BAB III

METODE KERJA

A. Alat dan Bahan

1. Alat Yang Digunakan

Aerator, batang pengaduk,, botol semprot, bunsen, corong buchner, corong

pisah, chamber, cawan porselen, eksikator, erlenmeyer, gelas ukur, gunting,

hairdryer, karet gelang, kardus, kotak makan plastik, lampu UV 256 nm dan 366 nm,

kipas angin, lampu belajar, lempeng kaca, lumpang dan alu, mangkuk kaca,

mikroskop, mikropipet, neraca analitik, objek glass, oven, ose bulat, parang, pensil,

pisau, pipet tetes, pipet skala, pinset, penutup chamber, pipa kapiler, pensil warna,

penggaris, pompa vakum, rak tabung, sendok tanduk, sendok besi, sikat tabung, statif

dan klem, spoit, sentrifuge, seperangkat alat rotavapor, tabung sentrifuge, tabung

effendorf, tali raffia, topleks kaca, vial, dan vortex.

2. Bahan yang digunakan

Air laut, air suling, aluminium foil, bulu babi, etanol, etil asetat, F eCl3,

formalin, n-heksan, H2SO4 10%, HCl, KCl 10%, kloroform, kapas, kertas saring,

larva Artemia salina, lempeng silica, metanol, metanol PA, n-butanol, NaCl, reagen

Dragendorff, reagen Lieberman-Burchard, reagen Mayer, reagen Wagner, dan sampel

daun coppeng.

B. Penyiapan Sampel

1. Pengambilan Sampel

Pengambilan sampel dilaksanakan pada hari minggu, tanggal 21 september

2014. bertempat di hutan Desa Compo Tompong, Kecamatan Mandalle, Kabupaten

Pangkep Sulawesi Selatan pada pukul 7:30 wita sampai selesai. Pengambilan sampel

ini dilakukan dengan cara mengambil daun dari tanaman coppeng.

2. Pengolahan Sampel

Sampel daun coppeng yang telah dikumpulkan dicuci hingga bersih dengan

air mengalir yang bertujuan untuk membersihkan sampel dari sisa-sisa tanak atau

kotoran yang melekat dan dikeringkan karena sampel yang basah sangat rentan

terhadap pertumbuhan mikroba juga untuk memperoleh simplisia yang dapat

disimpan lebih lama, tidak dibawah sinar matahari langsung atau bisa juga dioven,

kemudian dipotong kecil-kecil, selanjutnya diangin-anginkan dalam ruangan dan

hindarkan dari sinar matahari langsung. Setelah kering dihaluskan hingga derajat

halus yang diinginkan dengan menggunakan lumpang dan alu kemudian ditimbang

ekstrak yang didapat.

C. Ekstraksi Sampel

1. Maserasi

Sampel yang telah ditimbang dan dirajang masukkan dalam topleks kaca

kemudian dibasahi dengan menggunakan methanol. Setelah itu tambahkan methanol

untuk merendam simplisia dimana cairan penyari dicukupkan hingga merendam

semua simplisia sekitar 1 cm dari batas simplisia, lalu ditutup dengan aluminium foil

dan diamkan selama 2 x 24 jam. Kemudian sampel disaring dengan menggunkan

corong dan kertas saring, hasilnya disimpan dalam topleks lalu selanjutnya lakukan

proses rotavapor kurang lebih 6 jam, supaya proses rotavapor cepat dapat dilakukan

dengan menggunakan es batu untuk mempercepat proses penguapan yaitu dibawah

titik didih sampel. Hasil dari rotavapor disimpan dalam mangkuk dan disimpan diatas

penangas untuk mempercepat proses penguapan, lalu ditutup dengan aluminium foil.

2. Partisi

Ekstrak hasil rotavapor dimangkuk dikeruk lalu ditimbang dan letakkan dalam

lumpang sambil digerus dan tambahkan pelarut heksan, setelah itu dipipet cairan

ekstrak kedalam tabung sentrifuge dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit.

Sampel yang telah disentrifuge disimpan dalam mangkuk kemudian diangin-

anginkan, lakukan perlakuan yang sama hingga ekstrak yang dihasilkan menjadi

jenuh.

D. Identifikasi dengan KLT(Kromatografi Lapis Tipis)

1. Penjenuhan Chamber

Chamber yang telah diisi eluen dengan kepolaran dan perbandingan yang

berbeda, dikocok hinggan pelarut dalam chamber jenuh. Cairan pengelusi yang

digunakan dimasukkan ke dalam chamber setinggi lebih kurang 0,5 cm kemudian

diberi kertas. Kejenuhan chamber ditandai dengan naiknya cairan pengelusi pada

kertas saring hingga melewati kaca penutup.

2. Penotolan Sampel pada Lempeng

Ekstrak metanol dari masing-masing sampel ditotolkan pada lempeng pada

batas bawahnya, demikian pula untuk ekstrak n-heksan dan n-butanol (tidak larut n-

heksan). Lempeng dielusi dengan heksan : etil (2 : 1) dalam chamber, sampai cairan

pengelusi mengelusi lempeng sampai batas akhir. Lempeng dikeluarkan dan diangin-

anginkan, lempeng siap untuk diamati penampakan nodanya.

3. Penampakan Noda pada Lampu UV 254 nm dan UV 366 nm

Lempeng yang telah dielusi diamati dibawah sinar lampu UV 254 nm dan 366

nm, lalu diamati noda yang terbentuk pada lempeng.

4. Penampakan Noda dengan H2SO4 10%

Setelah diamati di bawah lampu UV, lempeng disemprot dengan larutan

H2SO4 10%, kemudian dipanaskan di dalam oven selama beberapa menit, hingga

terbentuk noda. Lalu diamati noda yang terbentuk pada lempeng.

E. Identifikasi Komponen Kimia

Ekstrak methanol dilarutkan dengan kloroform dan methanol, ekstrak n-

heksan dilarutkan dengan kloroform dan tidak larut heksan dengan methanol masing-

masing dalam vial, lalu divortex setelah itu ditotol pada lempeng KLT yang telah

diaktifkan dan jenuhkan pada chamber. Setelah itu lakukan uji :

1. Alkaloid

Diambil lempeng ekstrak methanol, ekstrak larut etil asetat dan ekstrak tidak

larut etil asetat yang telah dielusi. Disemprot dengan reagen dragendrof. Diamati

perubahan warna dan diambil gambarnya. Hasil (+) ditandai dengan perubahan warna

hingga latar kuning

2. Flavonoid

Diambil lempeng ekstrak methanol, ekstrak larut etil asetat dan ekstrak tidak

larut etil asetat yang telah dielusi. Disemprot dengan AlCl3 5%. Diamati pada lampu

UV 366 nm penampakan nodanya. Hasil (+) ditandai dengan adanya flouresensi

kuning.

3. Fenol

Diambil lempeng ekstrak methanol, ekstrak larut etil asetat dan ekstrak tidak

larut etil asetat yang telah dielusi. Disemprot dengan FeCl3 5%. Difoto penampakan

noda. Hasil (+) fenol ditandai dengan adanya perubahan warna hitam/biru.

4. Uji LB

Diambil lempeng ekstrak methanol, ekstrak larut etil asetat dan ekstrak tidak

larut etil asetat yang telah dielusi. Disemprot dengan reagen LB. Difoto penampakan

noda. Dipanaskan lempeng pada oven. Diamati pada lampu UV 366 nm penampakan

nodanya. Hasil (+) terpenoid yaitu perubahan merah/coklat, hasil (+) steroid yaitu

perubahan hijau biru.

5. Senyawa Organik

Diambil lempeng ekstrak methanol, ekstrak larut etil asetat dan ekstrak tidak

larut etil asetat yang telah dielusi. Disemprot dengan H2SO4. Difoto penampakan

noda. Dipanaskan lempeng pada oven Difoto penampakan noda. Hasil (+) ditujukan

dengan perubahan arna kuning, coklat/ kehitaman.

F. Uji Bioassay

1. Skrining Aktifitas Antimikroba

a. Pembuatan medium

Disiapkan alat dan bahan. Ditimbang medium dengan menggunakan

timbangan analitik. Dilarutkan dengan aquadest. Dipanaskan hingga larut di atas

penangas untuk menghilangkan sifat agar dari medium hingga berwujud cair.

Disterilakn agar tidak terkontaminasi oleh mikroba.

b. Sterilisasi Alat

Disiapkan alat dan bahan yang akan disterilkan. Dibungkus semua alat

menggunakan kertas. Alat berupa kaca disterilkan dngan menggunakan oven pada

suhu 1800C sedangkan alat bahan dasar plastic disterilkan dalam autoklaf pada suhu

1210C. Ditunggu ± 1-2 jam

c. Skrinning antimikroba

Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan. Ditimbang sampel ekstrak

methanol, ekstrak larut etil asetat dan ekstrak tidak larut etil asetat sebanyak 10 mg

masing-mmasing 3 kali. Dimasukkan ke dalam botol coklat yang telah disterilkan

sebelumnya. Ditambahkan DMSO 200 mikroliter kemudian di vortex hingga larut.

Ditambahkan medium NA 10 ml ke dalam botool coklat yang berisi sampel dan

DMSO kemudian dihomogenkan. Dipindahkan ke dalam cawan petri yang telah

disterilkan. Didiamkan hingga medium padat. Diberi tanda pada bagian bawah cawan

petri (dibagi dalam beberapa bagian). Digoreskan bakteri pada masing-masing

bagiannya. Diinkubasi 1x24 jam dalam incubator. Diambil gambar yang diperoleh

dengan menggunakan kamera. Dikerjakan pengerjaan di atas dengan cara aseptis.

2. Uji Brain Shrimp Lethality Test (BST)

a. Penyiapan air bebas protozoa

Disiapkan alat dan bahan. Ditimbang garam tak beryodium sebanyak 37 gr.

Diukur aqquadest sebanyak 1 liter. Dimasukkan aquadest ke dalam toples kemudian

ditambahkan garam yang telah ditimbang. Diaduk hingga garam terlarut dengan

sempurna. Disaring air garam menggunakan kertas saring

b. Penyiapan konsentrasi ekstrak (stok)

Disiapkan alat dan bahan. Ditarer vial sebanyak 5 ml dan diberi tanda.

Ditimbang ekstrak sebanyak 30 mg (ekstrak methanol, ekstrak n-heksan dan ekstrak

n-butanol). Dimasukkan ke dalam vial dan ditambahkan pelarut yang sesuai. Divortex

hingga larut. Larutan stok siap digunakan

c. Penyiapan konsentrasi ekstrak

Disiapkan alat dan bahan. Ditarer vial 5 ml sebanyak 60 vial. Untuk ekstrak

methanol diambil 5 vial untuk konsentrasi [1000] ppm, 5 vial untuk konsentrasi [100]

ppm, 5 vial untuk konsentrasi [10] ppm.Untuk ekstrak larut n-heksan diambil 5 vial

untuk konsentrasi [1000] ppm, 5 vial untuk konsentrasi [100] ppm, 5 vial untuk

konsentrasi [10] ppm.Untuk ekstrak tidak n-heksan diambil 5 vial untuk konsentrasi

[1000] ppm, 5 vial untuk konsentrasi [100] ppm, 5 vial untuk konsentrasi [10]

ppm.Untuk kontrol (methanol, larut n-heksan dan tidak larut n-heksan) diambil 5 vial

untuk konsentrasi [1000] ppm, 5 vial untuk konsentrasi [100] ppm, 5 vial untuk

konsentrasi [10] ppm.Untuk memindahkan digunakan mikropipet 10 mikroliter, 50

mikroliter dan 100 mikroliter yang sesuai dengan konsentrasi yang digunakan

d. Penyiapan larva udang

Disiapkan alat dan bahan. Direndam larva udang dalam air. Diambil bagian

tenggelam. Disiapkan toples yang telah berisi plastic gula dan air laut bebas protozoa.

Dimasukkan larva udang yang telah direndam dalam air. Dimasukkan aerator di

dalam air laut bebas protozoa yang berisi larva udang. Disinari di bawah lmpu

belajar. Ditunggu hingga menetas. Disiapkan wadah makanan yang bersekat dan

telah diberi lobang-lobang kecil. Dimasukkan air laut bebas protozoa. Dimasukkan

larva udang yang telah menetas ke dalam salah satu bagian wadah kemudian tutup

menggunakan lakban hitam. Disinari di bawah lampu belajar. Diambil larva udang

yang tidak ditutupi lakban

e. Pemindahan larva udang

Disiapkan alat dan bahan. Ditambahkan air laut bebas protozoa 1 ml pada

masing-msing vial. Ditambahkan larva udang sebanyak 10 ekor pada masing-masing

vial. Ditambahkan air laut bebas protozoa hingga 5 ml pada masing-masing vial.

Setelah itu vial tersebut disinari pada sianr lampu belajar 1x24 jam. Diamati jumlah

kematian larva udang pada masing-masing vial.

3. Uji Antimitosis

a. Pembuatan konsentrasi ekstrak

Timbang 10 mg ekstrak methanol, masukkan dalam vial dan tambahkan 1 ml

DMSO setelah itu homogenkan dengan cara di vortex, maka diperoleh larutan stok

10.000 ppm. Dibuat pengenceran 1000 ppm dalam 1000 µl dengan cara diambil 100

µl larutan stok lalu tambahkan 800 µl air laut bebas protozoa dan homogenkan, untuk

pengenceran 100 ppm dalam 100 µl dengan cara diambil 100 µl larutan stok lalu

tambahkan 890 µl air laut bebas protozoa dan homogenkan, dan pada pengenceran

10 ppm dalam 1 µl dilakukan perlakuan yang sama yaitu dengan mengambil 100 µl

larutan stok lalu tambahkan 899 µl air laut bebas protozoa dan homogenkan.

b. Pembuatan zigot

Diambil bulu babi jantan lalu di induksi dengan KCl 10 % , di ambil sperma

sebanyak 1 ml dan untuk bulu babi betina juga di induksi dengan KCl 10 %,

kemudian di ambil ovum sebanyak 5 ml, lalu keduanya digabungkan dalam

Erlenmeyer dan simpan di dinginkan di kulkas selama 10-15 menit, setelah itu di

amati di mikroskop, dan jika telah terbuahi menjadi zigot maka siap untuk dilakukan

pengamatan selanjutnya.

c. Uji Antimitosis

Diambil ekstrak methanol, ekstrak heksan dan ekstrak tidak larut heksan, lalu

dibuat stok 1000 ppm, 100 ppm, 10 ppm masing-masing tiga replikasi, setelah itu

simpan di tabung effendorf, tambahkan Masukkan 100 µl zigot, kemudian diamkan

1-2 jam dalam suhu ruang atau es batu dan di amati di mikroskop.

G. Isolasi Sampel

1. Penyiapan Sampel dan Adsorben

a. Kromatografi Cair Vakum (KCV)

Disiapkan alat dan bahan. Ditimbang ekstrak methanol sebanyak 3 gr dan

silika gell sebanyak 25 g. Dicampur silika gel ke dalam ekstrak methanol secara

sedikit demi sdikit sambil digerus hingga kering dengan menggunakan tabung reaksi.

Dimasukkan sisa silika ke dalam centre glass sambil dimapatkan. Dimasukkan

camppuran silica dan ekstrak methanol ke dalam centre glass yang berisi silika gel

kemudian diberi kertas saring.

b. Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLTP)

Disiapkan alat dan bahan. Lempeng kaca dibebaslemakkan dengan

menggunakan methanol kemudian dikeringkan. Dibuat bubur silika dengan

mencampurkan silika gel dan aquadest (30 gr silika : 90 ml aquadest) dalam

Erlenmeyer dan dihomogenkan. Dituang bubur silika di atas lempeng kaca yang telah

dibebaslemakkan dan diratakan .Diamkan 1x24 jam.

2. Isolasi Komponen Kimia

a. KCV (Kromatografi Cair Vakum)

Disiapkan alat dan bahan. Dibuat 18 eluen yaitu; Heksan 50 ml, Heksan : etil

(10 : 1), Heksan : etil (8 : 1), Heksan : etil (6 : 1), Heksan : etil (4 : 1), Heksan : etil

(2 : 1), Heksan : etil (1 : 1), Heksan : etil (1 : 2) , Heksan : etil (1 : 4), Heksan : etil

(1 : 6), Heksan : etil (1 : 8), Heksan : etil (1 : 10), Etil 50 ml, Etil : methanol (4 : 1),

Etil : methanol (2 : 1), Etil : methanol (1 : 1), Etil : methanol (1 : 2), Etil : methanol

(1 : 4), dan methanol 50 ml. Dimasukkan ke dalam corong sesuai dengan

perbandingan sedikit demi sedikit. Ditunggu hingga selesai kemudian dimasukkan

perbandingan berikutnya hingga seluruh perbandingan selesai. Hasilnya ditampung di

mangkuk untuk setiap perbandingan yang berbeda.

Hasil dari KCV sebanyak 18 mangkuk setelah kering dilarutkan dengan etil

asetat lalu ditotolkan pada lempeng KLT yang telah diaktifkan. Kemudian

dimasukkan dalam oven lalu diamati penampakan nodanya pada UV 254 nm dan UV

366 nm serta disemprot dengan larutan H2SO4 10%, panaskan dioven da amati

penampakan nodanya.

b. KLTP (Kromatografi Lapis Tipis Preparatif)

Diambil ekstrak dari 7 hasil KCV sebelumnya. Dimasukkan ke dalam vial lalu

dilarutkan menggunakan etil asetat hingga larut. Disiapkan alat dan bahan, lalu

lempeng kaca yang telah diaktifkan selama dua jam diambil, kemudian ditotol

meggunakan pipa kapiler dengan berdekatan secara perlahan. Sementara itu

dijenuhkan chamber dengan menggunakan perbandingan eluen heksan : etil (2 : 1)

dalam 40 ml. Dimasukkan lempeng kaca dengan hati-hati ke dalam chamber.

Ditunggu hingga noda mencapai batas. Diangkat lempeng kaca. Diamati lempeng

pada UV 366 nm dan 254 nm, serta disemprot dengan larutan H2SO4 10%, panaskan

dioven da amati penampakan nodanya.

Hasil KLTP dari ketiga lempeng kaca yang telah ditotol dan dipanaskan

dalam oven kemudian dikruk dan disimpan dalam mangkuk lalu ditambahkan

methanol PA secukupnya. kemudian masukkan dalam pipet tetes yang dijepit dengan

klem. Dimasukkan sedikit kapas pada pipet tetes. Dimasukkan sedikit demi sedikit ke

dalam pipet tetes. Diteteskan menggunakan buret pipet atau karet pipet tetes

ditampung dalam vial yang telah ditarer sebelumnya .Dibiarkan pelarutnya menguap

kemudian ditimbang berat vial + isolate.

H. Uji Kemurnian Isolat

1. Kromatografi Lapis Tipis Dua Dimensi

Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan. Disediakan lempeng

aluminiumukuran 10 x 10 cm.Diberi batas masing-masing ujung baah jarak 1 cm dan

ujung atas 0,5 cm menggunakan pensil. Lalu ditotolkan isolate yang dipilih dan

dipakai pada pengujian multi eluen dengan menggunkan pipa kapiler secra berulang-

ulang agar pekat. Dielusi lempeng dalam chamber yang berisi eluen dengan

perbandingan pelarut heksan : etil (1 : 2). Dielusi hingga batas atas. Setelah dielusi,

diperiksa penampakan noda pada sinar UV 366 nm. Setelah penampakan noda (+)

dan noda berada berada di bagian atas lempeng maka diputar/balik dimana bagian

awwal yang dielusi adalah bagian yang paling dekat bagian bawahnya penampakan

nodanya dengan pelarut/eluen untuk mengelusi kembali noda dengan pelarut/eluen

yang sama dengan elusi pertama. Dimasukkan kembali lemepng ke chamber untuk

dielusi. Setelah mencapai batas atas yang ditentukan lalu dilihat penampakan nod

pada sinar UV 366 nm. Diambil gambarnya. Disemprot dengan H2SO4. Dipanaskan

lempeng pada oven. Diperiksa kembali penampakan noda secara kasat mata. (+)

penampakan noda 2 tunggal pada 2 kali elusi menandakan kekurangan senyawa.

Diambil gambar

2. Kromatografi Lapis Tipis Multi Eluen

Disiapkan alat dan bahan. Disediakan beberapa lempeng pada masing-masing

lempeng untuk menandakan batas penotolan dan batas akhir eluen yaitu pada ujung

bawah (batas penotolan jarak 1 cm sedangkan ujung atas (batas akhir lempeng)

jaraknya 0,5 cm dengan pensil). Diaktifkan lempeng di dalam oven selama 5 menit.

Dipilih ekstrak hasil KLT Preparatif sebelumnya yang diyakini nodanya paling

bagus/tunggal. Dilarutkan ekstrak dengan pelarut yang sesuai. Divortex hingga larut.

Dikeluarkan lempeng yang telah diaktifkan sebelumnya. Ditotolkan ekstrak yang

telah dilarutkan dengan menggunakan pipa kapiker beberapa kali pada lmpeng.

Dielusi lempeng yang telah ditotolkan pada chamber dengan menggunakan beberapa

eluen yang berbeda yaitu eluen heksan : etil : methanol (1 : 3 : 1), etil : metano (3 : 1),

dan heksa : etil (1 : 5) . Dielusi setetlah beberapa saat kemudian hingga pelarut

sampai batas yang telah ditentukan. Setelah mencapai batas diperiksa lempeng hasil

elusi pada sinar UV 366 nm. Diambil gambarnya. Disemprot dengan menggunkan

H2SO4. Dipanaskan dalam oven. Diperiksa kembali penampakan noda secara kasat

mata. Diambil gambarnya

3. Rekristalisasi

a. Metode pemanasan

Disiapkan alat dan bahan. Diambil isolate dan ditambahkan methanol PA

secukupnya. Dipanaskan pada hot plate hingga pelarutnya menguap. Diamati kristal

yang terbentuk di dasar vial. Ditimbang berat kristal yang diperoleh

b. Metode pendinginan

Disiapkan alat dan bahan. Diambil isolate dan ditambahkan methanol PA

secukupnya. Diambil mangkuk kaca yang telah diisi dengan es batu. Dimasukkan vial

yang berisi isolate dan methanol PA ke dalam mangkuk yang telah diisi es batu.

Diaduk dinding vial dengan sendok besi. Dibentuk kristal yang terbentuk. Ditimbang

bobot kristal yang diperoleh

4. Identifikasi Golongan Kimia

Hasil isolat yang didapat setelah didiamkan dan ditambahkan dengan

methanol PA, lalu ditotolkan pada lempeng KLT yang telah diaktifkan lalu dilakukan

uji :

a. Alkaloid

Diambil lempeng ekstrak methanol, ekstrak n-heksan dan ekstrak tidak larut

n-heksan yang telah dielusi. Disemprot dengan reagen dragendrof. Diamati perubahan

warna dan diambil gambarnya. Hasil (+) ditandai dengan perubahan warna hingga

latar kuning

b. Flavonoid

Diambil lempeng ekstrak methanol, ekstrak larut n-heksan dan ekstrak tidak

larut n-heksan yang telah dielusi. Disemprot dengan AlCl3 5%. Diamati pada lampu

UV 366 nm penampakan nodanya. Hasil (+) ditandai dengan adanya flouresensi

kuning.

c. Fenol

Diambil lempeng ekstrak methanol, ekstrak larut n-heksan dan ekstrak tidak

larut n-heksan yang telah dielusi. Disemprot dengan FeCl3 5%. Difoto penampakan

noda. Hasil (+) fenol ditandai dengan adanya perubahan warna hitam/biru.

d. Uji LB

Diambil lempeng ekstrak methanol, ekstrak larut n-heksan dan ekstrak tidak

larut n-heksan yang telah dielusi. Disemprot dengan reagen LB. Difoto penampakan

noda. Dipanaskan lempeng pada oven. Diamati pada lampu UV 366 nm penampakan

nodanya. Hasil (+) terpenoid yaitu perubahan merah/coklat, hasil (+) steroid yaitu

perubahan hijau biru.

e. Senyawa Organik

Diambil lempeng ekstrak methanol, ekstrak larut n-heksan dan ekstrak tidak

larut n-heksan yang telah dielusi. Disemprot dengan H2SO4. Difoto penampakan noda.

Dipanaskan lempeng pada oven Difoto penampakan noda. Hasil (+) ditujukan dengan

perubahan warna kuning, coklat/ kehitaman.