35

BAB IV

METODE PENELITIAN

4.1 Desain Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental untuk menguji aktivitas

antibakteri dengan kombinasi ekstrak etanol daun Annona squamosa (EDAS) dan

daun Jatropha gossypifolia (EDJG) terhadap pertumbuhan bakteri Staphylococcus

aureus dan Escherichia coli.

4.2 Lokasi Penelitian

Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Biologi

Universitas Negeri Malang.

4.3 Alat Penelitian

1. Inkubator

2. Autoclave

3. Laminar Air Flow

4. Penjepit

5. Mikroskop

6. Kertas Cakram

7. Jarum ose steril

8. Oven

9. Lemari Pendingin

10. Erlenmeyer

11. Tabung Reaksi

12. Ephendrop

13. Labu Ukur

14. Batang Pengaduk

15. Beaker glass

16. Cawan Penguap

17. Kassa Steril

18. Mikropipet

19. Blue tip dan yellow tip

36

4.4 Bahan Penelitian

4.4.1 Bahan Uji

Pada penelitian ini bahan uji yang digunakan yaitu ekstrak etanol daun

Annona squamosayang didapatkan dari penelitian sebelumnya oleh Ibu Siti

Rofida (2015), kegiatan pengujian Aktivitas Antihiperlipidemia Ekstrak Etanol

Daun Annona squamosa dan ekstrak etanol daunJatropha gossypifolia yang

didapatkan dari penelitian sebelumnya oleh Dilla Novita (2015), kegiatan

pengujian Perbandingan Aktivitas Antioksidan Ekstrak Etanol Daun

JatrophagossypifoliaLinn dari Berbagai Metode Ekstraksi Remaserasi. Daun

Jatrophagossypifolia didapatkan dari kecamatan Grati, Kabupaten Pasuruan dan

telah diidentifikasi oleh Balai Materia Medika, Dinas Kesehatan, Jawa Timur.

Adapun mikroba uji yang digunakan yaitu Escherichia coli dan

Staphylococcus aureus yang didapatkan dari Laboratorium Mikrobiologi

Universitas Muhamadiyah Malang.

4.4.2 Sampel Bakteri

Bakteri Staphyococcus aureus dan Escherichia coli diisolasi pada media

media Mueller Hinton Agar (MHA) diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24 jam.

4.4.3 Pengujian Difusi Cakram

1. Mueller Hinton Agar (MHA)

2. Mueller Hinton Broth(MHB)

3. Kloramfenikol 30 μg sebagai kontrol positif

4. Aquades steril

5. DMSO 10%

4.5 Sterilisasi Bahan dan Alat

Semua bahan yang akan digunakan dalam penelitian, di sterilisasikan

terlebih dahulu dengan cara sterilisasi pemanasankering dan sterilisasi pemanasan

basah.

4.5.1 Sterilisasi Pemanasan Kering

Sterilisasi pemanasan dibagi menjadi 2 cara yaitu sterilisasi dengan api

langsung dan dengan oven pemanas.

37

1. Sterilisasi dengan api langsung

Cara sterilisasi ini dilakukan untuk alat-alat seperti jarum ose, pinset, spatel,

mulut tabung dan batang pengaduk.

2. Sterilisasi dengan oven pemanas

Sterilisasi dengan oven pemanas digunakan untuk sterilisasi alat seperti gelas

yang tidak berskala, seperti cawan petri, tabung reaksi, dan penjepit. Setelah

mencapai suhu 160ºC, alat-alat yang akan disterilkan dimasukkan ke dalam

oven selama 1-2 jam. (Entjang,2003)

4.5.2 Sterilisasi Pemanasan Basah

Sterilisasi pemanasan basah dilakukan dengan menggunakan autoklaf. Alat

yang di sterilkan menggunakan metode ini yaitu gelas ukur, erlenmeyer, dan pipet

tetes. Proses sterilisasi ini dilakukan pada suhu 121ºC selama 15-20 menit.

4.6 Media Uji Bakteri

Pada uji ini, digunakan Mueller Hinton Agar (MHA) sebagai media uji. MHA

adalah salah satu media untuk pemeriksaan sensibilitas tes (dengan metode Kirby-

bauer). Komposisi yang terkandung pada MHA yaitu Beef Extract 2 gram, Acid

Hydrolysate of Casein 17,5 gram, Starch 1,5 gram, Agar 17 gram dan Aquadest 1

liter, pH akhir Mueller Hinton Agar 7,3 ± 0,1 pada suhu 25 ºC.

4.7 Metode Penelitian

4.7.1 Rancangan Penelitian

Penelitian ini bersifat eksperimental yang bertujuan untuk mengetahui

zona hambat aktivitas antibakteri S.aureus dan E.coli dari kombinasi ekstrak daun

Annona squamosa dan Jatropha gossypiifolia secara in vitro dengan metode difusi

cakram. Pada penelitian ini, dilakukan dengan menggunakan dua perlakuan yaitu

kelompok uji dan kelompok kontrol. Penelitian ini melalui beberapa tahapan,

yaitu persiapan konsentrasi kombinasi ekstrak dan pengujian antibakteri dengan

metode difusi cakram.

38

4.7.2 Kerangka Operasional

4.8 Variabel Penelitian

4.8.1 Variabel Terikat

Pada penelitian ini yang termasuk variabel terikat adalah diameter zona

hambat yag dihasilkan oleh senyawa uji yang ditandai dengan adanya warna

bening di sekitar senyawa uji yang terdapat pada media agar sebagai parameter

untuk menentukan hambat minimum senyawa ekstrak etanol.

4.8.2 Variabel Bebas

Pada penelitian ini yang termasuk variabel bebas yaitu komponen senyawa

kimia pada kombinasi EDAS dan EDJG dengan perbandingan konsentrasi

EDAS;EDJG untuk bakteri S.aureusdan E.coli, yaitu 62,5 mg/mL : 50 mg/mL;

62,5 mg/mL : 25mg/mL; dan 125 mg/mL : 25 mg/mL.

4.9 Prosedur Kerja

4.9.1 Preparasi Sampel

4.9.1.1 Persiapan Ekstrak Etanol 96% Daun Jarak Merah

Sampel yang diteliti adalah daun jarak merah (Jatropha gossypifolia Linn).

Jarak merah dicuci dengan air hingga bersih dan dipisahkan dari rantingnya,

kemudian diangin-anginkan pada suhu kamar selama 30 menit. Pengeringan

simplisia dilakukan dengan menggunakan oven pada suhu 40-50ºC. Bagian daun

Persiapan Bahan Uji

Persiapan Konsentrasi Kombinasi Ekstrak

Preparasi Media dan Bakteri

Pengujian Difusi Cakram

Analisis Data

Kelompok Kontrol : -Kontrol Postif (Kloramfenikol 30 μg)

-Kontrol Negatif (DMSO 10%)

Kelompok Uji : Ekstrak etanol kombinasi daun srikaya

(Annona squamosa) dan srikaya

(Jatropha gossypifolia)

Gambar 3. 1Kerangka operasional

Gambar 4. 1Kerangka operasional

39

jarak merah yang telah kering kemudian dihaluskan dengan mesin penggilingan,

sehingga diperoleh serbuk halus. Selanjutnya diayak menggunakan Shieve shaker

dengan derajat kehalusan tertentu dan selanjutnya disimpan pada suhu ruangan

(Farmakope Herbal Indonesia, 2009).

Proses ekstraksi menggunakan metode remaserasi non kinetik selama 24

jam menggunakan pelarut etanol 96%. Cara pembuatannya adalah sebagai berikut

(BPOM, 2010; Fauzana, 2010: Farmakope Herbal Indonesia, 2008: Handa, 2008):

1. Timbang serbuk halus daun Jatropha gossypifolia sebanyak 100 gram

masukkan ke dalam beaker glass.

2. Maserasi dengan etanol 96% sebanyak 1000,0 mL, diamkan selama 24 jam,

saring, dan ditampung filtratnya

3. Residu dimaserasi kembali dengan etanol 96% sebanyak 1000,0 mL dan

diamkan selama 24 jam, saring, dan ditampung filtratnya.

4. Residu dimaserasi kembali dengan etanol 96% sebanyak 1000,0 mL dan

diamkan selama 24 jam, saring dan ditampung filtratnya.

5. Filtrat dikumpulkan lalu dipekatkan dengan rotary evaporator vacum sampai

diperoleh larutan ekstrak kental, kemudian dipindahkan ke cawan porselen.

6. Ekstrak kental dikeringkan di oven pada suhu 40ºC.

4.9.1.2 Pembuatan Ekstrak Etanol Daun Annona squamosa

Daun Annona squamosa Linn dikeringkan pada suhu ruangan selama satu

minggu. Daun Annona squamosa L., kering kemudian dihancurkan dengan

menggunkan alat penggiling. Serbuk yang sudah ditimbang kemudian diekstraksi

menggunakan etanol sebagai pelarut. Larutan kemudian dievaporasi sampai

memperoleh ekstrak kental. Ekstrak disimpan pada suhu 2-8ºC sampai akan

digunakan.

4.10.1 Tahap Persiapan

4.10.1.1 Persiapan Dosis Larutan Uji

Daripenelitian sebelumnyatelah diketahui konsentrasi tiap tanaman

sebagai antibakteri, sehingga pada pengujian digunakan perbandingan konsentrasi

larutan uji kombinasi EDAS dan EDJG sebagai berikut :

40

1) Perbandingan konsentrasi untuk bakteri S.aureus

a) Konsentrasi 1 = srikaya (Annona squamosa) 62,5 mg/mL dan jarak merah

(Jatropha gossypifolia) 50 mg/mL

b) Konsentrasi 2 = srikaya (Annona squamosa) 62,5 mg/mL dan jarak merah

(Jatropha gossypifolia) 25 mg/mL

c) Konsentrasi 3 = srikaya (Annona squamosa) 125 mg/mL dan jarak merah

(Jatropha gossypifolia) 25 mg/mL

2) Perbandingan konsentrasi untuk bakteri E.coli

a) Konsentrasi 1 = srikaya (Annona squamosa) 62,5 mg/mL dan jarak merah

(Jatropha gossypifolia) 50 mg/mL

b) Konsentrasi 2 = srikaya (Annona squamosa) 62,5 mg/mL dan jarak merah

(Jatropha gossypifolia) 25 mg/mL

c) Konsentrasi 3 = srikaya (Annona squamosa) 125 mg/mL dan jarak merah

(Jatropha gossypifolia) 25 mg/mL

4.10.1.2 Pembuatan Larutan Uji

Langkah-langkah pembuatan konsentrasi larutan uji, sebagai berikut :

1) Konsentrasi larutan uji untuk bakteri S.aureus

a) Ditimbang EDAS 62,5 mg dan EDJG 50 mg, kemudian ditambahkan

DMSO 10% sebanyak 1 mL pada masing-masing ekstrak sehingga

diperoleh larutan uji konsentrasi 1 dari EDAS 62,5 mg/ml dan EDJG 50

mg/mL.

b) Ditimbang EDAS 62,5 mg dan EDJG 25 mg, kemudian ditambahkan

DMSO 10% sebanyak 1 mL pada masing-masing ekstrak sehingga

diperoleh larutan uji konsentrasi 2 dari EDAS 62,5 mg/ml dan EDJG 25

mg/mL.

c) Ditimbang EDAS 125 mg dan EDJG 25 mg, kemudian ditambahkan

DMSO 10% sebanyak 1 mL pada masing-masing ekstrak sehingga

diperoleh larutan uji konsentrasi 3 dari EDAS 125 mg/mL dan EDJG 25

mg/mL.

2) Konsentrasi larutan uji untuk bakteri E.coli :

a) Ditimbang EDAS 62,5 mg dan EDJG 25 mg, kemudian ditambahkan

DMSO 10% sebanyak 1mL pada masing-masing ekstrak sehingga

41

diperoleh larutan uji konsentrasi 1 dari EDAS 62,5 mg/ml dan EDJG 25

mg/mL.

b) Ditimbang EDAS 62,5 mg dan EDJG 25 mg, kemudian ditambahkan

DMSO 10% sebanyak 1mL pada masing-masing ekstrak sehingga

diperoleh larutan uji konsentrasi 2 dari EDAS 62,5 mg/mL dan EDJG 25

mg/mL.

c) Ditimbang EDAS 125 mg dan EDJG 25 mg, kemudian ditambahkan

DMSO 10% sebanyak 1mL pada masing-masing ekstrak sehingga

diperoleh larutan uji konsentrasi 3 dari EDAS 125 mg/mL dan EDJG 25

mg/mL.

4.10.1.3 Preparasi MediaMueller Hinton Agar

Pada penelitian ini digunakan media yaitu Mueller Hinton Agar (MHA)

dalam pembuatan suspensi bakteri menggunakan aquadest steril dengan

meremajakan bakteri sehari sebelum preparasi. Pembuatan media Mueller Hinton

Agar (MHA) dengan melarutkan bahan sebanyak 38 gram (dengan komposisi :

Beef dehydrate infusion 300 g, Casein hydrolysate 17.5 g, Starch 1.5 g dan Agar

15 g) ke dalam 1 L aquadest pada erlenmeyer dengan kapasitas 1 L. Erlenmeyer

diletakkan diatas hot plate kemudian masukkan magnetic stirer untuk

mempercepat pelarutan sampai didapatkan larutan media menjadi berwarna

kuning jernih. Setelah itu erlenmeyer ditutup dengan aluminium foil kemudian

disterilisasi dengan autoklaf selama 15 menit pada suhu 121ºC. Dituang media

steril ke cawan petri steril secara aseptis di dalam LAF.

4.10.1.4 Preparasi MediaMueller Hinton Broth

Pada proses peremajaan bakteri, pada penelitian ini digunakan media yaitu

Mueller Hinton Broth (MHB). Pembuatan media Mueller Hinton Broth dengan

melarutkan bahan sebanyak 21 gram (dengan komposisi Acid casein pepton (H)

17,50 g, Beef infusion 2 g, dan Corn Starch 1,5 g) ke dalam 1 L aquadest pada

erlenmeyer dengan kapasitas 1 L. Erlenmeyer diletakkan diatas hot plate sampai

media terlarut sempurna. Setelah itu erlenmeyer ditutup dengan alumunium foil

kemudian disterilisasidengan auoklaf selama 15 menit pada suhu 121ºC. Simpan

media pada suhu 2-8 ºC

42

4.10.1.5 Pembuatan Standar Mc Farland

Diambil aquadest kira-kira setengah dari tabung reaksi. Kemudian

tambahkan H2SO4 1% sebanyak 9950 μL dan BaCl2 1% sebanyak 50μL. Campur

kedua larutan dalam tabung tersebut, dikocok sampai homogen dan terbentuk

larutan keruh. Larutan tersebut ini dipakai sebagai pembanding suspensi bakteri

dengan tingkat kekeruhan 108 CFU/mL (Eucast, 2015).

4.10.1.6 Preparasi Bakteri

Proses peremajaan bakteri diperoleh dari biakan murni digoreskan dengan

3-4 ose secara horizontal pada tabung reaksi yang berisi media Mueller Hinton

Broth (MHB). Kemudian diinkubasi selama 24 jam dengan suhu 37ºC, jika perlu

di shaker dengan kecepatan 120 rpm. Setelah diinkubasi selama 24 jam,

bandingkan sediaan dengan standar McFarland dengan tingkat kekeruhan 108

CFU/mL.

Setelah dilakukan perbandingan dengan standar McFarland maka

dilakukan penggoresan pada media MHA yang diambil menggunakan kapas lidi

steril dan digoreskan dengan 3-4 bagian secara horizontal, lalu putar cawan 90º.

Lanjutkan goresan sampai merata dan masukkan cakram uji ke dalam cawan.

Setelah itu, bakteri diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24 jam. Setelah diinkubasi

selama 24 jam, ukur diameter hambat pada cakram.

4.10.1.7 Pewarnaan Bakteri Uji

Perwarnaan bakteri uji yang dilakukan adalah pewarnaan Gram.

Perwarnaan bakteri dilakukan untuk identifikasi dan memastikan tidak ada

kontaminan pada kultur kerja. Pewarnaan bakteri uji dilaksanakan pada tahap

peremajaan bakteri dan pada tahap akhir saat bakteri telah dioleskan pada cawan

yang berisi MHA. Objek kaca yang digunakan dibersihkan dengan alkohol 96%

dan dikeringkan. Kemudian tambahkan aquadest 1 tetes di atas objek kaca, dan

ambil biakan bakteri yang akan dilakukan pewarnaan dengan ose steril (biakan

bakteri yang diambil 1 koloni), kemudian ratakan biakan bakteri di permukaan

objek kaca yang telah berisi aquadest. Kemudian difiksasi dengan api bunsen

(lewatkan di atas api 2-3 kali). Setelah kering, pertama ditetesi dengan pewarna

Crystal Violet kemudian tunggu 1 menit lalu bilas dengan aquadest. Kedua,

ditetesi dengan Lugol dan tunggu 1 menit lalu bilas dengan aquadest. Ketiga, bilas

43

dengan alkohol 96% lalu bilas dengan aquadest. Keempat, ditetesi pewarna

Safranin dan tunggu 1 menit lalu bilas dengan aquadest kemudian keringkan

dengan tisu. Periksa dengan mikroskop (perbesaran 100 x 10), bakteri yang tetap

berwarna ungu digolongkan kedalam bakteri Gram positif. Sedangkan bakteri

Gram negatif juga berwarna ungu tetapi penggunaan Safranin akan mewarnai sel

Gram negatif menjadi berwarna merah, sedangkan Gram positif tidak terpengaruh

(Hafsan et al., 2015; Back, 2001).

4.10.2 Tahap Pengujian

4.10.2.3 Pengujian Penghambatan Pertumbuhan Bakteri Dengan Difusi

Cakram

1. Prosedur pengujian bakteri Staphylococcus aureus secara difusi cakram

dilakukan sebagai berikut:

a) Disiapkan larutan uji masing-masing yang telah dimasukkan ke dalam

eppendorf dengan perbandingan EDAS : EDJG yaitu 62,5 mg/mL : 50

mg/mL; 62,5 mg/mL : 25 mg/mL dan 125 mg/mL : 25 mg/mL.

b) Dilakukan peremajaan bakteri. Dilakukan preparasi media.

c) Disiapkan larutan uji EDAS : EDJG dengan konsentrasi yang telah

ditentukan (konsentrasi 1,2, dan 3) kemudian kertas cakram kosong

diletakkan diatas kaca arloji yang telah berisi kombinasi larutan uji

kemudian ditetesi larutan uji 20 µL dengan pengulangan 5x dan tunggu

sampai meresap.

d) Bakteri yang telah dipreparasi diambil dengan cara mencelupkan kapas lidi

steril satu kali, lalu diletakkan pada tepi tabung reaksi, kemudian kapas lidi

steriil tersebut diputar agar bakteri yang akan dioleskan tidak terlalu banyak,

lalu dioleskan pada permukaan Mueller Hinton Agar (MHA) di cawan petri

kemudian diratakan.

e) Kertas cakram yang telah berisi larutan uji diletakkan diatas

permukaanMueller Hinton Agar (MHA) secara aseptis di dalam Laminar

Air Flow (LAF) yang menyala. Untuk diperoleh kontak yang baik, kertas

cakram dapat ditekan dengan lembut menggunakan pinset pada

permukaannya. Jarak diatur sedemikian rupa sehingga satu cakram dengan

cakram yang lainnya berjauhan. Antibiotik kloramfenikol digunakan

sebagai kontrol positif.

44

f) Selanjutnya diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam.

g) Pengujian senyawa antibakteri dilakukan dengan pengamatan yang

dilakukan setiap 24 jam dengan melihat adanya zona hambat atau area

bening disekitar kertas cakram. Zona hambat yang terbentuk diukur dengan

jangka sorong dalam satuan militer (mm).

h) Dilakukan repikasi sebanyak 3 kali.

2. Prosedur pengujian bakteri Escherichia coli secara difusi cakram dilakukan

sebagai berikut :

a) Disiapkan larutan uji masing-masing yang telah dimasukkan ke dalam

ephendrop dengan perbandingan dosis EDAS : EDJG yaitu 62,5 mg/mL : 50

mg/mL;62,5 mg/mL : 25 dan 125 mg/mL : 25 mg/mL.

b) Dilakukan peremajaan bakteri. Dilakukan preparasi media.

c) Disiapkan larutan uji EDAS dan EDJG dengan konsentrasi yang telah

ditentukan (konsentrasi 1,2, dan 3) kemudian kertas cakram kosong

diletakkan di atas kaca arloji yang telah berisi kombinasi larutan uji

kemudian ditetesi larutan uji sebanyak 20 µL dengan pengulangan 5x dan

tunggu sampai meresap.

d) Bakteri yang telah di preparasi diambil dengan cara mencelupkan kapas lidi

steril satu kali, lalu diletakkan pada tepi tabung reaksi, kemudian kapas lidi

steril tersebut diputar agar bakteri yang akan dioleskan tidak terlalu banyak,

Lalu dioleskan pada permukaan Mueller Hinton Agar (MHA) di cawan petri

kemudian diratakan.

e) Kertas cakram yang telah berisi larutan uji diletakkan diatas permukaan

Mueller Hinton Agar (MHA) secara aseptis di dalam Laminar Air Flow

(LAF) yang menyala. Untuk diperoleh kontak yang baik, kertas cakram

dapat ditekan dengan lembut menggunakan pinset pada permukaannya.

Jarak diatur sedemikian rupa sehingga satu cakram dengan cakram yang

lainnya berjauhan. Antibiotik kloramfenikol digunakan sebagai kontrol

positif.

f) Selanjutnya diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam.

g) Pengujian senyawa antibakteri dilakukan dengan pengamatan yang

dilakukan setiap 24 jam dengan melihat adanya zona hambat atau area

45

bening disekitar kertas cakram. Zona hambat yang terbentuk diukur dengan

penggaris dalam satuan militer (mm).

h) Dilakukan replikasi sebanyak 3 kali

4.11 Analisis Data

Analisis data dilakukan secara deskriptif dengan melakukan pengamatan

terhadap pengukuran diameter zona hambat daerah berwarna bening dari masing-

nmasing konsentrasi pada kombinasi EDAS dan EDJG terhadap bakteri

Staphylococcus aureus dan Escherichia coli dengan menggunakan jangka sorong.

Daerah berwarna bening disekitar kertas cakram diukur menggunakan jangka

sorong dengan mengukur diameter. Hasil pengukuran tersebut merupakan

diameter zona hambat dari kombinasi EDAS dan EDJG terhadap bakteri

Staphylococcus aureus dan Escherichia coli.

Gambar 4. 2 Bagan Prosedur Pengujian Antibakteri dengan Metode

Difusi Cakram

Konsentrasi 1

Konsentrasi 3

Kontrol negatif Aqua +

DMSO 10%

Konsentrasi 2

Kontrol positif

kloramfenikol 30µg

Jarak cakram dengan tepi

plate tidak kurang dari 1,5

cm dan jarak antar cakram

tidakkurang dari 2,5 cm

Cawan petri yang berisi bakteri S. Aureus, E. coli dan media

Diinkubasi selama 18-24 jam, kemudian diukur zona hambat

Dilakukan replikasi sebanyak tiga kali

pada masing-masing konsentrasi ekstrak

yang diuji