20

BAB III

BAHAN DAN METODE

3.1 Tempat dan Waktu

Penelitiantelah dilaksanakan mulai Februari 2013 sampai dengan Juni

2013. Pengambilan sampel lamun Enhalus acoroides dan Thalassia hemprichii

dilakukan pada bulan Februari 2013 di Perairan Pulau Pramuka Kepulauan Seribu

DKI Jakarta. Identifikasi metabolit sekunder dan ekstraksi dilakukan di

Laboratorium Bioteknologi Perikanan dan Ilmu Kelautan, Fakultas Perikanan dan

Ilmu Kelautan (FPIK) Universitas Padjadjaran (Unpad). Uji aktivitas antioksidan

dan Uji Total Kadar Polifenol dilakukan di Laboratorium Penelitian dan

Pelayanan Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

(FMIPA), Unpad. Sedangkan Uji Peroksida dilakukan di Laboratorium Kimia

Analitik, Jurusan Kimia, FMIPA Unpad.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat

Tabel 1. Alat dan KegunaannyaNO Alat Kegunaan

1 Global Positioning System

(GPS)

Untuk menentukan titik pengambilan sampel

2 Termometer Untuk mengukur suhu perairan sampel

3 Refraktometer Untuk mengukur salinitas perairan sampel

4 pH meter Untuk mengukur pH perairan sampel

5 Kotak Styroform Untuk menyimpan sampel selama perjalanan

6 Kantong plastik Untuk menyimpan sampel

7 Gunting Untuk memotong sampel

8 Pisau Untuk mencacah sampel

9 Talenan Untuk tempat alas saat proses pencacahan sampel

10 Blender Untuk menghaluskan sampel menjadi serbuk

11 Kertas label Untuk memberi tanda

12 Pipet tetes Untuk mengambil cairan kimia

13 Pipet volum Untuk mengambil cairan kimia

14 Tabung reaksi Untuk tempat terjadinya reaksi/pencampuran

21

Tabel 1 (lanjutan). Alat dan KegunaannyaNO Alat Kegunaan

15 Kaca arloji Untuk tempat meneteskan cairan uji

16 Penangas air Untuk memanaskan

17 Alumunium Foil Untuk menutup gelas ukur/erlenmeyer

18 Erlenmeyer Untuk maserasi

19 Gelas kimia Untuk maserasi

20 Gelas ukur Untuk mengukur volume pelarut

21 Timbangan analitik Untuk mengukur berat padatan

22 Spatula Untuk mengambil padatan

23 Orbital shaker Untuk pengadukan saat maserasi

24 Kertas saring Untuk memisahkan filtrat dan residu

25 Rotatory evaporator Untuk menguapkan pelarut

26 Botol vial Untuk menyimpan ekstrak pekat

27 Mikropipet Untuk mengambil cairan kimia dalam jumlah kecil

28 Magnetic stirrer Untuk menghomogenkan larutan

29 Spektrofotometri UV-vis Untuk mengukur serapan/absorbansi

30 Buret Untuk titrasi

31 Inkubator Untuk mempercepat oksidasi

3.2.2 Bahan

Tabel 2. Bahan yang digunakanNo Bahan No Bahan

1 Sampel daun, rimpang,, akar, buah,

bunga, lamun

13 H2SO4

Uji Fitokimia dan Ekstraksi 14 NaOH 10%

2 Pereaksi meyer 15 Etanol 70%

3 Pereaksi wagner 16 FeCl3 5%

4 Serbuk magnesium 17 Es Batu

5 Amil alcohol 18 Amil alkohol

6 Kloroform Uji Aktivitas Antioksidan

7 Metanol 19 Vitamin C (Asam askorbat)

8 Akuades 20 Kristal 2,2–difenil-2-pikrihidrazil (DPPH)

9 Asetat Anhidrida Uji Total Kadar Polifenol

10 Asam sulfat pekat 21 Asam Galat

11 Air panas 22 Na2CO3 5%

12 HCl 2N 23 Follin Ciocalteau 50%

22

Tabel 2 (Lanjutan). Bahan yang digunakanNo Bahan No Bahan

Uji Bilangan Peroksida

24 Minyak Ikan, Minyak Nabati 27 Kalium Iodida

25 Cairan Tween 20 28 Indikator pati 1%

26 Asam asetat glasial 29 Natrium tiosulfat 0,1 N

3.3 Metode Penelitian

Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode observasi

dengan melakukan eksperimen di laboratorium menggunakan faktor perbedaan

konsentrasi ekstrak. Penelitian ini meliputi identifikasi metabolit sekunder,

ekstraksi, uji aktivitas antioksidan, uji total kadar polifenol, dan uji bilangan

peroksida.

Identifikasi kandungan metabolit sekunder menggunakan uji kualitatif

fitokimia dengan prinsip reaksi warna, pengendapan, serta pembentukan busa

(Harborne 1987). Ekstraksi menggunakan metode maserasi (Quinn 1998 dalam

Agustiningrum 2004) yaitu perendaman sampel berulang dengan menggunakan

pelarut sampai tidak berwarna lagi, prinsipnya adalah proses difusi karena

perbedaan konsentrasi di luar dan di dalam sel. Uji aktivitas antioksidan

menggunakan metode DPPH (Blois 1958 dalam Molyneux 2004) pada berbagai

konsentrasi sampel serta menggunakan Vitamin C sebagai pembanding dengan

prinsip penyerapan hidrogen oleh radikal bebas dari antioksidan ditunjukkan

dengan nilai absorbansi dengan menggunakan spektrofotometer. Uji total kadar

polifenol menggunakan metode total phenolic content (TPC) folin-ciocalteu

dengan prinsip reaksi oksidasi dan reduksi kolorimetrik untuk mengukur semua

senyawa fenolik dalam sampel uji (Singleton dan Rossi 1965). Uji bilangan

peroksida menggunakan prinsip oksidasi-reduksi pengurangan bilangan peroksida

pada emulsi minyak yang telah ditambahkan sampel dengan cara titrasi iodometri

(Santoso et al. 2003 dalam Prabowo 2009).

23

3.4 Prosedur Penelitian

3.4.1 Pengambilan dan Persiapan Sampel

Bahan lamun Enhalus acoroides dan Thalassia hemprichii diambil dari

lapangan secara lengkap mulai dari ujung akar sampai ujung daun, lalu dibawa ke

laboratorium. Setelah itu bagian-bagian dari tegakan yaitu daun, rimpang, akar,

bunga, daging buah, dan biji dipotong serta dipisahkan dengan menggunakan

gunting. Kemudian dicuci dan dikeringkan dengan cara diangin-anginkan.

Selanjutnya setiap bagian yang telah dipisahkan dipotong kecil/ dicacah dengan

menggunakan gunting untuk kemudian dihaluskan dengan menggunakan blender

sampai menjadi serbuk.

3.4.2 Identifikasi Metabolit Sekunder (Harborne 1987)

a. Alkaloid

Serbuk sampelditimbang sebanyak 1 g, kemudian dilarutkan dalam

kloroform, dan ditambahkan beberapa tetes amonia (NH4OH).Larutan ekstrak

disaring dalam tabung reaksi tertutup, Ekstrak kloroform dalam tabung reaksi

dikocok dengan 10 tetes H2SO4 2M, ditambahkan pereaksi 2 tetes pereaksi Meyer

dan pereaksi Wagner. Perubahan ada tidaknya endapan diamati.

b. Flavonoid

Sampel serbuk 1 g diekstraksi dengan menggunakan metanol kemudian

dibagi menjadi tiga tabung reaksi. Tabung pertama ditambahkan Amil alkohol,

HCl pekat 2 tetes kemudian ditambah 0,1 g Mg serbuk. Tabung reaksi kedua

ditambahkan H2SO4 2N sebanyak 2 tetes.Tabung terakhir ditambahkan NaOH

10% sebanyak 2 tetes.Ketiga tabung dikocok kuat. Perubahan warna diamati.

c. Steroid/Triterpenoid

Sebanyak 1 g sampel diekstraksi dengan menggunakan kloroform,

disaring. Kemudian diteteskan ke dalam kaca arloji dan dibiarkan kering.

Kemudian ditambahkan pereaksi Lieberman Burchad yaitu satu tetes asam asetat

anhidrida dan satu tetes asam sulfat pekat. Perubahan warna diamati.

24

d. Fenol hidroquinon

Sebanyak 1 g serbuk sampel dilarutkan dalam 20 ml etanol 70%, setelah

dikocok kemudian diambil 1 ml, selanjutnya ditambahkan2 tetes pereaksi

FeCl35%. Perubahan warna diamati.

e. Saponin

Sebanyak 1 gserbuk sampel dimasukan dalam erlenmeyer, ditambahkan 10

ml air panas, didihkan selama 5 menit, kemudian disaring dalam keadaan panas,

larutan diambil sebanyak 10 ml kemudian dikocok kuat secara vertikal selama 10

detik. Pembentukan busa diamati.

f. Tanin

Sebanyak 1 gserbuk sampel ditambahkan air, dididihkan selama beberapa

menit dan saring, diambil 2ml hasil penyaringan (filtrat) dan ditambahkan 1

sampai 2 tetes pereaksi FeCl35 %. Perubahan warna diamati.

3.4.3 Ekstraksi (Quinn 1998 dalam Agustiningrum 2004)

Tujuan dilakukan ekstraksi iniadalah untuk mengambil atau mendapatkan

senyawa metabolit sekunder yang terkandung di dalam tegakan lamun. Bagian-

bagian sampel lamun (daun, rimpang, akar, bunga, daging buah, serta biji) yang

telah dihaluskan kemudian ditimbang sebanyak 40 g dan direndam dengan pelarut

metanol sebanyak 400 ml selama 3 x 24 jam. Hasil maserasi yang berupa larutan

kemudian disaring dengan kertas saring sehingga didapat filtrat dan residu. Filtrat

yang diperoleh di evaporasi hingga diperoleh ekstrak pekat dengan menggunakan

Rotatory evaporator pada suhu 40C-50C. Sedangkan pada residu dilakukan

pengulangan perendaman sampai tidak berwarna lagi. Dari proses ini maka

diperoleh ekstrak pekat metanol daun, rimpang, akar bunga, daging buah, serta

biji.

3.4.4 Uji Aktivitas Antioksidan (Blois 1958 dalam Molyneux 2004)

Berdasarkan penelitian Putri (2011) dan Rumiantin (2011) yang dijadikan

sebagai acuan, maka ekstrak pekat dari bagian-bagian lamun hasil ekstraksi

menggunakan pelarut metanol dilarutkan dalam metanol dengan berbagai

25

konsentrasi, dengan membuat larutan stok terlebih dahulu (Lampiran 3). Sebagai

pembanding dan kontrol positif, digunakan antioksidan yang biasa digunakan

masyarakat yaitu Vitamin C yang dibuat dengan cara dilarutkan dalam pelarut

metanol dengan konsentrasi 0,25, 0,5, 1, 2 dan 4 ppm. Larutan DPPH 160 ppm

dibuat denganmelarutkan 1,6 mgDPPH dengan pelarut metanol sebanyak 10 ml.

Proses pembuatan larutan DPPH dilakukan dalam kondisi suhu rendah dan

terlindung dari sinar matahari.

Larutan ekstrak dan larutan antioksidan pembanding (kontrol positif)yang

telah dibuat masing-masing diambil 4,5 ml dan direaksikan dengan 500 μl larutan

DPPH dalam tabung reaksi yang berbeda serta diberi label. Larutan blanko

sebagai kontrol negatif juga dibuat dengan melarutkan 500μl larutan DPPH

ditambahkan metanol 4,5 ml. Larutan tersebut kemudian diinkubasi pada suhu

37C selama 30 menit dan diukur absorbansinya dengan menggunakan

spektrofotometer pada panjang gelombang 515 nm.

3.4.5 Uji Total Kadar Polifenol (Singleton dan Rossi 1965)

Ekstrak lamun masing-masing sampel sebanyak 5 mg dilarutkan dengan 2

ml etanol 96% dalam tabung reaksi. Campuran tersebut ditambahkan 5 ml

akuades dan 0,5 ml reagen Follin-Ciocalteau (50% v/v), kemudian didiamkan

selama 5 menit. Selanjutnya ditambahkan 1 ml larutan natrium karbonat (7.5%

b/v), dihomogenasi dan diinkubasi pada suhu ruang selama 1 jam dalam kondisi

tanpa cahaya (gelap). Kandungan total fenol diukur dengan spektrofotometer UV-

Visible (UV-Vis) pada panjang gelombang 765 nm.

3.4.6 Uji Bilangan Peroksida (Santoso et al. 2003 dalam Prabowo 2009)

Minyak yang digunakan dalam penelitian adalah minyak ikan yang

diperoleh dari pengumpul minyak daerah Cimahi Jawa Barat, minyak goreng yang

masih baru diperoleh dari pasaran, minyak goreng bekas pakai yang sudah dipakai

untuk menggoreng sebanyak kurang lebih tiga kali dalam skala rumah tangga.

Sistem emulsi minyak dibuat mengacu pada metode Santoso et al. (2003) yang

dimodifikasi, yaitu dengan menghomogenkan 5 g (6 ml)dan 30 ml akuades yang

telah ditambahkan 1,25 ml tween 20. Sistem emulsi lemak ditambahkan ekstrak

26

bagian lamun terbaik dari tahap sebelumnya yaitu daunEnhalus acoroides dengan

konsentrasi136,40 ppm, dan 200 ppm yang selanjutnya disebut sampel minyak.

Kemudian sampel minyak disimpan selama empat belas hari untuk minyak ikan

dan satu hari untuk minyak goreng dalam inkubator bersuhu 40C untuk

mempercepat oksidasi. Sampel minyak selanjutnya ditimbang sebanyak 5 g (6 ml)

di dalam labu erlenmeyer kemudian ditambahkan 30 ml pelarut (60% asam asetat

glacial dan 40% kloroform). Setelah larut kemudian ditambahkan 0,5 ml larutan

KI jenuh dan didiamkan 10 menit sambil dikocok. Iodin yang terbentuk dititrasi

dengan larutan Na2S2O3 0,1 N dengan penambahan indikator pati 1%. Titrasi

dihentikan saat larutan sampel berubah dari berwarna biru setelah ditambahkan

indikator pati menjadi tidak berwarna. Hasil pengurangan volume akhir terhadap

volume awal larutan Na2S2O30,1 N yang ditunjukkan oleh skala buret merupakan

volume total larutan Na2S2O30,1 N yang digunakan untuk titrasi sampel. Cara

yang sama seperti prosedur diatas ddibuat juga untuk penetapan blanko sebagai

kontrol negatif namun tidak dilakukan penambahan sampel (0 ppm). Kemudian

dilakukan analisa perhitungan nilai bilangan peroksida.

3.5 Parameter yang diamati

Parameter yang diamati dari penelitian ini adalah meliputi identifikasi

metabolit sekunder dan uji aktivitas antioksidan

3.5.1 Identifikasi Metabolit sekunder

Tabel 3. Parameter uji fitokimiaUji Fitokimia Parameter yang diamati

Uji Alkaloid + jika adanya endapan putih kekuningan

+ jika adanya endapan cokelat

Uji Flavonoid + jika terbentuk warna orange/kuning/merah/cokelat

Uji Steroid/ Triterpenoid + jika terbentuk warna merah/biru/ungu

Uji Saponin + jika terbentuk busa stabil 1-10cm, tidak hilang pada

penambahan HCl 2 N

Uji Fenol Hidrokuinon + jika terbentuk warnahijau-biru/ungu

Uji Tanin + jika terbentuk warna biru/hijau kehitaman

Sumber tabel : Harborne (1987)

27

3.5.2 Inhibisi antioksidan

Perhitungan yang digunakan adalah nilai EC50 (Effecient Concentration

50%) untuk menggambarkan besarnya konsentrasi senyawa uji yang dapat

menangkal radikal sebesar 50%. Berikut perhitungannya (Molyneux 2004)

% Inhibisi = absorbansi blanko − absorbansi sampelabsorbansi sampel x 100%Nilai EC50 diperolehdengan menggunakan persamaan regresi linier, diplotkan

dalam sumbu x dan y.

EC50Y=a+bx

Semakin kecil nilai EC50maka semakin tinggi aktivitas antioksidan yang

dimilikinya (Molyneux 2004)

3.5.3 Kadar Total Fenol

Kandungan total fenol diinterpretasikan sebagai milligram ekivalen asam

galat (GAE= Galic Acid Equivalent) per gram sampel (mg GAE/g sampel)

kemudian dipersentasikan (Singleton 1965).

Kadar polifenol % = Pengukuran kadar polifenol rata − ratakonsentrasi awal sampel x 10003.5.4 Evaluasi Aktivitas Antioksidan (Penghitungan Bilangan Peroksida)

Tahapan ini bertujuan untuk menentukan seberapa besar konsentrasi

ekstrak terpilih yang mampu menghambat pembentukan peroksida dalam emulsi

minyak dinyatakan dengan nilai peroksida. Nilai bilangan peroksida dinyatakan

miliequivalen per 1 kg minyak atau lemak dapat dihitung dengan rumus berikut

(Ketaren 1986) :

ℎ = A x N x 1000G x100%A = Jumlah ml larutan Na2S2O3 untuk titrasiN= Normalitas larutan Na2S2O3

G=Berat sampel (g)

Semakin tinggi bilangan peroksida maka semakin tinggi pula tingkat ketengikan

suatu minyak (ASA 2000 dalam Wildan 2002).

28

3.6 Analisa Data

Data yang diperoleh berupa reaksi perubahan warna, terbentuknya

endapan, dan adanya busa pada identifikasi metabolit sekunder , nilai daya

inhibisi EC50, total kadar polifenol, serta nilai bilangan peroksida pada uji

aktivitas antioksidan kemudian dianalisis secara deskriptif dan ditampilkan dalam

bentuk tabel dan gambar.