · • Melakukan penyisipan bahan genetik operon galaktosa ... • Pemotongan DNA dengan cara](https://reader031.vdokumen.com/reader031/viewer/2022012919/5a7a76b37f8b9a27638dd2ff/html5/thumbnails/23.jpg)
• Cosmid merupakan vektor hibrida yang merupakankombinasi sifat-sifat yang menguntungkan antaraplasmid dan bagian dari faga.
• Relatif kecil namun mampu membawa fragmen DNAberukuran besar (� 50 kb).
Vektor cosmid
![Page 24: BIO306 - ocw.usu.ac.idocw.usu.ac.id/course/download/8110000043-prinsip-bioteknologi/... · • Melakukan penyisipan bahan genetik operon galaktosa ... • Pemotongan DNA dengan cara](https://reader031.vdokumen.com/reader031/viewer/2022012919/5a7a76b37f8b9a27638dd2ff/html5/thumbnails/24.jpg)
Transfer bahan genetik dengan cosmid
![Page 25: BIO306 - ocw.usu.ac.idocw.usu.ac.id/course/download/8110000043-prinsip-bioteknologi/... · • Melakukan penyisipan bahan genetik operon galaktosa ... • Pemotongan DNA dengan cara](https://reader031.vdokumen.com/reader031/viewer/2022012919/5a7a76b37f8b9a27638dd2ff/html5/thumbnails/25.jpg)