E. Dehidrasi (dehydration)

Dehidrasi adalah proses penarikan air dari dalam jaringan dengan menggunakan bahan-bahan kimia tertentu. Dehidrasi bertujuan untuk mengeluarkan air dari dalam jaringan yang telah difiksasi. Proses dehidrasi merupakan serangkaian proses dengan cara memasukan sample ke dalam larutan dehidrasi secara berseri dari konsentrasi rendah sampai konsentrasi tinggi dengan mengurai konsentrasi air. Dehidran yang paling umum digunakan pada mikroteknik dengan metode paraffin adalah alkohol. Jenis dehidran lain adalah dioksan, N-butyl alcohol, aniline oil dan bergamot oil. Alcohol merupakan dehidran yang umum digunakan, karena relatife lebih murah dan mudah diperoleh, tapi mampu menghasilkan hasil yang baik, bahkan untuk jenis-jenis jaringan-jaringan lunak seperti otak, sumsum tulang belakang, dan embrio. Dalam penggunaan alcohol dipakai serial dengan konsentrasi yang berbeda, dimulai dari konsentrasi rendah ke konsentrasi tinggi (35%-50%-70%-80%-95%-100%). Lama perendaman tergantung untuk masing-masing konsetrasi berkisar 1-6 jam. Alcohol 70% sebagai stoping point, jaringan di malamkan. Proses dehidrasi dalam berbagai konsentrasi alcohol dilakukan setingkat demi setingkat. Tujuannya adalah untuk menjaga agar tidak terjadi perubahan secara tiba-tiba dalam terhadap sel jaringan, sehingga perubahan struktur sel yang terjadi sekecil mungkin. Apabila proses dehidrasi ini tidak sempurna berarti masih ada molekul air dari dalam jaringan. Ketidaksempurnaan proses dehidrasi ini dapat diketahui dengan jelas setelah jaringan dimasukan ke dalam zat penjernih, dimana jaringan tidak menjadi transparan walaupun jaringan telah lama dalam larutan penjernih. Jika terjadi hal yang demikian, maka jaringan harus dikembalikan ke dehidran.

Dehidrasi adalah pengurangan air atau cairan dalam sel atau jaringan. Dimana hal ini bertujuan untuk menyamakan suatu keadaan karena air bersifat polar sedanakan parafin bersifat non polar karena perbedaan sifat kedua zat tersebut air harus dikeluarkan dengan memakai alkohol. Langkahnya sebagai berikut:1. Menambahkan Alkohol 70% selama 2 jam atau lebih pada objek, setelah 2 jam buang cairannya.

2. Memasukkan Alkohol 96% selama 1 jam 2 kali, setelah 1 jam 2 kali buang cairannya.

3. Memasukkan Alkohol absolut 1 jam 2 kali, setelah 1 jam 2 kali buang cairannya.

4) Clearing/penjernihan

1. Masukkan benzyl benzoat terlebih dahulu kedalam objek paling lama 24 jam, setelah 24 jam buang cairannya.

2. Kemudian memasukkan wash bensin kedalam objek selama 15 menit.

Catatan: Melakukan dehidrasi dimulai dari alkohol dibawah 70% tidak apa-apa tapi kalau diimulai langsung dari alkohol absolut tidak bisa karena pada alkohol absolut airnya sangat sedikit sehingga ditakukan penarikan air pada objek terjadi terlalu keras sehingga merusak jaringan.

F. Penjernihan (Clearing)

Clearing merupakan proses harus segera dilakukan setelah dehidrasi. Tujuan dari penjernihan ini adalah menggantikan tempat alcohol sementara dalam jaringan yang telah mengalami proses dehidrasi dengan suatu solven atau medium penjernih sebelum proses penanaman dalam paraffin. Medium penjernih ini akan menjernihkan atau mentranparankan jaringan agar kemudian dapat terwarnai dengan baik dan memperlihatkan warna sesuai dengan warna pewarnanya.

Lama jaringan dalam medium penjernih tergantung pada:

1. Ketebalan dan tingkat kepadatan jaringan

2. jenis reagen yang dipakai

3. bila dehidrasi telah sempurna, maka lamnya xilol atau benzene adalah setengah hingga tiga jam. Bila dibiarkan cukup lama dalam penjernih, maka jaringan akan mengeras dan rapuh yang tentunya sulit untuk di sayat.

4. Jenis jaringan, seperti syaraf atau kelenjar limfa sebaiknya penjernih dalam menggunakan minyak cadar atau kloroform, karena jaringan tersebut cenderung menjadi keras atau getas bila dijernihkan dengan xilol atau benzene.

Bahan-bahan yang dapat digunakan sebagi penjernih:

1. minyak anilin

2. Benzene

3. karbon tetraklorida

4. karbon bisulfide

5. minyak kayu cadar

6. kloroform

7. minyak cengkeh

8. Xylol

G. Infiltrasi (Infiltration)

Infiltrasi adalah suatu usaha menyusupkan media penanaman (embedding media) ke dalam jaringan dengan jalan menggantikan kedudukan dehidran dan bahan penjernih (clearing agents). Media penanaman yang digunakan dalam infiltrasi ini adalah paraffin. Proses infiltrasi ini umumnya dilakukan di dalam oven yang suhunya dapat diatur sesuai titik leleh jenis paraffin yang digunakan. Pada jaringan hewan bisa langsung digunakan paraffin keras dengan titik leleh 56-58C.

Dalam proses infiltrasi sebaiknya jaringan jangsn langsung dimasukan ke dalam paraffin murni, tetapi sebelum paraffin murni jaringan dimasukkan terlebih dahulu ke dalam campuran bahan penjernih dan paraffin murni dengan perbandingkan yang sama. Waktu yang diperlukan jaringan campuran ini terlalu lama cukup berkisar antara 10-30 menit saja tergantung besar kecilnya jaringan. Tujuan dari semua ini adalah untuk menghindari jaringan dsri prubshsn lingkungsn yang sangat mendadak. Perubahan-perubahan yang mendadak ini dapat menimbulkan kerusakan pada jaringan itu sendiri, seperti jaringan menjadi sangat mengkerut,dll.Setelah dalam campuran paraffin dan bahan penjernih, jaringan baru dipindahkan ke paraffin murni sebanyak tiga kali ganti yang masing-masingnya berkisar antara 30-60 menit. Usahakan jaringan jangan terlalu lama ditinggalkan dalam oven. Tujuan dari tahap infiltrasi ini adalah untuk mengisi jaringan dengan paraffin sebagi pengikat jaringan agar tetap memiliki bentuk dan struktur yang sama seperti hidup.

H. Penanaman (Embedding)

Embedding atau penanaman merupakan proses memasukan atau penanaman jaringan ke dalam balok-balik paraffin (cetakan) sehingga memudahkan proses penyayatan dengan bantuan mikrotom. Tujuan dari tahap ini adalah untuk membuat balok paraffin yang berisi jaringan yang akan dibuat preparat permanen.

Paraffin yang digunakan untuk menanam jaringan harus memiliki titik leleh yang sama dengan paraffin yang digunakn waktu infiltrasi. Paraffin ketiga yang dipakai pada infiltrasi dapat digunakan langsung untuk penanaman dengan syarat memang sudah bersih dari bahan penjernih.

Hal-hal yang harus diperhatikan dalam penanaman adalah:

o Paraffin yang digunakan benar-benar bersih dan murni

o Peralatan yang digunakan benar-benar khusu untuk prose situ saja

o Pembuatan balok sebaiknya dilakukan dekat oven atau lampu Bunsen agar lebih cepat, susunjaringan sesuai dengan orientasi yang direncanakan.

o Jaringan sebaiknya diberi label untuk menghindari kesalahan atau bertukar.

o Untuk jenis-jenis jaringan yang halus perlu dikerjakan di bawah lup

o Jangan sampai ada gelembung udara pada balok paraffin yang dibuat terutama dekat jaringan.

I. Penyayatan (Sectioning)

Proses penyayatan adalah pembuatan sayatan atau pita dari balok parafin yang telah terbentuk dengan menggunakan mikrotom, yang bertujuan untuk membuat sayatan jaringan dan dapat dilihat jelas dari dalam mikroskop.

Pembuatan irisan dengan metode parafin memiliki beberapa keuntungan, diantaranya adalah yaitu proses embedding lebih cepat dan lebih simpel, material embedding dapat disimpan dalam waktu yang lama pada kondisi kering, serta dapat membuat irisan yang tipis. Embedding menggunakan paraffin sangat baik digunakan untuk studi embriologi, anatomi dan sitologi (Khasim, 2002).

Mikrotom adalah mesin untuk mengiris spesimen biologi menjadi bagian yang sangat tipis untuk pemeriksaan mikroskop. Beberapa mikrotom menggunakan pisau baja dan digunakan untuk mempersiapkan sayatan jaringan hewan atau tumbuhan dalam histologi. Jenis-jenis mikrotom yang bisa dipakai pada mikroteknik adalah:1. Rocking microtom, cara kerjanya seperti mengatam kayu, biasanya untuk organ-organ keras seperti kayu

2. Rotary microtom atau mikrotom putar, cara kerjanya dengan di putar yang akan mengerakan objek maju dan naik turun, sementara pisaunya tetap. Mikrotom ini biasanya dipakai dalam mikroteknik metode paraffin

3. Sliding microtom atau mikrotom sorong, dimana jaringan tetap posisinya dan pisau yang bergerak maju dan mundur. Mikrotom ini sering digunakan pada mikroteknik metode paraffin, walau umumnya digunakan pada penyayayan jaringan yang di tanam dalam celloidin. Biasanya digunakan pada objek-objek yang keras.

4. Freezing microtom atau mikrotom beku, sering digunakan untuk penyayatan jaringan yang tidak ditanam dalam paraffin maupun dalam celloidin, jadi jaringan yang disayat adalah jaringan yang tidak di tanam tetapi dibekukan dengan memakai gas CO2. Keuntungan dari mikrotom ini adalah waktu yang dipakai lebih pendek, karena langsung disayat setelah proses fiksasi. Kerugiannya adalah bila temperature kamar tinggi, objek menjadi lunak sehingga sulit dipotong.

Hal-hal yang harus diperhatikan dalam proses penyayatan ini adalah:

o Mikrotom harus seberat mungkin

o Meja tempat mikrotom harus stabil

o Pisau harus cocok dengan mikrotom

o Posisi pisau harus stabil

o Mata bisau harus tajam, bersih dan suhunya harus sama dengan balok jaringan yang akan disayat.

J. Penempelan dan Afiksasi (Afixing)Affixing adalah proses pelekatan atau penempatan sayatan jaringan pada kaca objek dengan bantuan media pelekat tertentu. Tujuan penempelan ini adalah untuk menempelkan pita paraffin yang sudah berisi sayatan jaringan pada kaca objek.

Media pelekat yang umumnya digunakan adalam mayers albumen yang formulanya adalah sebagai berikut :

( Putih telur sebanyak 50 bagian

( Gliserin sebanyak 50 bagian

( Kristal Tymol beberapa butir

( Akuadest beberapa tetes

K. Deparafinasi dan Pewarnaan (Staining)

Deparafinasi adalah suatu tahap menjelang proses pewarnaan dengan menggunakan xilol untuk membersihkan paraffin dari jaringan dan kaca objek. Pengerjaan deparafinasi aserial atau berkelanjutan dengan pengerjaan pewarnaan. Tujuan dari tahap ini untuk membersihkan jaringan dan kaca objek dari paraffin.

Pewarnaan merupakan suatu tahap dalam mikroteknik untuk mempertajam atau memperjelas berbagai elemen jaringan, terutama sel-seknya, sehingga dapat dibedakan dan ditelaah dengan mikroskop.tanpa pewarnaan, jaringan akan transparan sehingga sulit untuk diamati. Pewarnaan akan memperjelas rinci suatu jaringan sehinnga mudah untuk dipelajari. Pewarnaan dibedakan antara non vital dengan vital

a. Pewarnaan non vital, pewarnaan dilakukan setelah jaringan dimatikan melalui fiksasi. Teknik ini merupakan teknik dan cara yang paling alzim digunakan, terutama untuk pekerjaan rutin sehari-hari, terutama pembuatan preparat/sediaan praktikum bagi mahasiswa.

b. Pewarnaan vital, maka proses pewarnaan dilakukan selagi jaringan/sel masih dalam keadaan hidup. Sel-sel yang masih hidup tersebut diharapkan mampu untuk menyerap warna maupun mengikat/memfagosit partikel-partikel zat warna. Dengan demikian zat warna yang hendaknya yang tidak bersifat toksik bagi sel-sel tersebut. Sebagai contoh, tinta china dan lithium carmine secara umum digunakan untuk mengamati penyebaran sifat sel-sel RES, karena sel-sel tersebut mampu memfagosit zat warna.

c. Pewarnaan supra-vital diharapkan pada hasil kultur sel dan jaringan

Dalam arti yang sangat luas, zat warna mencakup bahan organic dan bahan anorganik, yang mengadakan ikatan dengan jaringan lebih jelas untuk diamati. Ditinjau dari berbagai segi, maka zat warna dapat kita bedakan atau kelompokan pada kategori-kategori tertentu. Berikut ini adalah pembagian zat warna bergasarkan berbagai kategori tersebut.

1. Berdasarkan sifatnya, meliputi:

a. Zat warna asam, adalah garam-garam dari asam-asam pembawa warna dengan radikal basa yang tidak berwarna. Contoh: acid fuchsin, eosin, dan lain sebagainya

b. Zat warna basa, adalah garam-garam dari basa pembawa warna dengan radikal asam yang tidak berwarna.

2. Berdasarkan asalnya, meliputi:

a. Zat warna alami, berupa zat warna yang diperoleh dari alam, baik dari tumbuhan maupun dari hewan, contoh hematokillin, adalah zat warna yang berasal dari tumbuhan (Hehatoxylin campechianum)

b. Zat warna sintetis, mencakup jenis-jenis zat warna yang dibuat di pabrik. Contoh: basic fuchsin, dibuat dari campuran analin dan paratoluidin.

3. Berdasarkan kemampuan mengenai warna (staining power), meliputi:

a. Zat warna substantife

Jenis zat warna yang mampu mewarnai jaringan secara langsung. Contoh janus green B, Neutral red.

b. Zat warna ajektif

Jenis zat warna yang pada penggunaannya, agar mampu mewarnai jaringan, harus menggunakan bantuan mordan. Contoh hematoxillin dari formula Ehrlich. Pada formula tersebut diberikan pula kalium alumunium secara berlebihan yang berfungsi sebagai mordan.

4. Berdasarkan jumlah/ komposisi zat warna yang digunakan,meliputi:

a. Pewarna tunggal (single staining), hanya menggunakan satu jenis zat warna, contohnya untuk melihat polysacharida sulphate ester serta hyaluronic, maka digunakan zat warna tunggal gentian violet.

b. Pewarna ganda/ rangkap (double staining, menggunakan dua jenis zat warna, contoh pada system pewarnaan hematoxilin-eosin

c. Pewarnaan rangkap tiga (triple staining), menggunakan tiga jenis zat warna, contohnya formula Marllory triple stai yang menggunakan zat-zat warna acid fuchsin, aniline blue serta orange G.

d. Pewarnaan rangkap empat, jarang digunakan dalam kerja rutin, kecuali untuk tujuan khusus.

5. Berdasarkan struktur jaringan yang akan diwarnai, meliputi:

a. Pewarnaan umum, seperti Hematoxillin eosin, fastgreen safranin

b. Bewarnaan khusus, seperti pewarnaan jaringan ikat yaitu Molary azan, aniline blue, asam phospatungistik, korhensen, dan lain-lain