BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Tanaman Zukini (Cucurbita pepo L.)

Zukini (zucchini) merupakan tanaman sayuran yang masuk dalam anggota

famili Cucurbitaceae dengan nama spesies Cucurbita pepo L. Beberapa spesies

tanaman yang termasuk dalam famili Cucurbitaceae antara lain semangka

(Citrullus lanatus), mentimun (Cucumis sativus), melon (Cucumis melo), zucchini

(Cucurbita pepo), labu besar (Cucurbita maxima), paria (Momordica charantia),

dan labu siam (Sechium edule) (Rubatzky danYamaguchi, 1997), waluh (Cucumis

moschata), oyong (Luffa acutangula), labu air (Legenaria leucantha), beligo

(Benincasa hispida) dan parai (Trichosanthes anguina) (Tjitrosoepomo, 2002).

Tanaman zukini pada awalnya dibudidayakan di wilayah Selatan Meksiko

hingga Barat Daya Amerika Serikat sekitar 8.000 SM. kemudian dikembangkan di

negara-negara beriklim subtropis. Sayuran ini relatif baru dikenal di Indonesia

pada pertengahan abad ke-20, dan mulai masuk ke sentra-sentra pertanian dataran

tinggi di Indonesia. Varietas yang telah beredar di Indonesia dan telah banyak

ditanam petani diantaranya, Tendeer Finger, Jemmy, Green Champ, Hungnong

Zucchini, Bulam House, Golden Zucchini, Rondo dan Black Jack F1 yang

diproduksi oleh negara Taiwan dan Korea. Sedangkan produksi dari Amerika

Serikat di antaranya, Ambassador, Aristocrat, Embassy Commander dan Chefini.

Semua varietas tersebut, umumnya memiliki umur panen hampir sama, hanya

bentuk dan panjang buah yang berbeda (Risa, 2014).

10

11

Zukini termasuk tanaman monokotil dan berakar serabut. Bunganya kecil

berwarna kuning. Panjang buah zukini antara 15 cm sampai 30 cm dengan

diameter 4 cm sampai 10 cm dan bobot berkisar antara 200 - 300 g per buah.

Warna buahnya beragam ada yang kuning, hijau muda, dan hijau tua dengan kulit

mengkilap. Tanaman zukini merupakan tanaman semusim yang lunak serta

berbulu. Daun tanaman merupakan daun tunggal, memiliki pertulangan daun

majemuk menjari. Daunnya menyebar di sepanjang batang, bentuknya

menyerupai jantung dan bertangkai. Biji agak bulat dan pipih mirip dengan biji

labu besar, bijinya oleh produsen benih dijadikan sebagai bahan perbanyakan

secara generatif. Umumnya buah labu impor ini dipanen pada saat masih muda,

daging buah sangat tebal, dengan warna putih bersih dan banyak mengandung air.

Tanaman zukini dapat tumbuh dan berproduksi dengan baik pada daerah yang

memiliki suhu minimal 18°C sampai 24°C, dengan kelembaban udara antara 60%

sampai 90%. Tanaman zukini cocok ditanam pada lahan terbuka maupun green

house. Tumbuh subur di Indonesia, pada dataran menengah dan tinggi atau mulai

dari daerah dengan ketinggian 600 meter sampai 1.200 meter di atas permukaan

laut (dpl) (http://www.bbpp-lembang.info).

2.2 Virus Penting pada Tanaman Cucurbitaceae

Tanaman Cucurbitaceae banyak dibudidayakan di Indonesia. Ada lebih

dari 20 virus yang dapat menginfeksi tanaman Cucurbitaceae (Desbiez & Lecoq,

1997). Virus yang umum menginfeksi pertanaman Cucurbitaceae adalah

Cucumber mosaic virus (CMV), Cucumber green mottle mosaic virus (CGMMV),

12

Squash mosaic virus (SqMV), Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV), dan

Watermelon mosaic virus (WMV) (Ali & Osama, 2012).

Virus dengan gejala mosaik pada Cucurbitaceae menyebabkan gejala

belang pada daun yang disebut mosaik. Karakter mosaik adalah akibat adanya

warna yang bercampur antara warna hijau normal dan hijau muda atau kekuningan

pada tanaman yang terinfeksi virus. Gejala mosaik dapat berkisar dari ringan ke

berat dan dapat dilihat pada daun, batang dan buah. Tanaman yang lebih muda saat

terinfeksi menunjukkan gejala yang lebih berat. Pada beberapa kejadian, tanaman

yang terinfeksi pada masa persemaian dapat rebah dan mati. Tanaman yang

terinfeksi virus pada masa pembungaan dapat tidak menghasilkan buah atau buah

muda dapat gugur. Bila tanaman lebih tua saat terinfeksi, tanaman tersebut tidak

menunjukkan gejala yang berat dan dapat menghasilkan buah. Gejala pada buah

dari ringan yaitu perubahan warna sampai berat terjadi perubahan bentuk buah.

Tanaman bisa terinfeksi oleh dua atau lebih virus dan menyebabkan gejala

yang lebih berat daripada tanaman yang hanya terinfeksi oleh satu virus. (Nameth,

2002). Sebanyak enam jenis virus yang menginfeksi tanaman semangka dan

tanaman Cucurbitaceae lainnya pada lahan pertanaman komersial di Oklahoma,

antara lain: Papaya Ringspot Virus (PRSV-W), Watermelon Mosaic Virus

(WMV-2), Zucchini Yellow Mosaic Virus (ZYMV) dan Squash mosaic virus

(SqMV). PRSV-W, WMV-2 dan ZYMV merupakan virus yang paling luas

menginfeksi semangka dan tanaman Cucurbitaceae lainnya di negara bagian

Oklahoma. Ketiga virus ini bersama dengan CMV merupakan faktor penghambat

utama produksi tanaman Cucurbitceceae di USA (Ali et al., 2012).

13

Cucumber Mosaic Virus (CMV) merupakan spesies virus yang berasal

dari genus Cucumovirus, famili Bromoviridae. Cucumber Mosaic Virus (CMV)

juga merupakan salah satu virus penyebab penyakit mosaik yang banyak

ditemukan pada tanaman Cucurbitaceae. CMV memiliki distribusi yang luas di

seluruh dunia terutama pada zona iklim tropis. Gejala penyakit akibat infeksi

CMV bermacam-macam tergantung pada spesies inang atau strain CMV, yaitu

antara lain: mosaik, klorosis, kerdil, daun mengalami malformasi dan nekrosis.

Penyebaran utama virus ini melalui kutudaun secara nonpersisten dan dapat juga

ditularkan melalui benih (Mochizuki & Ohki, 2012).

Watermelon Mosaic Virus (WMV) merupakan virus yang termasuk

dalam genus Potyvirus, famili Potyviridae. WMV terdiri dari dua strain yaitu

WMV-1 (sama dengan PRSV-W) dan WMV-2. WMV-1 menginfeksi 38 spesies

Famili Cucurbitaceae sedangkan WMV-2 menginfeksi Cucurbitaceae dan

beberapa tanaman lain seperti alfalfa, semanggi merah, kacang polong

(Babadoost, 1999) dan berbagai spesies Leguminosae (Provvidenti, 1996). WMV

ditularkan secara nonpersisten oleh lebih dari 20 spesies vektor kutudaun

(Provvidenti, 1996). Gejala yang ditimbulkan oleh WMV pada tanaman terinfeksi

adalah mosaik, akumulasi warna hijau sepanjang tulang daun (vein banding),

perubahan bentuk daun, bunga menjadi tidak normal dengan mahkota yang tidak

berkembang atau membuka secara tidak sempurna. Bunga yang tidak normal

sebagian besar melipat dan tidak menghasilkan buah (Wakman et al., 2002).

Papaya Ringspot Virus (PRSV) termasuk famili Potyviridae, genus

Potyvirus. Berdasarkan kisaran inangnya terdapat 2 strain PRSV, yaitu PRSV-P

14

dan PRSV-W. Strain PRSV-P dapat menginfeksi tanaman dari famili Cruciferae

dan Cucurbitaceae, sedangkan strain PRSV-W hanya dapat menginfeksi

tanaman dari famili Cucurbitaceae. Strain PRSV yang menginfeksi tanaman dari

famili Cucurbitaceae (PRSV-W) dilaporkan di Australia pada tahun 1991 dan

Sudan pada tahun 2012 (Gonsalves et al., 2010; Mohammed et al., 2012). Di

Indonesia, PRSV telah dilaporkan menginfeksi tanaman pepaya di daerah Aceh

dan Medan pada tahun 2012, dengan insidensi penyakit mencapai 100% (Hidayat

et al., 2012).Tanaman Cucurbitaceae yang diinfeksi oleh PRSV menunjukkan

gejala mosaik, kerdil, dan terjadi perubahan bentuk pada daun, bentuk dan warna

buah tidak sempurna (Babadoost, 2012). Papaya Ringspot Virus (PRSV) dapat

ditularkan secara mekanis dan melalui banyak spesies kutudaun secara non

persisten (Tripathi et al., 2008).

2.3 Zucchini Yellow Mosaic Virus (ZYMV)

ZYMV diisolasi pertama kali di Italia tahun 1973, kemudian diidentifikasi

keseluruhan komponen genomnya dan dideskripsikan pada tahun 1981 (Lisa et

al., 1981). ZYMV merupakan virus penting yang menginfeksi tanaman

Cucurbitaceae di seluruh dunia dan memiliki pengaruh penting pada tanaman

Cucurbitaceae karena dapat menurunkan hasil (Lin et al., 2000; Simmons et al.,

2011). ZYMV hingga saat ini diketahui telah tersebar di 22 negara pada lima

benua termasuk di Indonesia (Zitter et al., 1998).

ZYMV dideskripsikan pertama kali pada pertanaman zukini yaitu di Italia

tahun 1973, di USA yaitu di Arkansas tahun 1981, Spanyol tahun 1982, Jersey

15

tahun 1983, Inggris tahun 1987, di Oceania yaitu Hawai tahun 1988, New

Caledonia tahun 1994 dan Portugal tahun 1996 (Desbiez & Lecoq, 1997).

Survei pada lahan mentimun di area penanaman di Jerman dari tahun 2001

hingga 2004, ditemukan bahwa tanaman mentimun terinfeksi oleh Zucchini

yellow mosaic virus (ZYMV), Watermelon mosaic virus (WMV) dan Cucumber

mosaic virus (CMV). ZYMV paling dominan menyebabkan kerusakan parah dan

labu juga ditemukan terinfeksi virus tersebut (Muller et al., 2006).

Pertanaman Cucurbitaceae di beberapa bagian Australia virus mosaik

menyebabkan kerugian paling parah dan kejadian infeksi mencapai 100% pada

tanaman labu. Dua virus kelompok potyvirus penyebab mosaik tersebut adalah

strain Pepaya ringspot virus (PRSV-W) yang sebelumnya dikenal sebagai Water

melon mosaik virus (WMV- 1) telah diketahui menyebabkan masalah untuk

Cucurbitaceae sejak tahun 1977 dan potyvirus kedua adalah Zucchini yellow

mosaic virus (ZYMV) juga telah menjadi penyebab penyakit mosaik sejak tahun

1989 (Conde et al., 2010). Lestari & Nurhayati (2014) melaporkan bahwa

keberadaan beberapa virus pada tanaman Cucurbitaceae yang ditemukan di Jawa

Barat antara lain Cucumber mosaic virus (CMV), Squash mosaic virus (SqMV),

dan Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV). Infeksi ZYMV hanya ditemukan pada

tanaman labu siam, sedangkan deteksi pada benih ditemukan menginfeksi benih

oyong dan zukini masing-masing mencapai 13% dan 27%.

2.3.1 Gejala infeksi Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV)

Variasi gejala muncul sebagai respon tanaman terhadap infeksi virus dan

dipengaruhi oleh kerentanan setiap varietas (genotip) tanaman, virus, ataupun

16

serangga vektornya (Matthews, 1992). Gejala yang ditimbulkan dari infeksi ZYMV

pada tanaman Cucurbitaceae pada umumnya dapat menyerupai gejala infeksi

PRSV-W. Pertanaman yang terinfeksi pada awal pertumbuhan menunjukan gejala

lebih berat dan menyebabkan kehilangan hasil yang sangat besar dibandingkan

pertanaman yag terinfeksi pada saat pembentukan buah. Pengaruh lingkungan dan

kejadian infeksi yang lebih dari satu virus menyebabkan gejala yang sangat parah

(Desbiez & Lecoq, 1997).

Kejadian penyakit yang disebabkan oleh ZYMV ini disebut penyakit

mosaik karena daun tanaman yang terinfeksi memiliki pola berbintik-bintik atau

mosaik terang dan hijau tua bukan warna hijau tua normal. Gejala penyakit akibat

infeksi ZYMV ini bermacam-macam tergantung dari inang dan tingkatan infeksi

virus tersebut. Tanaman yang terinfeksi menjadi kerdil dengan gejala mosaik

kuning pada daunnya, serta dapat memperlambat pertumbuhan bunga. Ukuran

buah menjadi lebih kecil, mengerut serta menjadi lebih kecil, dan tampak terdapat

tonjolan (Conde et al., 2010).

Infeksi ZYMV terutama terjadi pada tanaman labu, melon dan semangka.

Gejala infeksi ZYMV pada tanaman tersebut adalah mosaik kuning yang

hebat pada daun, perubahan bentuk dan pelepuhan daun, perubahan ukuran daun

menjadi kecil, dan tanaman menjadi kerdil. Pada buah labu dan squash, infeksi

ZYMV menyebabkan perubahan warna dan benjol-benjol yang menyebabkan

perubahan bentuk buah (Provvidenti, 1996; Tobias et al., 2003; Coutts, 2006).

Buah melon dan semangka yang terinfeksi ZYMV mengalami perubahan

bentuk dan retak secara memanjang dan melingkar. Selain itu, biji yang

17

dihasilkan mengalami pengurangan jumlah dan perubahan bentuk. Gejala yang

ditimbulkan ZYMV pada daun tanaman adalah mosaik dengan klorosis yang

dominan, nekrosis, daun mengecil, malformasi dan blistering (Zitter et al., 1998).

Berat ringannya kejadian penyakit tergantung waktu terjadinya infeksi, dan bila

kejadian infeksi pada awal pertumbuhannya dapat mengakibatkan kerugian hasil

mencapai 100% (Babadoost, 2012).

Karakter gejala tanaman terinfeksi ZYMV sangat bervariasi pada tanaman

mentimun di Sleman dan Subang yaitu dari gejala yang muncul pada daun berupa

mosaik, kuning dan melepuh (Dwiwiyati, 2014). Gejala tanaman labu hijau positif

ZYMV dari beberapa lokasi pertanaman kaboca hijau di Bogor menunjukkan

gejala berupa pemucatan tulang daun (vein clearing), mosaik hijau kuning,

malformasi daun, daun dominan klorosis / hijau terang dan terdapat lepuhan

seperti cacar berwarna hiaju tua (Nurjannah, 2014). Sementara tanaman zukini

terinfeksi ZYMV menujukan gejala mosaik dan distorsi daun (Hosseini et al.,

2007 & Coutts et al., 2011)

2.3.2 Kisaran Inang Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV)

Kisaran inang merupakan salah satu cara identifikasi untuk mengetahui

sifat biologi suatu virus (Hull, 2002). Sementara Zhao et al. (2003), berpendapat

bahwa selain dari sifat molekuler virus, kisaran tanaman inang dapat juga

digunakan untuk identifikasi dan membedakan strain dan patogenisitas virus.

Faktor yang juga menentukan bertahannya virus di alam adalah keberadaan satu

atau lebih spesies tanaman inang, dimana virus dapat mereplikasi diri. Virus

18

mosaik mempunyai kisaran inang yang luas termasuk beberapa gulma yang dapat

menjadi inang perantara dan sebagai sumber inokulum.

Tanaman yang biasa digunakan dalam uji kisaran inang ZYMV yaitu,

family (1) Solanaceae yaitu cabai besar (Capsicum annuum L.), cabai rawit

(Capsicum frutescens L.), tomat (Lycopersicon esculentum), terong hijau

(Solanum melongena); (2) Leguminosae yaitu kacang panjang (Vigna sinensis L.),

buncis (Phaseolus vulgaris L.); (3) Cucurbitaceae yaitu mentimun (Cucumis

sativus L.), waluh (Cucurbita moschata), labu siam/labu jepang (Sechium edule),

kaboca merah (Cucurbita pepo), pare (Momordica charantia); (4) Cruciferae

yaitu kubis (Brassica oleracea), sawi hijau (Brassica juncea), dan (5)

Amaranthaceae yaitu bayam cabut (Amaranthus tricolor), Datura stramonium

dan Lycopersicon esculentum (Jaroszewska et al., 2013 & Dukic, et al., 2002).

Menurut Aulia (2005) pertanaman oyong dan labu siam di Kotamadya

Bogor terdeteksi terinfeksi ZYMV berturut-turut dengan insiden penyakit antara

16,61% - 60,3% dan 6,1% - 8,9%. ZYMV isolat labu hijau dapat menginfeksi

semangka, melon, timun, kaboca, parai, labu siam dan Nicotiana benthamiana.

ZYMV dapat menginfeksi bunga kenop, Chenopodium amaranticolor dan

Chenopodium quinoa, namun ZYMV tidak menginfeksi oyong, buncis, kacang

panjang, cabai, tomat, ciplukan, tembakau, dan kecubung (Nurjannah, 2014).

Gulma sebagai salah satu komponen ekosistem pertanian memiliki

pengaruh negatif terhadap tanaman pertanian baik secara langsung maupun tidak

langsung. Adanya kompetisi merupakan pengaruh langsung dari keberadaan

19

gulma sedangkan pengaruh tidak langsung adalah peranannya sebagai inang

alternatif beberapa patogen penyebab penyakit tanaman (Sastroutomo, 1990).

2.3.3 Penularan Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV)

ZYMV secara umum ditularkan melalui dua cara yaitu secara horizontal

melalui vektor kutudaun, dan secara vertikal melalui transmisi dari benih generasi

pertama yang terinfeksi ZYMV ke generasi selanjutnya (Simmons et al., 2011;

Tobias et al., 2003). Virus ini tidak hanya ditularkan melalui vektor kutudaun

tetapi juga dilaporkan dapat menular secara mekanis maupun melalui benih dan

khusus untuk tanaman zukini, ZYMV dapat melalui benih yang terinfeksi.

(Simmons, et al., 2011). Keberadaan ZYMV terbawa benih pada oyong 13.3%,

melon 26.67% dan pada labu berkisar 1,29% sampai 1,53% (Lestari, 2011).

Tobias et al (2008) dan Simmons, et al (2011) melaporkan ZYMV yang terbawa

benih pada Cucurbita pepo subsp. texana berkisar 1.6%. Namun, Dikova &

Hristova (2002), menyatakan bahwa ZYMV yang terbawa benih pada benih

Cucurbitaceae mencapai 91%. Penularan melalui benih biasanya terjadi pada

tingkatan yang sangat rendah pada tanaman squash dan zucchini (Cucurbita pepo)

dan butternut squash (Cucurbita maxima). Penularan melalui benih tidak terjadi

pada melon, semangka, labu, dan mentimun (Desbiez & Lecoq, 1997).

Terdapat sepuluh spesies kutudaun yang dapat menjadi vektor virus,

namun A. gossypii dan A. craccivora merupakan vektor virus yang paling penting

di Hawaii. A. craccivora merupakan vektor penularan virus yang paling efisien,

karena waktu yang dibutuhkan oleh kutudaun tersebut untuk probing ke tanaman

menggunakan stiletnya lebih pendek dari pada A. gossypii (Yuan & Ullman,

20

1996). ZYMV ditularkan secara non persisten oleh beberapa spesies kutudaun

seperti Aphis gossypii, Myzus persicae (Coutts, 2006), A. syrthosiphon pisum, A.

kondoi, A. craccivora, A. citricola, A. middletonii, A. spiraecola, Macrosiphum

euphorbiae, Toxoptera aurantii, dan Uroleucon ambrosiae (Providenti, 1996).

Aphis gossypii dan Myzus persicae menularkan Papaya ringspot virus tipe-w dan

Zucchini yellow mosaic virus secara non persisten pada tanaman zukini (Pinto et

al., 2008), dan tanaman melon (Martin et al., 2003).

2.4 Karakter Molekuler Umum Potyvirus

ZYMV merupakan virus yang termasuk dalam famili Potyviridae, genus

Potyvirus. yang memiliki partikel virus dengan genom single-stranded RNA

(Agrios, 2005). Potyvirus merupakan grup terbesar dari 34 grup virus tanaman.

Sebanyak 30% dari semua virus tanaman yang diketahui menyebabkan kerugian

signifikan dalam bidang pertanian, adalah Potyvirus (Ward & Shukla 1991).

Partikel Potyvirus berbentuk filamen lentur, tanpa envelop berukuran

panjang 680-900 nm dan lebar 11-15 nm. Material genetik Potyvirus berupa

paliprotein tunggal, untai tunggal, utas positif dengan panjang 10 kb. Genom

RNA terdiri dari satu Open Reading Frame (ORF) yang mengekspresikan satu

poliprotein prekusor berukuran 350 kDa. Prekursor poliprotein tersebut kemudian

ditranslasi menjadi tujuh protein kecil yang memiliki berbagai fungsi, dinotasikan

sebagai proteinase (P1), helper component (HC), cylindrical inclusion (Cl),

nuclear inclusion A (Nla.), nuclear inclusion B (Nib), capsid protein (CP), serta

dua protein putatif kecil yang dikenal sebagai 6K1 dan 6K2 (Shukla et a1.,1994)

21

(Tabel 2.1 dan Gambar 2.1). Pada bagian terminal 3 diakhiri dengan motip poly-A

tail (Hari et al., 1979; Takahashi, et al., 1997).

Tabel 2.1

Organisasi Genom Potyvirus

Protein Fungsi

P1 Proteinase; Cell-to-cell movement

HC-Pro Transmission oleh Aphid, Proteinase; Cell-to-cell movement

P3 Belum diketahui

C1 Replikasi genome (RNA helicase); Membrane attachment,

stimulasi asam nukleat aktivitas ATPase; Cell-to-cell movement.

CP Encapsida RNA; berperan dalam transmisi oleh vektor; Cell to-

cell-movement.

Nla-VPg Replikasi genome (Primer untuk inisiasi sintesis RNA)

Nla-Pro Proteinase

Nlb Replikasi genome (RNA-dependent RNA polymerase [RdRp]).

6K1 & 6K2 Belum diketahui, namun diduga berperan pada: Replikasi RNA,

pengatur untuk penghambatan translokasi nuclear Nla, membran

pengikat proses replikasi

(Sumber : Winterhalter, 2005)

Genom Potyvirus diekspresikan melalui translasi poliprotein dari genom

virus. Poliprotein mengalami pemotongan menjadi protein fungsional dan

struktural sesuai dengan gen yang disandikannya yang terjadi di dalam sitoplasma.

Selama dan sesudah translasi terjadi pemotongan poliprotein oleh protease yang

berasal dari ekspresi dari genom Potyvirus. Poliprotein yang diekspresikan oleh

genom virus diproses menjadi sepuluh protein fungsional oleh tiga jenis enzim

proteinase yang dihasilkan oleh virus itu sendiri (Hull, 2002). Protein inclusi (CI)

dan protein selubung (CP) berguna untuk pergerakan dari satu sel inang ke sel

inang lainnya melalui plasmadesmata. CP juga digunakan untuk pergerakan virion

protein dalam jaringan vaskuler melalui interaksi dengan HC-Pro pada domain C-

dan N- terminalnya. HC-Pro dengan menggunakan antiviral yang disebut RNA

silencing, berfungsi menekan mekanisme pertahanan tanaman. Viral genome-

22

linked protein (VPg) merupakan protein multifungsi yang berperan pada saat

amplifikasi dan pergerakan virus yang berada pada ujung 5’ genom virus. VPg

mempunyai peranan penting untuk proses infeksi virus. VPg juga berinteraksi

dengan faktor inisiasi translasi (eIF(iso)4E), dan diperlukan untuk infeksi secara

sistemik. Genom Potyvirus mempunyai bagian yang tidak berubah (conserved)

dan daerah yang bervariasi. HC-Pro dan NIb merupakan bagian yang tidak

berubah sedangkan daerah yang bervariasi adalah PI, P3 dan CP.

Gambar 2.1. Organisasi Genom Potyvirus (Shukla et al., 1994)

Penelitian keragaman genetik pada genus Potyvirus telah banyak

dilakukan berdasarkan gen-gen yang terlibat di dalam pembentukan selubung

protein dan daerah 3'UTR. Daerah tersebut diketahui merupakan daerah yang

bervariasi di antara kelompok Potyvirus. Shukla & Ward (1988) menggunakan

runutan asam amino coat protein (CP) untuk menilai hubungan kekerabatan

berbagai virus dalam kelompok Potyvirus. Kesamaan runutan asam amino CP

38% hingga 71% untuk strain virus yang berbeda, dan tingkat kesamaannya

mencapai 90% sampai 99% untuk strain dari virus yang sama.

2.5 Penularan Virus

2.5.1 Penularan Virus Secara Mekanis

Secara umum, virus tumbuhan hanya dapat masuk ke dalam sel melalui

luka, oleh sebab itu virus tumbuhan sangat tergantung pada agensia eksternal yang

P1

HC-Pro

P3

C1

VPg

Nla-Pro

Nlb

CP

Poly-A

6K1 6K2 3,UTR VPg

23

membantu membawa virus sampai ke tanaman inang. Penularan secara mekanis

banyak dipakai sebagai metode penularan untuk percobaan di labaratorium.

Inokulasi secara mekanik dilakukan dengan cara mengoleskan sap (ekstrak daun)

pada permukaan daun tanaman yang mengalami luka. Inokulasi virus dapat

dilakukan dengan penambahan karborundum (silicon karbida) ke dalam sap atau

ditaburkan pada pernnukaan daun. Karborundum bertungsi sebagai agensia abrasi

saat ekstrak dioleskan pada daun tanaman (Hidayat, 2008).

Keberhasilan inokulasi secara mekanis tergantung pada konsentrasi virus

dalam sap, sumber inokulum, metode penyiapan inokulum, ketahanan virus dalam

sap dan tanatnan inang. Kondisi lingkungan sebelum dan sesudah inokulasi

seperti cahaya dan suhu juga mempengaruhi keberhasilan inokulasi (Sulandari et

al., 2006).

Prosedur umum pembuatan inokulum dilakukan dengan menggerus

jaringan tanaman yang terinfeksi dalam larutan potassium posphat pada pH 7-7,5.

Tingkat keasaman sangat penting diperhatikan karena pada umumnya pH optimal

untuk aktivitas beberapa enzim ribonuklease berada pada pH 5-6. Penggunaan pH

yang lebih tinggi akan mengurangi aktivitas nuclease yang dapat merusak virus.

Penggunaan pH 8-9 banyak digunakan untuk partikel virus yang mudah rusak.

Kehilangan infektibtas virus akibat adanya senyawa tannin dapat dihindari dengan

menggerus daun dalam suasana basa (Sulandari et al., 2006).

2.5.2 Penularan Virus Melalui Benih

Lebih dari 100 jenis virus telah diketahui sebagai virus yang tular benih.

Setiap biji yang terinfeksi dapat menghasilkan sumber infeksi baru pada musim

24

berikutnya atau tempat lain (Shukla et.al., 1994). Penularan virus melalui biji

terjadi karena virus tepat di dalam biji atau pada jaringan embrio. Kecuali untuk

beberapa virus yang sangat stabil seperti TMV (Tobbaco mosaic virus) dan

CGMMV (Cucumber green mottle mosaic virus) dapat menular walaupun berada

pada kulit biji.

2.5.3 Penularan Virus melalui Vektor

Secara alami atau dalam praktek, virus dapat ditularkan oleh vektor

serangga. Ada tiga jenis virus yang dapat ditularkan oleh serangga vektor yaitu:

1. Virus nonpersisten. Serangga dengan tipe mulut menghisap membawa virus

pada stiletnya disebut virus nonpersisten. Serangga virus nonpersisten

umumnya mendapatkan virus melalui stilet setelah makan pada tumbuhan

sakit hanya selama beberapa detik (30 detik atau kurang) dan dapat

mentransmisi virus tersebut setelah pindah dan makan pada tumbuhan sehat

dalam waktu yang pendek, beberapa detik. Salah satu vektor virus

nonpersisten adalah aphis (kutu daun). Panjang waktu aphis tetap bersifat

viruliverous (menularkan virus) setelah mendapatkan virus bervariasi dari

beberapa menit sampai beberapa jam, setelah itu serangga tersebut tidak dapat

lagi mentransmisi virus. Kutudaun merupakan serangga vektor virus

tumbuhan yang sangat penting dan sebagian besar yitu kira-kira 160 jenis

dapat mentransmisi semua virus. Spesies kutudaun yang sama dapat

mentransmisi beberapa jenis virus, tetapi pada banyak kasus vektor virus

bersifat agak spesifik. Potyvirus termasuk dalam virus non persisten

(Wahyuni, 2005).

25

2. Virus semipersisten. Pada virus semipersisten virus dapat bertahan dalam

vektornya lebih lama. Virus ini ditelan ke dalam saluran pencernaan serangga

dan periode waktu makan agak lama dibandingkan dengan virus nonpersisten

(dari beberapa menit sampai beberapa jam). Kemampuan penularan akan

meningkat dengan meningkatnya periode makan akuisisi (periode yang

dibutuhkan serangga vektor untuk menghisap cairan sel dan memindahkan

virus ke tanaman sehat), Beberapa virus yang termasuk virus semipersisten

adalah Clasterovirus, misalnya Beet yellow virus dan Citrus Tristeza virus

(Wahyuni, 2005).

3. Virus persisten. Virus persisten adalah virus yang dapat terbawa dari stilet ke

dalam alat pencernaan serangga vektor, kemudian masuk ke dalam darah,

kelenjar ludah, ke ludah dan melalui stilet lagi masuk ke dalam tanaman sehat.

Ini artinya virus tetap persisten dalam tubuh vektor. Pada beberapa kasus

kutudaun mentransmisi virus sirkulatif, kutudaun tertentu tidak dapat

mentransmisi virus dengan segera tetapi harus menunggu beberapa jam setelah

mendapatkan virus dengan makan pada tunbuhan sumber virus, tetapi setelah

kutudaun dapat mentransmisi virus, maka mereka terus dapat mentransmisi

virus dalam beberapa hari (transmisi persisten). Beberapa virus yang termasuk

virus persisten adalah Carrot Mottle Virus dan Beet Western Yellow (Sulandari

et al., 2006).

2.5.4 Kutudaun Sebagai Serangga Vektor Virus

Serangga vektor virus yang terbanyak, termasuk dalam ordo Hemiptera

dan Thysanoptera. Serangga vektor yang termasuk ordo Hemiptera di antaranya

26

kutudaun, kutukebul, wereng daun yang merupakan vektor utama virus dan

menjadi vektor hampir 400 spesies virus. (Fareres & Moreno, 2009).

Jumlah vektor dan ketergantungannya pada musim merupakan faktor

penting dalam epidemiologi penyakit virus. Efisiensi penularan virus oleh

kutudaun erat kaitannya dengan konsentrasi virus dan jumlah kutudaun, karena

semakin banyak koloni kutudaun pada pertanaman maka proses kecepatan

multiplikasi virus semakin meningkat dan mempercepat perkembangan epidemic

penyakit. Faktor lain yang mempengaruhi diantaranya kemampuan kutudaun

dalam membawa dan menularkan virus, periode yang diperlukan kutudaun untuk

memperoleh cairan sel tanaman, periode untuk menghisap cairan sel dan untuk

memindahkan virus ke tanaman sehat, dan periode makan akuisisi selesai sampai

kutudaun mampu menularkan virus ke tanaman sehat (Bos, 1990).

Penularan virus dilakukan secara nonpersisten yaitu kutudaun dapat

langsung menularkan virus ke tanaman sehat, segera setelah makan akuisisi pada

tanaman sakit sumber virus. Selanjutnya kutudaun akan hilang kemampuannya

untuk menularkan virus setelah makan inolukasi pada tanaman yang sehat.

Kutudaun infektif (membawa virus) yang mendatangi pertanaman akan segera

menularkan virus pada tanaman yang baru dihinggapinya, sehingga walaupun

kutudaun tersebut mati akibat pestisida yang diaplikasikan namun tanaman sudah

terlanjur tertular virus (Eka, 2011).

2.5.4.1 Aphis craccivora

Siklus hidup A.craccivora pada kondisi lingkungan yang sesuai berkisar

antar 5-6 hari, dengan rata-rata 5,5 hari. Di daerah yang beriklim sedang

27

keperidian dapat mencapai 60 ekor. Walaupun demikian mortalitas pada nimfa

cukup besar, Serangga bersayap hanya menghasilkan kira-kira separuh dari

jumlah keturunan yang dihasilkan serangga tidak bersayap (Jurgen et al., 1977).

Klasifikasi Aphis craccivora menurut Borror et al., (1992)

Kingdom : Animalia

Phylum : Arthropoda

Kelas : Insekta

Ordo : Hemiptera

Famili : Aphididae

Genus : Aphis

Spesies : Aphis craccivora

Nimfa yang baru lahir panjangnya 0,35 mm dan lebamya 0,18 mm

(Sutarjo, 1978). Serangga dewasa A. craccivora yang parthenogenesis terdiri dari

bua bentuk, yaitu bentuk tidak bersayap dan bentuk bersayap (Cottier, 1953 &

Eastop, 1961). Imago yang tidak bersayap kepalanya berwarna hitam dengan mata

berwarna merah gelap hampir hitam dan sepasang antena yang panjangnya dua

pertiga panjang tubuh dan terdiri dari 6 ruas. Antena tidak mempunyai sensorial

sekunder (Cottier, 1953 & Eastop, 1961). Tubuhnya berukuran + 1,5-2 mm,

berwarna hitam (biasanya mengkilat) dan kadang-kadang sedikit bertepung putih.

Bentuk imago bersayap dewasa hampir sama dengan serangga tidak bersayap.

Rata- rata ukuran tubuhnya lebih kecil dibandingkan serangga yang tidak

bersayap (Cottier, 1953). A.craccivora biasanya menyerang tanaman

Leguminoceae dengan kepadatan populasi yang berbeda-beda, tetapi pada musim

kemarau A. craccivora dapat bertahan pada gulma.

28

2.5.4.2 Myzus persicae

Klasifikasi Myzus persicae menurut Borror et al., (1992)

Kingdom : Animalia

Phyilum : Arthropoda

Kelas : Insekta

Ordo : Hemiptera

Famili : Aphididae

Genus : Myzus

Spesies : Myzus persicae

M. persicae adalah kutudaun yang berwarna kuning kehijauan atau

kemerahan. Baik kutu muda (nimfa atau aptera) maupun dewasa (imago)

mempunyai antena yang relatif panjang, kira-kira sepanjang tubuhnya. Panjang

tubuh ± 2 mm, tubuh lunak seperti buah pir (Tarumingkeng, 2001). Siklus hidup

serangga ini adalah ± 18 hari. Kutudaun dewasa dapat menghasilkan keturunan

(nimfa) tanpa melalui perkawinan. Sifat ini disebut parthenogenesis, satu ekor

dewasa dapat menghasilkan kim-kira 40 ekor nimfa. Selama tidak mengalami

gangguan dan makanan cukup tersedia, kejadian tersebut berlangsung terus

menerus sampai populasi menjadi padat (Tarumingkeng, 2001).

Hidup M. persicae berkelompok pada bagian bawah helaian daun atau

pada pucuk tanaman. Nimfa dan imago mempunyai sepasang tonjolan pada ujung

abdomen yang disebut kornikel. Ujung kornikel pada kutu daun berwarna hitam.

Perkembangan M. persicae dapat tumbuh secara optimal pada saat tanaman

bertunas (Ditlin, 2008). M. persicae adalah hama penting pada beberapa tanaman

budidaya. Hal itu disebabkan karena sifatnya yang polifag, reproduksi

parthenogenetik dan siklus hidup pendek. Ketiga sifat itu menyebabkan kutudaun

29

tersebut berkembang pesat dan dapat diternukan di berbagai tempat (Blackman &

Eastop, 2000). Di samping itu M. persicae juga merupakan vektor berbagai

penyakit virus tanaman (Harris & Maramorosch, 1997). M. persicae merupakan

vektor lebih dari 150 strain virus (Pracaya, 2007).

2.5.4.3 Aphis gossypii

Klasifikasi Aphis gossypii menurut Borror et al., (1992)

Kingdom : Animalia

Phylum : Arthropoda

Kelas : Insekta

Ordo : Hemiptera

Famili : Aphididae

Genus : Aphis

Spesies : Aphis gossypii

Penyebaran A. gossypii cukup luas di daerah tropis, termasuk di beberapa

kepulauan daerah pasifik (Blackman & Eastop, 2000). A. gossypii merupakan

spesies yang sangat polifag (Kalshoven, 1981). Stadia nimpa A. gossypii

bervariasi dari 3-20 hari dengan rata-rata 7,3 hari, masa reproduksi 2-31 hari

dengan rata-rata 15,6 hari, masa pasca reproduksi 0-21 hari dengan rata-rata 5,3

hari dan lama hidup 9-29 hari dengan rata-rata 28,4 hari. Seekor imago dapat

melahirkan 1-14 ekor nimfa dengan rata-rata 4,3 ekor nimfa per hari, sedang

keperidian dengan rata-rata imago 67 nimfa (Ebeling, 1959). Pada umumnya

kutudaun yang ditemukan di lapangan tidak bersayap (Kalshoven, 1981).

30

2.6 Identifikasi dan Deteksi Virus

Identifikasi secara tepat spesies yang menginfeksi tanaman sangat penting

untuk tindakan yang akan diterapkan dalam hal mengendalikan penyakit.

Pengamatan gejala penyakit saja tidak cukup untuk mendeteksi dan

mengidentifikasi virus pada tanaman. Beberapa virus dapat menimbulkan gejala

yang sama pada tanaman yang sama, satu virus dapat menghasilkan variasi gejala

tergantung strain virusnya, campuran beberapa virus atau strain virus dapat

mempengaruhi gejala. Selain itu, suatu virus dapat menimbulkan gejala yang

berbeda pada tanaman yang berbeda. Kondisi lingkungan dan iklim juga

berpengaruh terhadap tipe gejala yang muncul (Hull, 2002).

Metode yang tepat untuk mendeteksi dan mengidentifikasi virus pada

suatu tanaman dapat dilakukan berdasarkan karakter biologi dan molekuler.

Deteksi virus berdasarkan karakter biologi dapat dilakukan melalui pengujian

kisaran inang dan tanaman indikator, penularan, dan berdasarkan bentuk partikel.

Deteksi dan identifikasi menggunakan karakter molekuler umumnya dilakukan

dengan dua cara yaitu berdasarkan sifat protein dengan uji serologi dan sifat asam

nukleat dengan hibridisasi DNA, ekstraksi DNA/RNA serta PCR/RT-PCR ( Hull,

2002).

Hasil identifikasi bergantung dari jenis antiserum yang digunakan untuk

uji serologi dan primer yang digunakan untuk PCR. Hasil identifikasi bisa

langsung berupa spesies virus, bila antiserum dan primer yang digunakan spesifik,

namun bisa hasil identifikasi hanya genus virus, bila antiserum dan primer yang

digunakan bersifat general. Bila primer general yang digunakan, maka perlu

31

dilakukan uji lanjutan berupa sekuen nukleotida dari hasil PCR yang telah

berhasil dilakukan. Berdasarkan sekuen nukleotida maka melalui analisis BLAST

dapat ditentukan spesies virus bersangkutan.

2.6.1 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

Teknik serologi merupakan salah satu cara deteksi dan identifikasi suatu

pathogen dalam suatu inang, yang memanfaatkan reaksi spesifik antara antigen

dan antiserum (Crowther,1995). Metode ini mengalami perkembangan yang

sangat pesat dan aplikasinya di bidang penyakit tumbuhan sudah sangat umum

digunakan, yaitu untuk mendeteksi suatu patogen khususnya virus dalam

tanaman. Kegunaan yang lain dari uji serologi ini adalah untuk menentukan

konsentrasi virus dalam jaringan tanaman, mendeteksi virus tumbuhan dalam

tubuh serangga vektor dan untuk mengetahui hubungan kekerabatan antar virus

(Agrios, 2005).

Keberhasilan dan ketelitian teknik serologi untuk mendeteksi dan

mengidentifikasi virus sangat tergantung pada ketersediaan pereaksi diagnostik

seperti antiserum, dengan kualitas yang baik dan memadai. Antiserum adalah

serum yang mengandung antibody (Noordam,1973). Antobodi adalah molekul

immunoglobulin yang dihasilkan oleh sistem imun dari hewan sebagai tanggapan

terhadap suatu rangsangan molekul asing (antigen) (Crowther, 1995). Antibodi

banyak dimanfaatkan dalam kajian imunologi untuk mengidentifikasi suatu

pathogen. Ikatan antigen dengan antobodi sangat spesifik, suatu molekul antigen

mempunyai kemampuan untuk bereaksi atau berikatan dengan suatu molekul

immunoglobulin. Antigen pada umumnya terdiri atas makromelekul yaitu berupa

32

protein, nucleoprotein ataupun polisakarida yang mempunyai berat molekul lebih

dari 10.000 dan akan bereaksi spesifik apabila diinjeksi ke dalam tubuh hewan

percobaan.

Clark dan Adams telah memperkenalkan Enzyme-Linked Immunosorbent

Assay (ELISA) untuk ilmu penyakit tanaman pada tahun 1977. Sejak saat itu,

ELISA sering digunakan untuk pengujian virus tanaman dan patogen tanaman

lainnya. Pada ELISA, antigen atau antibodi melekat pada sumuran plate

mikrotiter (Dijkstra & de Jager, 1998). Plate mikrotiter polistiren tersebut

selain sebagai wadah juga sebagai substrat pengikat antigen atau antibodi, karena

permukaanya mempunyai molekul-molekul yang bermuatan positif (Wahyuni,

2005).

Teknik ELISA memerlukan sejumlah reagen yang berfungsi untuk

mendukung terjadinya reaksi antigen dan antibodi. Jenis antibodi yang digunakan

untuk mendeteksi sampel dapat berupa antibodi monoklonal atau antibodi

poliklonal (Wahyuni, 2005). Keuntungan ELISA pada pengujian virus tanaman

adalah dapat mendeteksi konsentrasi virus yang sangat rendah (1-10 ng/ml),

hanya sedikit antibodi yang dibutuhkan, pengujian dapat dilakukan terhadap sap

tanaman maupun virus yang telah dimurnikan. Selain itu, pengujian dapat

dilakukan untuk sampel jumlah besar, dapat distandardisasi menggunakan kit

bahan pengujian, dan dapat digunakan untuk mengukur analisis kuantitatif (nilai

absorbansi) disamping hasil kualitatif (Dijkstra & de Jager, 1998).

Prosedur ELISA dibagi menjadi dua metode yaitu direct-ELISA dan

indirect-ELISA. Pengujian direct-ELISA atau Double Antibody Sandwich (DAS)-

33

ELISA dalam virologi tumbuhan biasanya memiliki dua atau tiga tahap

penggunaan antibodi. Antibodi dimasukkan secara langsung pada pelat mikrotiter

dengan tujuan untuk mengikat antigen secara spesifik ke pelat mikrotiter.

Antibodi kedua (biasanya dari sumber yang sama dengan antibodi pertama)

dikonjugasikan dengan enzim yang berfungsi sebagai pendeteksi antibodi

(Martin, 1998). Pada direct-ELISA harus disiapkan konjugat secara terpisah

untuk masing-masing virus yang diuji. Pada metode indirect-ELISA, keberadaan

antigen-antibodi pertama terdeteksi oleh antibodi yang diproduksi pada spesies

hewan yang berbeda dengan hewan sumber antibodi pertama. Antibodi tersebut

disebut antibodi kedua yang telah dilabel enzim. Antibodi kedua dapat digunakan

untuk mendeteksi virus-virus yang berbeda. Antibodi tersebut merupakan

konjugat “universal”. Kespesifikan reaksi indirect-ELISA biasanya lebih rendah

daripada metode direct-ELISA (Dijkstra & de Jager, 1998).

Reaksi positif antara antigen dan antibodi ditandai dengan perubahan warna

cairan kompleks antigen dan antibodi yang terkonjugasi dengan enzim menjadi

kuning atau biru toska, tergantung pada macam substrat yang digunakan.

Misalnya reaksi menggunakan p-nitrophenil phosphate akan menjadi menjadi

berwarna kuning. Intensitas warna yang bervariasi mencerminkan konsentrasi

virus yang terkandung dalam cairan tersebut. Intensitas warna yang terjadi

dikonversikan menjadi angka oleh spektrum cahaya pada 405 nm dan alat untuk

membacanya disebut ELISA-reader. Inkubasi dengan enzim substrat berkisar 20

sampai 40 menit, dan tidak boleh lebih dari dua jam karena kontrol negatif akan

ikut berubah warnanya (Wahyuni, 2005).

34

2.6.2 Polymerase Chain Reaction (PCR)

Karakterisasi virus tanaman dapat dilakukan juga melalui sifat asam

nukleat virus tersebut. Saat ini metode deteksi dan identifikasi virus yang akurat

banyak dilakukan berbasis pada pengetahuan biologi molekuler yang telah

berkembang sangat pesat. Teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan

cara cepat untuk mengamplifikasi DNA secara in-vitro, sangat berguna dalam

mengidentifikasi virus-virus yang menginfeksi tanaman, hewan dan manusia.

Identifikasi virus dengan teknik PCR didasarkan pada sifat primer yang spesifik,

karena penentuan primer sangat menentukan keberhasilan hasil deteksi.

(Sambrook et al., 1989).

PCR adalah suatu metode enzimatis dan banyak digunakan untuk berbagai

macam manipulasi dan analisis genetik, misalnya untuk melipatgandakan suatu

molekul DNA. Dengan metode ini, segmen tertentu pada DNA dapat digandakan

hingga jutaan kali lipat dalam waktu relatif singkat. Kelebihan lain metode PCR

adalah bahwa reaksi dapat dilakukan dengan menggunakan komponen dalam

jumlah sangat sedikit, misalnya DNA cetakan yang diperlukan hanya sekitar 5 μg,

oligonukleotida yang diperlukan hanya sekitar 1 mM, dan reaksi ini biasa

dilakukan dalam volume 50-100 μl (Yuwono, 2006).

Menurut Muladno (2010), PCR merupakan suatu reaksi in vitro untuk

menggandakan jumlah molekul DNA pada target tertentu dengan cara mensintesis

molekul DNA baru yang berkomplemen dengan molekul DNA target tersebut

melalui bantuan enzim dan oligonukleotida sebagai primer dalam suatu

thermocycler. Panjang target DNA berkisar antara puluhan sampai ribuan

35

nukleotida yang posisisnya diapit sepasang primer. Primer yang berada sebelum

daerah target disebut sebagai forward primer dan yang berada setelah daerah

target disebut reverse primer. Enzim yang digunakan sebagai pencetak rangkaian

molekul DNA baru dikenal sebagai enzim polymerase. Reaksi pelipatgandaan

suatu fragmen DNA dengan cara PCR terdiri dari tiga tahapan atau tiga reaksi,

yaitu pemisahan (denaturasi), penempelan primer (annealing), dan pemanjangan

primer (extension).

Denaturasi. Tahapan pertama dimulai dengan melakukan denaturasi

DNA cetakan sehinggga rantai DNA yang berantai ganda (double stranded) akan

terpisah menjadi rantai tunggal (single stranded). Denaturasi DNA dilakukan

menggunakan panas (95ºC) selama 1- 4 menit (Yuwono, 2006). Denaturasi yang

tidak lengkap mengakibatkan DNA mengalami renaturasi (membentuk DNA untai

ganda kembali) secara cepat, dan ini mengakibatkan gagalnya proses PCR.

Adapun waktu denaturasi yang terlalu lama, mungkin dapat mengurangi aktivitas

Enzim taq polymerase (Muladno, 2010).

Penempelan primer (annealing). Tahap kedua yaitu penempelan primer

(annealing) pada DNA cetakan yang telah terpisah menjadi rantai tunggal yang

dilakukan pada suhu 55°C selama 1 menit. Primer akan membentuk jembatan

hidrogen dengan cetakan pada daerah sekuen yang komplementer dengan sekuen

primer (Yuwono, 2006). Pada tahap ini, primer forward yang runutan

nukleotidanya berkomplemen dengan salah satu untai tunggal akan menempel

pada posisi komplemennya. Demikian juga primer reverse akan menempel pada

untai tunggal lainnya (Muladno, 2010).

36

Pemanjangan primer (extension). Setelah kedua primer menempel pada

posisinya masing-masing, enzim taq polymerase mulai mensintesis molekul DNA

baru yang dimulai dari ujung 3’ masing-masing primer (Muladno, 2010). Sintesis

DNA ini terjadi pada suhu 72°C selama 1-2 menit. Pada suhu ini, DNA

polymerase akan melakukan proses polimerasi rantai DNA yang baru berdasarkan

informasi yang ada pada DNA cetakan dengan bantuan enzim taq DNA

polymerase (Yuwono, 2006). Setelah terjadi polimerasi, rantai DNA yang baru

akan membentuk jembatan hidrogen dengan DNA cetakan. DNA rantai ganda

yang terbentuk dengan adanya ikatan hidrogen antara rantai DNA cetakan dengan

rantai DNA baru hasil polimerasi selanjutnya akan didenaturasi lagi dengan

menaikkan suhu inkubasi menjadi 95°C. Rantai DNA yang baru tersebut

selanjutnya akan berfungsi sebagai cetakan bagi reaksi polimerasi berikutnya.

Ketiga tahapan tersebut diulangi lagi sampai 25-30 siklus sehingga pada akhir

siklus akan didapatkan molekul-molekul DNA rantai ganda yang baru hasil

polimerasi dalam jumlah yang jauh lebih banyak dibandingkan dengan jumlah

DNA cetakan yang digunakan (Yuwono, 2006).

2.6.3 Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)

Untuk virus yang memiliki tipe genom RNA digunakan teknik RT-PCR.

Teknik RT-PCR dikembangkan untuk melakukan analisis terhadap molekul RNA

hasil transkripsi yang terdapat dalam jumlah sangat sedikit di dalam sel. Oleh

karena PCR tidak dapat dilakukan dengan menggunakan RNA sebagai cetakan,

maka terlebih dahulu dilakukan proses transkripsi balik (reverse transcription)

terhadap molekul RNA sehingga diperoleh molekul cDNA (complementary

37

DNA). Enzim transkriptase balik (reverse transcriptase) yang digunakan dalam

RT-PCR adalah enzim DNA polimerase dan molekul RNA yang berperan sebagai

cetakan di dalam mensintesis molekul DNA (cDNA) yang komplementer.

Molekul cDNA tersebut kemudian digunakan sebagai cetakan dalam proses PCR.

Metode RT-PCR adalah metode yang lebih dapat dipercaya dan lebih

sensitif sebagai metode pendeteksian virus atau indexing. Pada kajian biologi,

sering terjadi bahwa virus tidak terdeteksi, tetapi menunjukkan hasil positif

dengan metode serologi dan RT-PCR yang dapat mendeteksi virus pada

konsentrasi rendah (Moury et al., 2011). Metode RT-PCR juga mempunyai

kelemahan yaitu tidak dapat membedakan virus pada pengelompokan virus yang

sama atau tidak dapat mengetahui variabilitas di antara strain-strain virus sendiri.

Keunggulan masing-masing metode deteksi sangat ditentukan oleh berbagai

faktor. Identifikasi virus dengan kajian biologis memerlukan waktu yang cukup

lama karena harus mempersiapkan tanaman indikator, tetapi biaya yang

digunakan tidak banyak. Metode serologi dan RT-PCR adalah metode yang lebih

dapat dipercaya dan lebih sensitif sebagai metode pendeteksi virus atau indexing,

dibandingkan dengan kajian biologi. Sering terjadi bahwa virus tidak terdeteksi

pada kajian biologi, tetapi menunjukkan hasil positif dengan metode serologi dan

RT-PCR yang dapat mendeteksi virus pada konsentrasi rendah.

2.6.4 DNA Sequencing

Analisis perunutan nukleotida dan asam amino saat ini memiliki peranan

yang tidak kalah penting di dalam melakukan deteksi dan karakterisasi virus.

Berdasarkan hasil analisis perunutan nukleotida dan asam amino dapat diketahui

38

tingkat kesamaan nukleotida dan dapat menentukan kelompok suatu virus maupun

strain-strain dari virus yang sama (Shukla et al., 1994). Analisis tersebut dapat

digunakan sebagai pelengkap proses identifikasi dan karakterisasi virus. Tujuan

paling penting DNA sequencing adalah mencari pattern yang diketahui di dalam

sekuen. Pattern ini bisa terlibat di fungsi biologis yaitu mengkode protein dan

RNA serta mengontrol eskpresi gen dan replikasi DNA.

2.7 Analisis Filogenetika Molekuler

Dengan pesatnya perkembangan teknik-teknik di dalam biologi molekuler,

seperti PCR (polymerase chain reaction) dan sekuensing DNA, penggunaan

sekuen DNA dalam penelitian filogenetika telah meningkat pesat dan telah

dilakukan pada semua tingkatan taksonomi, misalnya family, marga, dan spesies.

Sekuen DNA dijadikan karakter dalam penelitian filogenetika karena beberapa

fakta, yaitu: (1) sekuen DNA menawarkan data akurat melalui pengujian

homologi yang lebih baik terhadap karakter-karakter yang ada (2) sekuen DNA

menyediakan banyak character states karena perbedaan laju perubahan basa-

basa nukleotida di dalam lokus yang berbeda adalah besar dan (3) sekuen DNA

telah terbukti menghasilkan sebuah hubungan kekerabatan yang lebih alami.

Filogenetika molekuler mengkombinasikan teknik biologi molekuler

dengan statistik untuk merekonstruksi hubungan filogenetika. Filogenetika

digambarkan sebagai klasifikasi secara taksonomi dari suatu organisme

berdasarkan pada sejarah evolusi yaitu merupakan bagian integral dari ilmu

pengetahuan yang sistematik yang mempunyai tujuan untuk menentukan filogeni

dari organisme berdasarkan karakteristik. Analisis filogenetika sekuen asam

39

amino dan protein biasanya akan menjadi penting dalam analisis sekuen. Pohon

filogenetik adalah pendekatan logis untuk menunjukkan hubungan evolusi antara

organisme. Pohon evolusi adalah sebuah grafik dua dimensi yang menunjukan

hubungan di antara organisme atau lebih spesifik lagi adalah sekuen gen dari

organisme. Pemisah sekuen disebut taxa (atau taxon jika tunggal) yang

didefenisikan sebagai jarak filogenetika unit pada sebuah pohon. Pohon terdiri

dari cabang-cabang luar (outer branches) atau daun-daun (leaves) yang

mereprensentasikan taxa dan titik-titik (nodes) dan cabang merepresentasikan

hubungan di antara taxa (Dharmayanti, 2011).

Sejarah evolusi organisme dapat diidentifikasi dari perubahan karakternya.

Karakter yang sama adalah dasar untuk menganalisis hubungan satu spesies

dengan spesies lainnya. Selanjutnya Filogenetika diartikan sebagai model untuk

merepresentasikan sekitar hubungan nenek moyang organisme, sekuen molekul

atau keduanya (Brinkman & Leipe, 2001). Salah satu tujuan dari penyusunan

filogenetika adalah untuk mengkonstruksi dengan tepat hubungan antara

organisme dan mengestimasi perbedaan yang terjadi dari satu nenek moyang

kepada keturunanmya. Menurut Hidayat dan Pancoro (2006), terdapat tiga tahap

yang dilakukan dalam melakukan proses analisis filogenetika molekuler, yaitu

sequence alignment, rekonstruksi pohon filogenetika, dan evaluasi pohon

filogenetika dengan uji statistik.

2.7.1 Sequence alignment

Tahap ini merupakan tahap penentuan tingkat homolog dari satu sekuen

DNA atau protein dengan pembanding lainnya. Tahap ini melibatkan dua sekuen

40

yang homolog disebut pairwise alignment, sedangkan yang melibatkan banyak

sekuen yang homolog disebut multiple alignment. Keberhasilan analisis

filogenetika sangat tergantung kepada akurasi proses alignment. Pada tahap

alignment sering ditemukan adanya gap, yang ditandai oleh garis putus-putus.

Gap terjadi karena adanya insersi dan atau delesi. Dharmayanti (2011)

menyatakan dalam prakteknya, gap bisa dianggap sebagai data yang hilang,

walaupun dalam banyak kasus gap dapat dilibatkan dalam analisis karena bisa

bersifat informatif.

2.7.2 Rekonstruksi pohon Filogenetika

Membangun sebuah pohon filogenetika berdasarkan karakter dari urutan

nukleotida atau asam amino secara langsung dalam rekonstruksi pohon, dapat

menggunakan empat metode yaitu Distance method (DM), Maximum Likelihood

(ML), Bayessian Inference (BI), dan Maximum parsimony (MP).

Empat metode Maximum parsimony (MP) sangat sering dipilih, antara lain

karena pohon yang dibentuk lebih menggambarkan perubahan evolusioner yang

terjadi setiap waktu, mengandung asumsi bahwa proses evolusi akan menempuh

jalan yang paling singkat (parsimonious), dan perhitungan relatif lebih sederhana

dan cepat dengan tingkat realibilitas yang tinggi.

2.7.3 Evaluasi Pohon Filogenetika

Evaluasi pohon filogeni ini bertujuan untuk memastikan tingkat

kepercayaan dari pohon tersebut. Proses ini dilakukan dengan menerapkan

beberapa metode yaitu Interior branch test (IB) dan Felsentein's bootstrap test

41

(FB). Evaluasi pohon dilakukan menggunakan analisis bootsrap sebanyak 1.000

ulangan, dimana sebuah set dari site basa nukleotida diambil secara acak dan

dilakukan secara berulang, kemudian dilakukan konsensus, sehingga hanya satu

pohon filogenetika yang dihasilkan. Pada dasarnya pola perubahan basa

nukleotida sangat rumit dan sering berubah sejalan dengan waktu evolusi,

sehingga metode Felsentein's bootstrap test (FB) sangat baik digunakan dalam

mengevaluasi pohon filogenetika (Hidayat & Pancoro, 2006).

Saat ini terdapat dua program komputer utama yang sering digunakan

untuk merekonstruksi pohon filogenetika, yaitu PAUP dan MrBayes. PAUP

(Phylogeny Analysis of Using Parsimony) merupakan paket yang menyediakan

banyak program untuk menyelesaikan berbagai aspek dalam analisis filogenetika

molekuler. Paket tersebut terdiri dari program untuk menyusun format data sikuen

DNA atau protein, untuk merekonstruksi pohon filogenetika (berdasarkan metode

parsimoni), dan untuk evaluasi pohon filogenetika. Perlu dicatat bahwa program

PAUP dapat me-run set data selain molekuler, misalnya morfologi. Program

PAUP dapat dijalankan baik dengan menggunakan komputer ber-OS (operating

system) Macintosh dan Windows. Seperti program PAUP, MrBayes merupakan

program multifungsi untuk merekonstruksi pohon filogenetika (berdasarkan

metode Bayesian), tetapi program ini dibuat khusus hanya untuk set data

molekuler (Hidayat & Pancoro, 2006).