bab 1-2 @ fin
TRANSCRIPT
BAB 1
PENDAHULUAN
1.1. Latar belakang
Kanker payudara adalah jenis kanker yang paling banyak diderita
dan penyebab kematian tertinggi akibat kanker pada wanita di seluruh dunia.
WHO memperkirakan 8-9% wanita di dunia akan mengalami kanker
payudara. Tahun 2008 dilaporkan terjadi sekitar 1,3 juta kasus baru (250.000
kasus terdiagnosa di Eropa dan kurang lebih 175.000 di AS), dan terdapat
458.000 kematian akibat kanker payudara. Perkiraan di tahun yang sama 1
dari 8 wanita di USA berisiko terkena kanker payudara. Perkiraan insiden di
Eropa sekitar 109.8/100000 dan mortalitasnya 28.4/100000. National Cancer
Institute dalam program SEER (Survailance Epidemiology and End Result)
memperkirakan bahwa pada tahun 2012 ini akan terdiagnosa kanker payudara
sebanyak 226.870 wanita dengan 39.510 wanita akan meninggal karena
kanker payudara.1-3
Data di Indonesia menunjukkan pada kurun waktu 1988-1991 kanker
payudara menduduki urutan kedua sebagai jenis kanker terbanyak pada
wanita. Sistem Informasi Rumah Sakit Departemen Kesehatan RI tahun 2007,
menyatakan insiden kanker payudara 26/100.000 dan menjadi urutan
pertama pasien rawat inap di RS di Indonesia (16,85%) disusul kanker leher
rahim (11,78%). 3,4
1
Periode beberapa tahun terakhir ini menunjukkan insiden kanker
secara umum cenderung menurun, baik pada pria (1,3% per tahun dari 2000
sampai 2006) dan wanita (0,5% per tahun dari 1998 sampai 2006), di mana
penurunan ini juga terjadi pada 3 jenis kanker terbanyak pada pria (paru,
prostat, dan kolorektal) dan 2 jenis kanker terbanyak pada wanita (payudara
dan kolorektal). Perkembangan ini menunjukkan kecenderungan penurunan
insidensi, angka mortalitas dan perbaikan harapan hidup, tetapi kanker tetap
menjadi penyakit penyebab kematian yang lebih tinggi daripada gangguan
jantung pada kelompok usia di bawah 85 tahun. 5,6
Faktor yang berperan akan hal tersebut antara lain yaitu modalitas
terapi kanker yang ada sampai saat ini belum mampu secara optimal untuk
menghilangkan sel kanker dengan sempurna. Penelitian yang terus menerus
dilakukan belum mencapai level terapi yang memuaskan untuk mengatasi
kanker termasuk kanker payudara.7
Penelitian terkini tentang strategi pengobatan kanker memberikan
kecenderungan fokus pada proses angiogenesis tumor. Angiogenesis
tumor yang merupakan suatu proses regulasi dari ketersediaan jaringan
pembuluh darah untuk pertumbuhan kanker, saat ini adalah salah satu target
kunci dari terapi kanker payudara. Formasi pembuluh darah baru diperlukan
untuk pertumbuhan dan invasivitas tumor primer dan memainkan peranan
penting untuk proses metastasis.7,8
2
Stimulan dalam proses angiogenesis di antaranya adalah VEGF.
Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) atau faktor pertumbuhan
pembuluh darah adalah protein yang merangsang pertumbuhan, daya tahan
dan penggandaan sel pembuluh darah. VEGF berperan penting dalam proses
angiogenesis dalam pembentukan pembuluh darah baru, meningkatkan
pemeliharaan pembuluh darah dan memastikan sel darah dapat bertahan
hidup, serta berperan dalam perpindahan sel untuk mencegah proses kematian
sel secara normal (apoptosis).VEGF yang berlebihan berhubungan dengan
memburuknya perjalanan penyakit kanker kolorektal, payudara, ginjal, rahim,
prostat dan otak. Perkembangan monoklonal antibodi untuk menghambat
VEGF menghasilkan angka penurunan volume massa tumor secara signifikan
pada model binatang. Strategi anti-VEGF atau anti-angiogenesis merupakan
suatu pendekatan terapi yang rasional dan logis dalam mengobati kanker.8,9
Thymoquinone merupakan agent yang saat ini banyak mendapat
focus penelitian tentang anti angiogenesis. Literatur tentang mekanisme kerja
dan kemampuan untuk menginduksi apoptosis dan menghambat pertumbuhan
tumor dari molekul thymoquinone pada model preklinik menunjukkan bahwa
thymoquinone mempunyai efek anti inflamasi, menghambat proliferasi sel
tumor melalui modulasi sinyal apoptosis, dan menghambat proses
angiogenesis. Thymoquinone merupakan salah satu komponen aktif dari
Nigella sativa, sejenis tanaman yang mengandung nutrisi penting dan obat
alami untuk berbagai macam penyakit pada bidang pengobatan kuno antara
lain Unani, Ayurveda, China dan Arab. Efek farmakologi yang telah
3
teridentifikasi dari Nigella sativa adalah stimulasi imun, anti inflamasi,
antihipertensi, anti asma, antimikroba, antiparasit, antioksidan dan antikanker.
Studi anti kanker dari Nigella sativa dilakukan secara in vitro menunjukkan
efek sitotoksik , proteksi terhadap jaringan normal dari efek obat anti kanker,
antioksidan, induksi apoptosis. 10-17
Pengembangan penelitian dalam strategi terapi anti kanker dengan
meneliti hubungan antara thymoquinone dengan ekspresi VEGF diharapkan
dapat memperjelas mekanisme antiangiogenesis dari thymoquinone yang
terkandung dalam Nigella sativa. 8
1.2. Rumusan masalah
Rumusan masalah berdasarkan latar belakang yang telah disampaikan adalah:
1.2.1. Apakah terdapat perbedaan ekspresi VEGF sel adenokarsinoma mama
mencit C3H pada kelompok yang diberi ekstrak Nigella sativa dosis
bertingkat?
1.2.2. Apakah terdapat perbedaan ukuran tumor adenokarsinoma mama
mencit C3H pada kelompok yang diberi ekstrak Nigella sativa dosis
bertingkat?
1.2.3. Apakah terdapat hubungan antara ekspresi VEGF dengan ukuran
tumor adenokarsinoma mama mencit C3H pada kelompok yang diberi
ekstrak Nigella Sativa dosis bertingkat.
4
1.3. Tujuan penelitian
1.3.1. Tujuan Umum:
Membuktikan adanya pengaruh pemberian ekstrak Nigella sativa
terhadap ekspresi VEGF dan ukuran tumor jaringan adenokarsinoma
mama serta hubungan antara ekspresi VEGF tersebut dengan ukuran
tumor pada mencit C3H yang diberi dosis bertingkat dengan yang
tidak secara in vivo.
1.3.2. Tujuan Khusus:
1.3.2.1. Membuktikan adanya perbedaan ekspresi VEGF sel
adenokarsinoma mama mencit C3H pada kelompok yang
diberi ekstrak Nigella sativa dosis bertingkat.
1.3.2.2. Membuktikan adanya perbedaan ukuran tumor
adenokarsinoma mama mencit C3H pada kelompok yang
diberi ekstrak Nigella sativa dosis bertingkat.
1.3.2.3. Membuktikan adanya hubungan antara ekspresi VEGF
dengan ukuran tumor adenokarsinoma mama mencit C3H
pada kelompok yang diberi ekstrak Nigella sativa dosis
bertingkat.
5
I.4. Manfaat penelitian
Hasil dari penelitian ini diharapkan dapat mengetahui efek
pemberian dosis bertingkat ekstrak Nigella Sativa terhadap ekspresi VEGF
dan ukuran tumor, sebagai salah satu suplemen terapi kanker dalam rangka
mengoptimalkan strategi pengobatan kanker payudara.
1.5. Orisinalitas
Penulis Judul / penerbit Hasil
Banerje, Padye Review on molecular and therapeutic
potential of thymoquinone in cancer
Nutr Cancer. 2010;62(7):938-46
Thymoquinone mempunyai efek anti
inflamasi, menghambat proliferasi sel
tumor melalui modulasi sinyal apoptosis,
dan menghambat proses angiogenesis.
Hidayat T Efek Nigella sativa terhadap indeks
mitosis dan ukuran massa tumor pada
adenokarsinoma mencit C3H.(master
thesis). Semarang, Qld:Universitas
Diponegoro;2011.
Pemberian dosis bertingkat Nigella sativa
menurunkan indeks mitosis dan ukuran
massa tumor.
Haryanto C Efek Nigella sativa terhadap NK cell dan
ukuran massa tumor pada
adenokarsinoma mencit C3H. (master
thesis). Semarang, Qld: Universitas
Diponegoro;2012.
Pemberian dosis bertingkat Nigella sativa
meningkatkan NK cell dan menurunkan ukuran
massa tumor.
Ravindran J Thymoquinone poly (lactide-co- Thymoquninone dalam formulasi nanopartikel,
6
glycolide) nanoparticles exhibit
enhanced anti-proliferative, anti-
inflammatory,and chemosensitization
potential. Biochem Pharmacol. 2010 Jun
1;79(11):1640-7.
lebih aktif mensupresi VEGF dibanding
thymoquinone biasa
Tabel.1.Orisinalitas penelitian
Orisinalitas penelitian ini dibanding dengan penelitian dengan obyek Nigella
sativa terdahulu:
1. Variabel yang diukur pada penelitian ini adalah ekspresi VEGF dan ukuran
tumor.
2. Penelitian ini mencari apakah terdapat hubungan antara ekspresi VEGF
dengan ukuran tumor.
BAB II
7
TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Nigella sativa
Nigella sativa merupakan salah satu spesies dari genus Nigella yang
memiliki kurang lebih 14 spesies tanaman yang termasuk dalam famili
Ranunculaceae diantaranya adalah : Nigella ciliaris, Nigella damascena,
Nigella hispanica, Nigella integrifolia, Nigella nigellastrum, Nigella orientalis,
dan Nigella sativa.18
Tanaman ini berasal dari Eropa Selatan, Afrika Utara, dan Asia
Selatan. Nama lain Nigella sativa diantaranya adalah : Kalonji (bahasa Hindi),
Kezah (Hebrew), Chamushka (Rusia), Habbatus Sauda’ (Arab), Siyah daneh
(Persian), Fennel Flower / Black Carraway / Nutmeg Flower / Roman
Coriander / Black Onian Seed (English), atau Jintan Hitam (Indonesia).19
Gambar 1. Tanaman Nigella sativa
Dikutip : http//commons.wikimedia.org.
8
Gambar 2. Jintan hitam
Dikutip dari : http//www.trustpass.alibaba.com
Biji Nigella sativa berwarna hitam pekat. Memiliki rasa pahit yang
tajam dan bau seperti buah strawberry. Digunakan terutama pada permen dan
minuman keras. Kandungan kimia jintan hitam terdiri dari minyak atsiri,
minyak lemak, d-limonena, simena, glukosida, saponin, zat pahit, jigelin,
nigelon, dan thymoqinone. Khasiat yang dimiliki jintan hitam ini berasal dari
kandungan kimia yang ada di dalamnya. Biji Nigella sativa mengandung baik
minyak tetap (fixed oil) dan juga minyak esensial, protein, alkaloid dan
saponin. Sebagian besar aktivitas biologis biji ini telah terbukti disebabkan
oleh thymoquinone, komponen utama dari minyak atsiri. Aktivitas farmakologi
dari ekstrak mentah dari bijinya (dan beberapa kandungan aktif, misalnya
minyak atsiri dan thymoquinone) yang telah dilaporkan antara lain
perlindungan terhadap nefrotoksisitas dan hepatotoksisitas.20-22
Aktivitas farmakologi Nigella sativa berupa antiinflamasi, analgesik,
antipiretik, antimikroba dan antineoplastik dengan ciri khas berupa tingkat
toksisitas yang sangat rendah. Pemberian Nigella sativa terbukti tidak
9
menimbulkan efek samping yang signifikan terhadap fungsi hati ataupun
ginjal. Dosis toksik Nigella sativa dalam bentuk serbuk yang diuji pada kelinci
mempunyai batas yang tinggi yaitu 28 g/kg BB. Minyak produk ekstraksi dari
Nigella sativa juga sangat aman, peroral pada tikus, LD50: 28,8 ml/kg. 23
Paparan ekstrak Nigella sativa berkonsentrasi 120-380 μg/ml pada
beberapa jenis sel kanker manusia menunjukkan efek sitotoksik dan berakibat
kematian sel. Studi dengan ekstrak metanolik Nigella sativa terhadap
karsinoma Ehrlich menunjukkan efek sitotoksik 50% pada konsentrasi 1,5
μg/ml, limfoma pada 3 μg/ml dan sarkoma pada 1,5 μg/ml serta karsinoma
epidermal terhambat 60% pada konsentrasi 0,5 μg/ml.21,22
2.2.Thymoquinone
El-Dakhakhny et al. pada tahun 1963. pertama kali berhasil
mengisolasikan oleh Thymoquinone (TQ, C10H12O2, berat molekul: 164,2)
yang merupakan komponen bioaktif utama dari minyak atsiri jintan hitam
(Nigella sativa, famili Ranunculaceae) 22,23.
Thymoquinone menunjukkan efek penghambatan terhadap proliferasi
sel pada berbagai tipe jalur/mekanisme sel kanker. Thymoquinone menyasar
pada (target kerjanya pada) reseptor androgen dan transkripsi faktor E2F-1 dan
menghambat hormon-refrakter kanker prostat 21-24.
LD50 thymoquinone peroral adalah 1000 mg/kg dan intraperitoneal 100
mg/kg. Pengujian toksisitas akut dan subkronik thymoquinone pada mencit,
10
peroral akut LD50 (95% CL) adalah 2.4 g/kg (1.52-3.77). Thymoquinone
diberikan intraperitoneal pada mencit/tikus LD50 bervariasi mulai 10 mg/kg -
90,3 mg/kg. Tanda toksisitas berupa hipoaktif dan kesulitan bernapas. 20-24
Efek manfaat dari penggunaan biji ini dan thymoquinone berkaitan
dengan kemampuan sitoprotektif dan antioksidan. Minyaknya menurunkan
tekanan darah dan meningkatkan respirasi. Perlakuan terhadap tikus coba
dengan ekstrak biji sampai 12 minggu telah dilaporkan dapat menginduksi
perubahan haemogram yang mencakup peningkatan baik packed-cell volume
(PCV) maupun hemoglobin (Hb), dan penurunan konsentrasi kolesterol,
trigliserida dan glukosa di dalam plasma. 23
Gambar.3.-Isopropyl-5-methylbenzo-1,4-quinone (thymoquinone)
Dikutip dari Amin A 22
2.3. Vascular endothelial growth factor (VEGF)
VEGF disebut juga vascular permeability factor (VPF) di mana ini
mempunyai peranan inti pada perkembangan fisiologi dan patologi
neovaskularisasi. VEGF/VPF dideteksi sebagai faktor sekresi oleh sel tumor ke
11
media kultur jaringan atau cairan asites secara in vivo. Faktor ini dikenal sebagi
protein pengikat heparin, dengan berat molekul 34-42kD. VEGF juga
menstimulasi pembelahan sel endotel.25
Analisa dasar asam amino dan komplemen urutan DNA, saat ini diketahui
bahwa VEGF dan VPF adalah protein yang sama, dan VEGF saat ini adalah
terminologi yang umum dipakai untuk mendeskripsikan faktor angiogen.
VEGF adalah glikoprotein pengikat heparin yang bersifat homodimer yang ada
pada sedikitnya empat isoform dalam kaitannya dengan alternatif sambungan
transkripsi primer RNA messenger.26,27
Isoform tersebut didesain sebagai VEGF 121, VEGF 165, VEGF 189,
dan VEGF 205 sesuai dengan nomor asam amino di setiap isi protein.
Permeabilitas vaskuler yang diinduksi oleh VEGF/VPF adalah 50,000 kali dari
akibat induksi histamin yang merupakan standar induksi permeabilitas. Induksi
permeabilitas oleh VEGF memungkinkan difusi protein ke dalam intertistial di
mana terjadi migrasi sel endotel. Terdapat sedikitnya empat anggota lain dari
famili VEGF. VEGF yang telah diterangkan di awal adalah VEGF-A. VEGF –
B selain mempunyai peranan penting dalan vaskulogenesis juga mempunyai
fungsi lain seperti aktivasi enzim invasif pada sel endotel. VEGF-C umumnya
dihubungkan dengan limfangiogenesis, tetapi saat ini ekspresinya dihubungkan
dengan angiogenesis pada beberapa sistem. Peranan dari VEGF-D tidak terlalu
dapat diketahui dengan baik, tetapi protein ini dapat berikatan dengan VEGFR-
2 dan VEGFR-3 dan dapat menginduksi angiogenesis in vivo. Sedikit yang
12
diketahui dari VEGF- E kecuali protein ini dapat berikatan dengan VEGFR-2
dan dapat menginduksi mitosis sel endotel dan angiogenesis.28-30
Reseptor untuk VEGF diekspresikan pada sel endotel dan beberapa sel
tumor. Tiga reseptor VEGF/VPF yang telah teridentifikasi yaitu fms-like
tyrosine kinase -1(Flt-1) , fetal liver kinase 1 (Flk-1)/kinase insert domain
containing receptor (KDR) dan fms-like tyrosine kinase -4(Flt-4). Flk-1/KDR
adalah reseptor berafinitas tinggi dengan domain ekstraseluler yang berisi
domain immunoglobulin-like dan a split tyrosine kinase intracellular domain.
Reseptor ini mempunyai 85% homologi dengan homolog manusia. Flt-1 dan
Flk-1/KDR memperlihatkan peranan penting dalam sistem regulasi untuk
vaskulogenesis dan angiogenesis fisiologis. Interaksi VEGF/VPF dengan Flk-
1/KDR diketahui sebagai interaksi paling penting dalam angiogenesis tumor,
karena peranan esensialnya untuk induksi spektrum luas fungsi VEGF/VPF.
Blokade aktifitas VEGF/VPF yang dimediasi oleh Flk-1/KDR menunjukkan
aktifitas antiangiogenik.26-29
Konsentrasi oksigen yang berkurang mengindikasi diperlukannya
pembuluh darah tambahan untuk kelangsungan hidup tumor. Kondisi tersebut
meningkatkan ekspresi VEGF. Saat sel mengalami kekurangan oksigen akan
diproduksi hipoxia-inducible factor (HIF) yaitu sebuah transcription factor.
HIF akan berakumulasi dan berikatan dengan hypoxia-responsive element
(HRE). Aktivasi ini melibatkan beberapa signal transduction pathways,
termasuk phosphoinositide 3’kinase (PI3K), extracellular regulated kinase
(Erk) 1 / 2 dan jalur protein kinase C (PKC). VEGF dilepaskan dari sel dalam
13
bentuk ikatan homodimer disulfida terglikosilasi. VEGF memicu respon
seluler melalui ikatan pada reseptor tirosin kinase (VEGFRs) pada
permukaan sel, yang menyebabkan reseptor ini mengalami dimerisasi
menjadi aktif melalui transfosforilasi. 41,42
Gambar 4. Struktur molekul VEGF-VEGFR-1
Dikutip dari Ferrara N. 63
Peran penting VEGF terhadap buruknya prognosis pada kanker
payudara telah diketahui. Banyak studi mencatat adanya penurunan overall
survival dan disease free survival pada tumor dengan ekspresi VEGF yang
berlebih. Peningkatan ekspresi VEGF merupakan tahap awal metastasis,
yaitu tahap yang memerlukan pembuluh darah baru dan banyak.
Mekanisme pasti VEGF terhadap perkembangan tumor masih belum
jelas walaupun VEGF telah diketahui mempunyai korelasi dengan buruknya
survival.Inhibisi VEGF diharapkan mencegah terjadi formasi baru pembuluh
darah, serta strategi penghambatan pada Bcl-2 dengan menginduksi apoptosis
juga dapat mencegah sel endotel pembuluh darah tumbuh, akhirnya
menghambat perkembangan tumor dan metastasis,oleh karena itu inhibisi
14
angiogenesis tumor dengan menghambat aksi VEGF adalah strategi terapi
yang rasional. 41,42, 61
2.4. Perkembangan tumor
Proses keganasan dimulai di tingkat onkogen. Secara umum onkogen
tak dapat bergerak sendiri namun harus berkolaborasi dengan onkogen lain
atau dengan hilangnya sifat tumor suppressor. Setelah transformasi, sel-sel
ganas tumbuh dengan progresif dan tak terkontrol karena insensitif pada
sinyal antiproliferasi serta resisten terhadap apoptosis. Sel tumor menginvasi
stroma dan berkomunikasi dengan sel-sel stroma. Sel tumor dan sel induk
bersama-sama memicu pertumbuhan dan metastasis dengan cara
mengaktivasi jalur GF, melancarkan invasi dan angiogenesis. Sebagian besar
onkogen dapat dibagi menjadi empat kelas: faktor transkripsi, growth factors,
reseptor-reseptor, dan signal transducers. Sel tumor tersebut masih avaskular
dan nutrisi dipenuhi melalui difusi sederhana. 31-34,40
Mutasi gen yang meliputi gen antiapoptosis, gen proangiogenesis, dan
proinvasi dipicu oleh faktor transkripsi, faktor nuklear-κB (NF-κB). Faktor
transkripsi teraktivasi bila ada sitokin proinflamasi (TNF), virus, radiasi γ,
komponen dinding sel bakteri (lipopolysaccharide [LPS]), atau agent
kemoterapi. TNF, interleukin (IL-1ß, IL-6, IL-17, dan IL-18), chemokine (IL-
8 atau CXCL8) berperan penting untuk terbentuknya keganasan. Pada proses
TNF mengaktifkan NFκB, produksi VEGF bertambah dan meningkatkan
ekspresi reseptor VEGF yang akhirnya memicu angiogenesis. Makrofag
15
meruapakan penghasil TNF dan sitokin tersebut mengatur keseimbangan
angiogenesis saat perkembangan massa tumor. 35-39
VEGF yang dikeluarkan oleh sel tumor solid yang sedang tumbuh
diperlukan oleh suatu proses angiogenesis. Pembuluh darah baru sangat
diperlukan karena hanya tumor yang berjarak 100 µm dari pembuluh darah
yang dapat hidup. Sel induk melawan metastasis dengan tissue barriers,
mengirim sel imun untuk membunuh tumor, salah satunya adalah makrofag
dan menghambat angiogenesis. 31-37, 40
Terdapat beberapa tahapan yang merupakan suatu proses yang rumit
dalam rangka memunculkan pembuluh darah baru. Tahap pertama adalah
dicernanya membran basal yang mengelilingi pembuluh darah oleh protease
yang disekresi oleh sel endotel. Tahap kedua adalah migrasi sel endotel yang
bersirkulasi ke posisi formasi pembuluh darah, dimana mereka berproliferasi
untuk membentuk tonjolan pembuluh darah. Tahap ketiga adalah proliferasi
dan diferensiasi sel endotel untuk memperpanjang tonjolan dan membentuk
lumen pembuluh darah baru, akhirnya sel endotel mensekresi growth factors,
yang menarik sel pendukung seperti pericytes dan sel otot polos sehingga
terbentuk formasi membran basal. Pembuluh darah baru membentuk
bangunan spesial yang cocok untuk mensuplai jaringan atau organ. 41-44
Aktivitas angiogenik tingkat rendah dapat terdeteksi pada lesi
preneoplatik pada kanker payudara. Aktivitas ini makin progresif ketika
kanker menjadi tingkat neoplastik. Ekspresi VEGF, protein angiogenik,
meningkat karena respon dari hipoksia saat tumor semakin berkembang. 45
16
Apoptosis meruapakan proses kematian sel yang terprogram atau
progammed cell death bermanfaat untuk membuang sel yang tidak berguna
dan berbahaya. Apoptosis diregulasi oleh keluarga gen Bcl, yaitu
proapoptotik (Bax, Bcl-2 antagonist/killer [Bak], Bid, Bim) yang meningkat
serta yang antiapoptotik (Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-W) yang menurun juga tumor
supressor gene p53 yang termutasi. Fosfolipid yang merupakan suatu sinyal
akan dikeluarkan ke ekstraseluler pada membran selnya yang dapat dikenali
oleh sel imun, terutama makrofag. 46,47-49
Beberapa stimulasi yang dapat menginduksi apoptosis, seperti agen
kemoterapi, radiasi, panas, osmotic imbalance, dan nitric oxide (NO).
Bermacam jalur yang mengarah terjadinya apoptosis, yaitu jalur ekstrinsik,
jalur intrinsik, aktivasi kaskade caspase, dan jalur p53. 49-52
Apoptosis diinduksi oleh CTL dan sel-NK yang diinduksi baik oleh
nonsecretory induced, ligand-induced, dan secretory induced dengan
granzyme melalui perantaraan sekresi perforin. 40,53
Saat ini dikenal ± 14 jenis caspase. Dua pertiga dari seluruh jenis
caspase tersebut berperan penting dalam apoptosis. Caspase inisiator
2,8,9,10 diaktifkan oleh dimerisasi dan selanjutnya mengaktifkan caspase 3
dan 7. Caspase ini mentarget protein DNA repair system (seperti [ADP-
ribose]-polymerase [PARP]), protein strukturar/sitoskeletal (seperti lamin,
actin, cytokeratin, dll), dan onkoprotein (terutama protein Rb). Caspase juga
akan mengaktifkan DNAse yang menyebabkan fragmentasi DNA selama
apoptosis sehingga yang akan terjadi adalah melisutnya organel dan inti sel.
17
Proses apoptosis berbeda dengan nekrosis. Sel tidak pecah pada proses ini
sehingga tidak ada komponen intraseluler yang terdispersi ke ekstraseluler
dan mengakibatkan inflamasi seperti halnya proses nekrosis,47, 49,50,54
Proses aktifasi jalur caspase melalui suatu katalisator protease yaitu
FLICE (FADD-like IL-1 converting enzyme) yang terdiri dari FADD (Fas-
associated death domain), pada reseptor CD95/Fas, setelah kontak dengan
fas ligand. Caspase dapat pula diaktifkan oleh granzyme. Caspase juga aktif
melalui reseptor CD95/Fas terjadi bila kontak dengan fas ligand. Fas ligand
ini bisa berasal dari ekspresi protein antigen dari CTL, sitokin TNF, ataupun
metabolit ligand pada reseptor fas. Fas merupakan anggota reseptor tumor
necrosis factor (TNF) yang merupakan bagian jalur apoptosis ekstrinsik47,49
Proses apoptosis dengan jalur secretory induce caspase dilakukan
oleh CTL dan sel-NK dengan granula sitotoksiknya yang berisi protein pore-
forming perforin (cytolysin) dan enzim keluarga dari serine protease yang
disebut granzyme. Granzyme ini terdiri dari granzyme A, B, C, D, E, F, G, H,
K, dan M. Masuknya granzyme ke sitoplasma sel target bermula dari aktifitas
perforin pada sel target. Selanjutnya terjadi induksi apoptosis dengan
mengaktifkan secara langsung caspase dan fragmentasi DNA secara cepat
setelah masuk ke sitoplasma, 48, 55,54
Mitokondria berperan sentral untuk integrasi dan eksekusi bermacam-
macam sinyal apoptotik (misalnya hipoksia, hilangnya GF, kerusakan DNA)
dan menyediakan energi untuk membebaskan protein proapoptotik seperti
cytochrome C. Jalur intrinsik apoptosis menggunakan mitokondria. Keluarga
18
protein Bcl-2 berperan penting pada regulasi di jalur ini. Protein Bcl-2
teraktivasi menempel di membran luar mitokondria untuk membentuk kanal
konduksi, menyebabkan cytochrome C translokasi dari matriks intermembran
ke sitoplasma. Cytochrome bergabung dengan adenosine tri-phosphate
(ATP), apoptotic protease activating factor-1 (Apaf-1) dan procaspase 9
untuk membentuk apoptosome, yang mengaktifkan caspase 9 dan caspase 3
sehingga sel mati. Bax juga berperan penting di proses ini. 47,56
Kerusakan DNA seperti kerusakan double-strand setelah sel terpapar
radiasi, stres atau terkena zat kimiawi mengaktifasi protein p53 yang
merupakan faktor transkripsional. P53 meregulasi gen target seperti Bax dan
Bid. Siklus sel G1 terblok dengan aktivasi transkripsional oleh p53. Hal ini
mencegah pertumbuhan tumor melalui penghentian siklus sel atau induksi
apoptosis. 49,57
TNF merupakan mediator utama respon inflamasi yang menyebabkan
tumor nekrosis in vivo dan meregresi tumor, juga sitotoksik terhadap
beberapa sel normal maupun yang telah bertransformasi, dan memicu
imunitas. TNF adalah protein multifungsi berupa sitokin dan bersinergi
dengan VEGF. Target aktifitas TNF yang paling penting adalah sel endotel.
TNF meningkatkan ekspresi antigen major histocompatibility class I (MHC I
antigen) dan produksi faktor kemotaktik serta sitokin lain. TNF mengubah
fungsi pertahanan dan permeabilitas sel endotel.47
Reseptor dan ikatan dengan ligand diperlukan oleh TNF. Reseptor-
reseptor ini mengaktifkan protein intraseluler yang terkait dalam
19
menginduksi apoptosis. Terdapat dua reseptor TNF dengan berat molekul
55kD (disebut reseptor TNF tipe I [TNF-RI], atau reseptor p55) dan 75 kD
(disebut reseptor TNF tipe II [TNF-RII], atau reseptor p75). Molekul sinyal
di sitoplasma yang berisi death domain dan berperan dalam sinyal TNFR
adalah TNF receptor-associated death domains (TRADD), Fas-associated
death domain (FADD), dan receptor interacting protein (RIP). Tipe kedua
yang berperan dalam sinyal TNFR adalah keluarga molekul yang bernama
TNF receptor-associated factors (TRAFs). TRAFs segera mengaktifkan
faktor transkripsi, yaitu faktor nuklear κB (NF-κB) dan protein aktivasi 1
(AP-1). Saat sitokin berikatan dengan TNF-RI, terjadi rekrutmen protein
adaptasi yang mengaktifkan caspases dan memicu apoptosis. TRADD
kemudian berikatan dengan TNF-R1. Dalam hal ini, peran TNF dapat
bercabang kearah apoptosis atau respon inflamasi-ekspresi gen untuk protein-
protein agar dapat bertahan hidup. Hal ini dimulai pertama-tama saat
TRADD berikatan TNF-R1 tersebut. Kemudian death domain protein FADD
berikatan dengan TRADD dan FADD berikatan dengan caspase 8.
20
Gambar 5 : aktifasi TNFDikutip dari: Gen Ichiro 9
Caspase 8 memulai aktivasi cascade dari caspases sehingga terjadi
apoptosis. Jalur yang lain setelah TRADD berikatan dengan TNF-RI adalah
untuk mentranskripsi gen. TRAF-2 dan RIP-1 dan TRADD berikatan
sehingga kinases IκB aktif, fosforilasi IκB berjalan serta transkripsi gen NF-
κB dan AP-1 terjadi. Hal ini menyebabkan mediator-mediator inflamasi serta
protein-protein pertahanan hidup keluar.62
TNF-RII, merekrut protein-protein TRAFs, menuju domain
sitoplasmik reseptor tersebut. TNF-RII berperan dalam sitotoksisitas,
menghambat hematopoiesis awal dan proliferasi monosit.
TNF mengatur keseimbangan angiogenesis. Sewaktu TNF
mengaktifkan NFκB, produksi VEGF bertambah dan meningkatkan ekspresi
reseptor VEGF. TNF dan VEGF bekerja sama dalam formasi struktur mirip
kapiler selama angiogenesis. Namun TNF juga bersinergi menginduksi
endothelial cell tissue factor yang dapat menghambat perkembangan tumor
melalui aktivitas prokoagulan clot-promoting. TNF menghambat kemampuan
VEGF untuk mengaktifkan salah satu reseptor VEGF bila kondisi normal,
tidak dalam arah perkembangan tumor. 47,62
2.5.Thymoquinone sebagai agent anti pertumbuhan tumor
Thymoquinone menginduksi apoptosis pada jaringan kanker dengan
meningkatkan ekspresi gen apoptosis (caspase dan bax) dan menurunkan
ekspresi gen antiapoptosis (bcl2). Selain itu thymoquinone juga melakukan
21
deaktifasi jalur NFkappa B dengan menginduksi produksi sitokin sehingga
mengkontrol ekspresi onkogen. Senyawa ini juga mencegah enzim
dari kerusakan akibat lingkungan TNF α juga dapat disupresi oleh
thymoquinone.63-66
2.6.Adenokarsinoma mama
Adenokarsinoma mama mengacu pada jenis karsinoma yang
berasal dari jaringan glandular (sel dengan fungsi sekresi), dalam hal
ini duktus dan lobules dari payudara. Berdasarkan gambaran
histologis, World Health Organization (WHO) membuat klasifikasi
kanker payudara sebagai berikut:
1. Kanker payudara non invasif
2. Kanker payudara invasif
Sekitar 80% kanker payudara adalah yang merupakan varietas dari
adenokarsinoma duktus invasif. Terdapat juga beberapa jenis yang jarang yang
merupakan bentuk khusus dari adenokarsinoma mama yaitu sekitar
6%. inflammatory carcinoma berjumlah sekitar 1% sampai dengan 6% ,
medullary carcinoma 3%-5%. Mucinous carcinoma 3%, tubular carcinoma
1%-2%, dan cribriform carcinoma 5%-6%. dan papillary carcinoma sebesar
1% - 2%.74-77
22
Gambar 6. Histopatologi adenokarsinoma mama
Dikutip dari : http//www.conganat.org
Terdapat 3 faktor penting yang dapat dikaitkan dengan etiologi terjadinya kanker
payudara secara umum :
a. Faktor genetik
Kanker payudara yang diturunkan diketahui melibatkan gen
breast cancer susceptibility 1 (BRCA1) dan BRCA2.
Kerusakan deoxyribonucleic acid (DNA) dan kehilangan ekspresi
gen BRCA1/2 serta gen p53 karena mutasi dan menyebabkan
defek pada kontrol titik peralihan siklus sel.
b. Hormon
Risiko terkena kanker payudara lebih tinggi bila usia
menarche awal dan usia menopause lambat . Hal ini
dimungkinkan karena tingginya paparan hormon reproduksi
Produksi growth factor (GF) tergantung pada hormon estrogen.
Interaksi antara hormon di sirkulasi, reseptor hormon di sel
23
kanker dan GF autokrin merangsang sel kanker berubah menjadi
lebih progresif.
c. Faktor diet, kebiasaan hidup dan lingkungan.
Faktor ini terdiri dari alkohol, kopi, diet tinggi lemak dan
obesitas. Terdapat relasi linear antara konsumsi alkohol, kopi, diet
tinggi lemak yang berlebih serta obesitas terhadap tingginya
risiko terjadinya kanker payudara. 79
24
25
3.3. Hipotesis
26
3.3.1.Terdapat perbedaan ekspresi VEGF sel kanker payudara
Pada mencit C3H
yang diberi ekstrak Nigella
sativa dosis bertingkat
dibandingkan dengan yang tidak diberi ekstrak Nigella sativa.
. Terdapat perbedaan volume massa tumor pada kanker payudara mencit
C3H yang diberi ekstrak Nigella sativa dosis bertingkat dibandingkan
dengan yang tidak diberi ekstrak Nigella sativa.
27
BAB IV
METODE PENELITIAN
4.1. Rancangan Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratorik dengan desain
"Post test only control group design". Kelompok penelitian dibagi menjadi 4
yaitu kelompok kontrol (K), Perlakuan 1 (P1), Perlakuan 2 (P2) , Perlakuan 3
(P3) Adapun pembagian kelompok perlakuan adalah sebagai berikut:
K : Kelompok kontrol, mencit yang di inokulasi sel kanker.
P1 : Kelompok perlakuan 1, mencit yang di inokulasi sel kanker, setelah timbul
benjolan, mendapat NS0,175 mL/hari
P2 : Kelompok perlakuan 2, mencit yang di inokulasi sel kanker, setelah timbul
benjolan mendapat NS 0,36 mL/hari
P3 : Kelompok perlakuan 3, mencit yang di inokulasi sel kanker, setelah timbul
benjolan mendapat NS0,7 mL/hari
28
Skema penelitian yang dilakukan adalah sebagai berikut:
Gambar 7: Skema rancangan penelitian
4.2. Sampel Penelitian
Hewan coba adalah mencit strain C3H yang diperoleh dari Laboratorium
Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia.
Kriteria Inklusi :
a. Mencit betina berusia 6 bulan
b. Berat badan 20-30 gram setelah aklimatisasi dan
c. Tidak ada abnormalitas anatomis.
Kriteria Ekslusi :
a. Tidak tumbuh tumor setelah dilakukan inokulasi
b. Selama inokulasi dan perlakuan mencit tampak sakit (gerakan tidak aktif)
Besar sampel menurut WHO tiap kelompok minimal 5 ekor dengan
cadangan 10% tiap kelompok, pada penelitian ini jumlah sampel yang digunakan
tiap kelompok 6 ekor mencit.
29
Randomisasi: 24 mencit yang sudah berhasil diinokulasi dikelompokkan secara
random menjadi 4 kelompok yaitu:
Kelompok K : 6 mencit
Kelompok P1 : 6 mencit
Kelompok P2 : 6 mencit.
Kelompok P3 : 6 mencit
4.3. Waktu dan Lokasi Penelitian
Penelitian dan pengumpulan data dilakukan selama 2 bulan. Perlakuan
pada mencit dan proses pengambilan jaringan dilakukan di Laboratorium
Histologi FK Universitas Indonesia, proses pembuatan blok parafin sampai
pewarnaan dilakukan di Laboratorium Patologi Anatomi FK Universitas Gajah
Mada / RSUP Dr. Sardjito Yogyakarta.
4.4.Variabel Penelitian
4.4.1.Variabel bebas
Sebagai variabel bebas adalah pemberian dosis bertingkat ekstrak Nigella
sativa.
4.4.2. Variabel tergantung
Sebagai variabel tergantung adalah : ekspresi VEGF dan ukuran massa
tumor
30
4.4.3. Definisi operasional
1. Ekstrak Nigella sativa adalah ekstrak yang berasal dari biji Nigella sativa,
yang diekstraksi dengan pelarut etanol dengan menggunakan metoda
sokletasi diberikan dengan dosis bertingkat 0,175 mL/hari, 0,36 mL/hari
dan 0,7 mL/hari, hasil skala variabel : rasio
2. Ekspresi VEGF adalah ekspresi sel endotel pada jaringan tumor yg
terekspresi positif warna cokelat dinilai dengan skala kekuatan ekspresi
kuat, sedang, lemah dengan pengecatan imiunohistokimia yang diukur
secara visual oleh dua orang peneliti diambil dari preparat potongan masa
tumor pembesaran 400 x, pada 10 lapangan pandang, Skala variabel : rasio
1. Perkembangan massa tumor didapat dengan menghitung ukuran
diameter tumor menggunakan alat caliper tumor (CaliProR)
sebelum dan setelah pemberian ekstrak, diukur diameter terbesar
tumor. Satuan cm.Skala variabel : rasio
4.5.Bahan dan alat penelitian
4.5.1 Bahan untuk perlakuan
Hewan coba adalah mencit betina strain C3H dengan umur 6 bulan, dan
berat 20 - 30 gram. Mencit diperoleh dari Laboratorium Patologi Anatomi
Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. Selama percobaan, hewan coba
ditempatkan pada kandang dan diberi pakan dan minum secara ad libitum.
Sebelum perlakuan, mencit menjalani masa adaptasi selama 1 minggu.
31
Adenokarsinoma diperoleh dari mencit donor. Tumor yang mengandung
sel adenokarsinoma dari mencit donor akan ditransplantasikan ke mencit resipien.
Sebelum ditransplantasikan, tumor dari mencit donor akan diisi biopsi dan
dilakukan pemeriksaan histologi untuk mengkonfirmasi jenis tumornya.
Nigella sativa yang digunakan adalah Ekstrak Nigella sativa, diperoleh
dengan cara :
- 1 kg Nigella sativa yang telah dikeringkan ditumbuk halus, kemudian serbuk
dimasukkan ke dalam alat soklet (kapasitas 50mg) dan dilakukan ekstraksi
dengan cara sokletasi menggunakan pelarut etanol dengan siklus 8 – 10 kali.
- Hasil ekstrak dimasukkan dalam labu rotary evaporator dan dilakukan
destilasi vakum hingga menjadi pekat (suhu 40ºC).
- Ekstrak dikeringkan dalam oven dengan suhu 40ºC selama 1 jam untuk
menguapkan etanol.
- Didapatkan hasil 5,5mg ekstrak pada setiap 1 kg bahan (0,55%), dan hasil
ekstrak diencerkan dengan aquabidest.
Dosis yang digunakan adalah disetarakan dengan dosis yang telah digunakan
pada manusia yaitu dari serbuk biji 5 gram 1 x sehari 8, dikalikan konstanta uji
terapi pada hewan coba (mencit) yaitu 0,0026 20 dikalikan konstanta hasil
ekstrak 0,0055, sehingga dosis yang diberikan adalah 5000 x 0,0026 x 0,0055
= 0,0715 mg/hari (0,36 mL). Selain itu juga diberikan dosis 0,035mg (0,175
mL)/hari dan 0,14 mg (0,7 mL)/hari.
32
4.5.2. Bahan transplantasi jaringan tumor pada mencit
a. Alkohol 70 %
b. Larutan Garam fisiologik
c. Es batu
d. Mencit donor bertumor
e. Mencit resipien
4.5.3. Bahan untuk pemeriksaan histopatologi rutin
a. Formalin buffer 10%
b. Alkohol 50%, 70%, 80%, 96%, absolute, xylol
c. Parafin cair (Histoplast)
d. Albumin dan Poly-L-Lysine
e. Bahan pengecatan Hematosiklin eosin
f. Canada balsam dan Entelan
33
4.5.4. Alat transpalntasi jaringan tumor pada mencit
1. Cawan petri ukuran 6 Cm
2. Cawan petri ukuran 15 Cm
3. Cawan ukuran 10 Cm
4. Spuit 1cc
5. Jarum suntik trocar
Gunting bengkok 10 Cm
Alat fiksasi
Pinset anatomi 10 Cm
4.5.5. Alat untuk pengamatan dan dokumentasi sediaan adalah :
- 1 Unit Multi Head Microscope OlympusR
- NikonR Digital Net Camera DN 100 + SD Card
- 1 Unit Personal Computer Intel PentiumR Processor
- Alat caliper tumor (CaliProR)
4.6. Pelaksanaan penelitian
Cara perlakuan
Dua puluh empat ekor mencit betina strain C3H diadaptasi di laboratorium
dengan dikandangkan secara individual dan diberi ransum pakan standard
selama 1 minggu secara ad libitum.
Dua puluh empat ekor mencit tersebut kemudian diinokulasi tumor,
diamati selama 4 hari. Pada kelompok mencit yang berhasil diinokulasi
34
gagal
Berhasil
Mencit dibunuh setelah 3 minggu
24 ekor mencit adaptasi
Inokulasi tumor4 hari
random
K P1 P2P3
ekslusi
Jaringan tumor
Blok parafin
Pewarnaan HE
Inklusi :Mencit betina usia 6 bulan ,
BB 20-30 gram &abnormalitas anatomis(-).
dibagi menjadi 4 kelompok yang ditentukan secara acak. Masing-masing
kelompok dikandangkan secara individual dan mendapatkan pakan standar
yang sama dan minum ad libitum. Kemudian diberikan perlakuan,
perlakuan yang diberikan selama 3 minggu, dan pemberian ekstrak
dilakukan dengan pipet mikro.
Setelah perlakuan selesai, mencit di anaestesi dengan ether
selanjutnya mencit dibunuh dengan cara di dislokasi cervical-nya,
kemudian diambil jaringan tumor. Jaringan tumor diproses menjadi
preparat histologik setelah dibuat blok paraffin.
4.7. Alur kerja
4.8.Prosedur pemeriksaan
4.8.1. Prosedur transplantasi tumor
a. Mencit donor dimatikan dengan eter, kemudian diletakkan terlentang
pada tatakan / alas fiksasi dan keempat kakinya difiksasi dengan jarum.
35
Pewarnaan VEGF
b. Kulit dibagian yang bertumor diusap dengan alkohol 70 %, kemudian
dibuat sayatan dengan gunting lurus, untuk mengeluarkan tumor.
c. Tumor diletakkan di cawan petri kecil yang telah terlebih dahulu
dicuci dengan garam fisiologis dan diletakkan diatas es.
d. Amati bentuk dan keadaan tumor, kemudian ambil/potong jaringan
tumor yang masih baik yaitu bagian yang tanpa nekrosis (biasanya di
daerah tepi jika tumor besar) sebanyak kira-kira yang dapat
menghasilkan bubur tumor paling sedikit 1 ml dan taruh dicawan petri
kecil lainnya. Bersihkan dari jaringan ikat (simpai), jaringan nekrotik
dan darah, kemudian cacah/potong-potong sampai halus dengan
gunting hingga akhirnya terbentuk “bubur tumor” yang partikelnya
dapat melewati jarum trokar. Tambahkan garam fisiologis lebih kurang
sama banyak dengan volume tumor.
e. Bubur tumor disuntikkan subkutan di aksila kanan ke arah jalur susu
(milk streak) mencit dengan dosis 0,2 ml menggunakan spuit insulin
dengan ketepatan 10-1.
f. Sisa tumor yang padat dimasukkan ke dalam botol formalin untuk
dibuat sediaan mikroskopik.
g. Masing-masing mencit diberi nomor ditelinganya (lihat bagan) dan
dimasukkan ke dalam kandang berbeda yang diberi label berisi : jenis
kelompok perlakuan, tanggal transplantasi
36
4.8.2. Prosedur pembuatan preparat histopatologi
a. Fiksasi
Potongan adenokarsinoma dimasukkan dalam larutan formalin buffer
(larutan formalin 10% dalam buffer Natrium asetat sampai mencapai pH
7,0). Waktu fiksasi jaringan 18-24 jam. Setelah fiksasi selesai, jaringan
dimasukkan dalam larutan aquadest selama 1 jam untuk proses
penghilangan larutan fiksasi.
b. Dehidrasi
Potongan adenokarsinoma dimasukkan dalam alkohol koNigella
sativaentrasi bertingkat. Jaringan menjadi lebih jernih dan traNigella
sativaparan. Jaringan kemudian dimasukkan dalam larutan alkohol-xylol
selama 1 jam dan kemudian larutan xylol murni selama 2 x 2jam.
c. Impregnasi
Jaringan dimasukkan dalam paraffin cair selama 2x2 jam.
d. Embedding .
Jaringan ditanam dalam paraffin padat yang mempunyai titik lebur 56-
580C, ditunggu sampai paraffin padat. Jaringan dalam paraffin dipotong
setebal 4 mikron dengan mikrotom. Potongan jaringan ditempelkan pada
kaca obyek yang sebelumnya telah diolesi polilisin sebagai perekat.
Jaringan pada kaca obyek dipanaskan dalam incubator suhu 56-580C
sampai paraffin mencair.
e. Pewarnaan jaringan dengan VEGF
37
1. Xylol 1 menit 11. Air 15 detik
2. Xylol 2 menit 12. Alkohol 80% 15 detik
3. Xylol 2 menit 13. Alkohol 96% 30 detik
4. Alkohol 100% 2 menit 14. Alkhol 100% 45 detik
5. Alkohol 96% 2 menit 15. Xylol 1 menit
6. Alkohol 80% 2 menit 16. Xylol 1 menit
7. Air 1 menit
8. Mayer VEGF 7,5 menit
9. Air 7,5 menit
10. Eosin (0,5%)-Alkohol-Asam asetat 1 menit
4.9. Analisis data
Data hasil penelitian diolah dan disajikan dalam bentuk tabel dan
grafik. Analisa data meliputi uji hipotesis dan analisis deskriptif. Pada analisa
deskriptif jumlah limfosit, disajikan dalam bentuk tabel rerata, SD, median dan
grafik box plot. Apabila data berdistribusi normal dilakukan uji One Way Anova
untuk melihat adanya perbedaan pada kedua kelompok perlakuan. Besarnya
perbedaan masing-masing kelompok perlakuan dianalisis lebih lanjut dengan Post
Hoc Test Bonferroni dan Tamhane. Apabila data tidak berdistribusi normal
dilakukan uji Kruskal-Wallis untuk melihat adanya perbedaan pada kedua
kelompok perlakuan. Besarnya perbedaan masing-masing kelompok perlakuan
dianalisis lebih lanjut dengan Mann-Whitney U Test. Untuk melihat adanya
38
korelasi masing-masing variabel yang diukur, dianalisis dengan menggunakan uji
korelasi Pearson’s product moment (distribusi normal) atau Spearman’s rho
(distribusi tidak normal). Semua analisis statistik tersebut dilakukan dengan
menggunakan program komputer SPSS 10.05 for windows. Nilai signifikan
pada penelitian ini adalah apabila variabel yang dianalisis memiliki nilai p ≤
0,5.
4.10. Persyaratan Etik
Implikasi etik pada hewan, pengelolaan binatang coba pada penelitian
ini mengikuti animal ethics. Hal yang perlu dilaksanakan sesuai dengan etik
antara lain perawatan dalam kandang, pemberian makan minum (ad libitum),
aliran udara dalam ruang kandang, perlakuan saat penelitian, menghilangkan rasa
sakit, pengambilan unit analisis penelitian, dan pemusnahannya.
39