BAB 4

METODOLOGI PENELITIAN

4.1 Jenis Penelitian

Jenis penelitian yang digunakan adalah penelitian eksperimental laboratorium

secara in vitro

4.2. Desain penelitian

Penelitian ini dirancang dengan menggunakan metode Post test only control

group design.

4.3 Tempat Penelitian

Penelitian akan dilakukan di Laboratorium Riset Terpadu UGM, Jogjakarta

4.4 Sampel Penelitian

Dalam penelitian ini digunakan Cell-line Oral Squamous Cell Carcinoma

(OSCC) HSC-3

4.5 Variabel Penelitian

4.5.1 Variabel bebas

Konsentrasi ekstrak etanol kulit buah manggis

4.5.2 Variabel terikat

Aktifitas apoptosis sel kanker

4.5.3 Variabel terkendali

Metode kerja, alat dan bahan, media perbenihan, jumlah sel kanker pada well

30

4.6 Definisi Operasional

1. Ekstrak etanol kulit buah manggis di dalamnya terkandung xanthone yang

berperan dalam menginduksi terjadinya apoptosis sel kanker. Ekstrak kulit

buah manggis diambil dengan menggunakan pelarut etanol 70% dengan

metode ekstraksi perkolasi. Dalam penelitian akan dipakai konsentrasi

sebesar 6,25 µg/mL, 12,5 µg/mL, 25 µg/mL, 50 µg/mL, dan 100 µg/mL.

2. Aktifitas apoptosis sel kanker menunjukkan seberapa besar kekuatan

ekstrak kuliat buah manggis dalam menginduksi terjadinya apoptosis pada

sel karsinoma sel skuamosa. Aktifitas apoptosis pada sel kanker diamati

dengan Annexin V-FITC Apoptosis Kit dan dianalisis dengan flow

cytometer.

3. Jumlah sel kanker pada tiap well yaitu 10.000 sel / well.

4.7 Besar Sampel

Untuk menghitung besar sampel, dihitung berdasarkan rumus replikasi yaitu:

(t-1) (r - 1) ≥ 15

(6-1) (r-1) ≥ 15

5 (r-1) ≥ 15

(r-1) ≥ 3

r ≥ 4

Keterangan:

t: banyaknya taraf perlakuan

r: banyaknya replikasi (ulangan)

31

Dalam penelitian ini akan dilakukan replikasi sebanyak 4 kali setiap

perlakuan.

4.8 Alat dan Bahan

4.8.1 Alat

1. Multi-channel pipette

2. 37°C incubator

3. Laminar flow hood

4. Microtiter plate (flat-bottomed)

5. Tabung konikal (5ml)

6. Serological pipette

7. Steril pipette tips: yellow tips, white tips, and blue tips

8. 96-well plate

9. Centrifuge

10. Flow cytometer

4.8.2 Bahan

1. Cell-line Oral Squamous Cell Carcinoma HSC-3

2. Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit

4. Ekstrak kulit buah manggis dengan konsentrasi 6,25 µg/mL, 12,5 µg/mL,

25 µg/mL, 50 µg/mL, dan 100 µg/mL

3. Dimethyl Sulfoxide (DMSO)

4. Medium dasar untuk kultur OSCC: DMEM, 10% Fetal Bovine Serum

(FBS), 400 µL penicillin-streptomycin GIBCO

32

4.9 Cara Kerja

4.9.1 Pembuatan Ekstrak Kulit Manggis (Perkolasi)

Bahan kulit manggis dikeringkan dan dihaluskan dengan blender kemudian

diayak sehingga didapatkan serbuk. Kemudian serbuk dibasahi dengan 2,5

bagian sampai 5 bagian cairan penyari (etanol 70%). Setelah itu, masa

dipindahkan ke dalam perkolator sambil ditekan dengan hati-hati, kemudian

dituangi dengan cairan penyari sampai cairan mulai menetes hingga di atas

simplisia masih terdapat selapis cairan penyari, perkolator ditutup dan dibiarkan

24 jam. Setelah 24 jam, keran perkolator dibuka dan cairan dibiarkan menetes

dengan kecepatan 1ml/menit. Lalu ditambahkan cairan penyari berulang-ulang

hingga didapatkan 200 mg perkolat. Perkolat disuling/diuapkan hingga tidak

meninggalkan sisa dengan tekanan rendah pada suhu tidak lebih 50oC sampai

mencapai konstan yang dikehendaki. Kemudian 0,8 bagian perkolat dipisahkan

dari perkolat I, kemudian diuapkan hingga diperoleh 0,2 bagian. Terakhir, 0,2

bagian terakhir dicampur dengan perkolat I.

4.9.2 Kultur Sel

Cell-line sel kanker OSCC HSC-3 yang berasal dari dasar mulut dikultur dan

direplikasi dengan Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) GIBCO

dengan 4,5 g/L D-glucose dan L-glutamine ditambah dengan 10% Fetal Bovine

Serum (FBS) dan 400 µL penicillin-streptomycin GIBCO (10.000 unit/mL

penicillin G sodium dan 10.000 µg/mL streptomycin sulfate) pada suhu 37°C

dan 5% CO2.

33

4.9.3 Apoptosis

Apoptosis dianalisis menggunakan Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit.

Sebanyak 5.000 sel kanker OSCC, baik kelompok kontrol maupun kelompok

perlakuan, disentrifugasi. Set ditripsinasi dan dicuci satu kali dengan media yang

mengandung serum. Kemudian, binding buffer 1x yang ada pada Annexin V-

FITC Apoptosis Detection Kit ditambahkan sebanyak 500 µL pada sel yang telah

disentrifugasi. Annexin V-FITC dan propidium iodide masing-masing sebanyak

5 µL ditambahkan ke dalam suspensi sel dan diinkubasi selama 5 menit pada

suhu ruangan dalam keadaan ruang gelap. Kemudian, suspensi sel dianalisa

dengan FITC signal detector (FL1) dan PI staining by the phycoerythrin

emission signal detector (FL2) menggunakan flow cytometry (Ex= 488 nm; Em=

530 nm).

34

4.10 Alur Penelitian

35

Perhitungan kepadatan sel

Sel OSCC HSC-3 siap digunakan

Sterilisasi

Pembuatan media

Persiapan ekstrak kulit manggis

Pengenceran ekstrak dengan DMSO

Ekstrak kulit manggis dengan konsentrasi

6,25 µg/mL, 12,5 µg/mL, 25 µg/mL, 50 µg/mL, dan 100 µg/mL

Preparasi sel

Penumbuhan sel

Pemanenan sel

Inokulasi cell-line HSC-3 sebanyak 10.000 sel pada tiap

well dan ditambah dengan ekstrak kulit manggis, dan

diinkubasikan selama 48 jam pada suhu 37 °C dan 5% CO2

Analisis aktifitas apoptosis menggunakan Annexin V-FITC

Apoptosis Detection Kit

Analisa data

Terdapat 5 kelompok perlakuan dan 1 kelompok kontrol dalam eksperimen

ini, cell line OSCC diinokulasikan ke dalam well sebanyak 10.000 sel/well. Untuk

tiap kelompok perlakuan dan kontrol dilakukan 4 replikasi.

Kelompok kontrol

Kontrol: 4 well yang berisi cell line OSCC sebanyak 10.000 sel/well

Kelompok perlakuan

Perlakuan 1: Ekstrak kulit buah manggis dengan konsentrasi 6,25 µg/mL

ditambahkan ke dalam 4 well yang berisi cell line OSCC sebanyak 10.000 sel/well.

Perlakuan 2: Ekstrak kulit buah manggis dengan konsentrasi 12,5 µg/mL

ditambahkan ke dalam 4 well yang berisi cell line OSCC sebanyak 10.000 sel/well.

Perlakuan 3: Ekstrak kulit buah manggis dengan konsentrasi 25 µg/mL ditambahkan

ke dalam 4 well yang berisi cell line OSCC sebanyak 10.000 sel/well.

Perlakuan 4: Ekstrak kulit buah manggis dengan konsentrasi 50 µg/mL ditambahkan

ke dalam 4 well yang berisi cell line OSCC sebanyak 10.000 sel/well.

Perlakuan 5: Ekstrak kulit buah manggis dengan konsentrasi 100 µg/mL ditambahkan

ke dalam 4 well yang berisi cell line OSCC sebanyak 10.000 sel/well.

4.11 Analisa Data

Awalnya distribusi data dites menggunakan Kolmogorov-smirnov. Apabila

didapatkan distribusi data yang normal, dilanjutkan dengan pengolahan data

menggunakan One-way Anova untuk mengetahui apakah ada perbedaan yang

signifikan antar kelompok, baik kelompok kontrol maupun kelompok perlakuan.

Apabila distribusi data tidak normal, maka pengolahan data menggunakan Kruskal-

36

Wallis untuk mengetahui apakah ada perbedaan yang signifikan antar kelompok, baik

kelompok kontrol maupun kelompok perlakuan.

37