bab 1-2 @ fin

60
BAB 1 PENDAHULUAN 1.1. Latar belakang Kanker payudara adalah jenis kanker yang paling banyak diderita dan penyebab kematian tertinggi akibat kanker pada wanita di seluruh dunia. WHO memperkirakan 8-9% wanita di dunia akan mengalami kanker payudara. Tahun 2008 dilaporkan terjadi sekitar 1,3 juta kasus baru (250.000 kasus terdiagnosa di Eropa dan kurang lebih 175.000 di AS), dan terdapat 458.000 kematian akibat kanker payudara. Perkiraan di tahun yang sama 1 dari 8 wanita di USA berisiko terkena kanker payudara. Perkiraan insiden di Eropa sekitar 109.8/100000 dan mortalitasnya 28.4/100000. National Cancer Institute dalam program SEER (Survailance Epidemiology and End Result) memperkirakan bahwa pada tahun 2012 ini akan 1

Upload: hanif-hananta

Post on 30-Nov-2015

63 views

Category:

Documents


2 download

TRANSCRIPT

Page 1: BAB 1-2 @ fin

BAB 1

PENDAHULUAN

1.1. Latar belakang

Kanker payudara adalah jenis kanker yang paling banyak diderita

dan penyebab kematian tertinggi akibat kanker pada wanita di seluruh dunia.

WHO memperkirakan 8-9% wanita di dunia akan mengalami kanker

payudara. Tahun 2008 dilaporkan terjadi sekitar 1,3 juta kasus baru (250.000

kasus terdiagnosa di Eropa dan kurang lebih 175.000 di AS), dan terdapat

458.000 kematian akibat kanker payudara. Perkiraan di tahun yang sama 1

dari 8 wanita di USA berisiko terkena kanker payudara. Perkiraan insiden di

Eropa sekitar 109.8/100000 dan mortalitasnya 28.4/100000. National Cancer

Institute dalam program SEER (Survailance Epidemiology and End Result)

memperkirakan bahwa pada tahun 2012 ini akan terdiagnosa kanker payudara

sebanyak 226.870 wanita dengan 39.510 wanita akan meninggal karena

kanker payudara.1-3

Data di Indonesia menunjukkan pada kurun waktu 1988-1991 kanker

payudara menduduki urutan kedua sebagai jenis kanker terbanyak pada

wanita. Sistem Informasi Rumah Sakit Departemen Kesehatan RI tahun 2007,

menyatakan insiden kanker payudara 26/100.000 dan menjadi urutan

pertama pasien rawat inap di RS di Indonesia (16,85%) disusul kanker leher

rahim (11,78%). 3,4

1

Page 2: BAB 1-2 @ fin

Periode beberapa tahun terakhir ini menunjukkan insiden kanker

secara umum cenderung menurun, baik pada pria (1,3% per tahun dari 2000

sampai 2006) dan wanita (0,5% per tahun dari 1998 sampai 2006), di mana

penurunan ini juga terjadi pada 3 jenis kanker terbanyak pada pria (paru,

prostat, dan kolorektal) dan 2 jenis kanker terbanyak pada wanita (payudara

dan kolorektal). Perkembangan ini menunjukkan kecenderungan penurunan

insidensi, angka mortalitas dan perbaikan harapan hidup, tetapi kanker tetap

menjadi penyakit penyebab kematian yang lebih tinggi daripada gangguan

jantung pada kelompok usia di bawah 85 tahun. 5,6

Faktor yang berperan akan hal tersebut antara lain yaitu modalitas

terapi kanker yang ada sampai saat ini belum mampu secara optimal untuk

menghilangkan sel kanker dengan sempurna. Penelitian yang terus menerus

dilakukan belum mencapai level terapi yang memuaskan untuk mengatasi

kanker termasuk kanker payudara.7

Penelitian terkini tentang strategi pengobatan kanker memberikan

kecenderungan fokus pada proses angiogenesis tumor. Angiogenesis

tumor yang merupakan suatu proses regulasi dari ketersediaan jaringan

pembuluh darah untuk pertumbuhan kanker, saat ini adalah salah satu target

kunci dari terapi kanker payudara. Formasi pembuluh darah baru diperlukan

untuk pertumbuhan dan invasivitas tumor primer dan memainkan peranan

penting untuk proses metastasis.7,8

2

Page 3: BAB 1-2 @ fin

Stimulan dalam proses angiogenesis di antaranya adalah VEGF.

Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) atau faktor pertumbuhan

pembuluh darah adalah protein yang merangsang pertumbuhan, daya tahan

dan penggandaan sel pembuluh darah. VEGF berperan penting dalam proses

angiogenesis dalam pembentukan pembuluh darah baru, meningkatkan

pemeliharaan pembuluh darah dan memastikan sel darah dapat bertahan

hidup, serta berperan dalam perpindahan sel untuk mencegah proses kematian

sel secara normal (apoptosis).VEGF yang berlebihan berhubungan dengan

memburuknya perjalanan penyakit kanker kolorektal, payudara, ginjal, rahim,

prostat dan otak. Perkembangan monoklonal antibodi untuk menghambat

VEGF menghasilkan angka penurunan volume massa tumor secara signifikan

pada model binatang. Strategi anti-VEGF atau anti-angiogenesis merupakan

suatu pendekatan terapi yang rasional dan logis dalam mengobati kanker.8,9

Thymoquinone merupakan agent yang saat ini banyak mendapat

focus penelitian tentang anti angiogenesis. Literatur tentang mekanisme kerja

dan kemampuan untuk menginduksi apoptosis dan menghambat pertumbuhan

tumor dari molekul thymoquinone pada model preklinik menunjukkan bahwa

thymoquinone mempunyai efek anti inflamasi, menghambat proliferasi sel

tumor melalui modulasi sinyal apoptosis, dan menghambat proses

angiogenesis. Thymoquinone merupakan salah satu komponen aktif dari

Nigella sativa, sejenis tanaman yang mengandung nutrisi penting dan obat

alami untuk berbagai macam penyakit pada bidang pengobatan kuno antara

lain Unani, Ayurveda, China dan Arab. Efek farmakologi yang telah

3

Page 4: BAB 1-2 @ fin

teridentifikasi dari Nigella sativa adalah stimulasi imun, anti inflamasi,

antihipertensi, anti asma, antimikroba, antiparasit, antioksidan dan antikanker.

Studi anti kanker dari Nigella sativa dilakukan secara in vitro menunjukkan

efek sitotoksik , proteksi terhadap jaringan normal dari efek obat anti kanker,

antioksidan, induksi apoptosis. 10-17

Pengembangan penelitian dalam strategi terapi anti kanker dengan

meneliti hubungan antara thymoquinone dengan ekspresi VEGF diharapkan

dapat memperjelas mekanisme antiangiogenesis dari thymoquinone yang

terkandung dalam Nigella sativa. 8

1.2. Rumusan masalah

Rumusan masalah berdasarkan latar belakang yang telah disampaikan adalah:

1.2.1. Apakah terdapat perbedaan ekspresi VEGF sel adenokarsinoma mama

mencit C3H pada kelompok yang diberi ekstrak Nigella sativa dosis

bertingkat?

1.2.2. Apakah terdapat perbedaan ukuran tumor adenokarsinoma mama

mencit C3H pada kelompok yang diberi ekstrak Nigella sativa dosis

bertingkat?

1.2.3. Apakah terdapat hubungan antara ekspresi VEGF dengan ukuran

tumor adenokarsinoma mama mencit C3H pada kelompok yang diberi

ekstrak Nigella Sativa dosis bertingkat.

4

Page 5: BAB 1-2 @ fin

1.3. Tujuan penelitian

1.3.1. Tujuan Umum:

Membuktikan adanya pengaruh pemberian ekstrak Nigella sativa

terhadap ekspresi VEGF dan ukuran tumor jaringan adenokarsinoma

mama serta hubungan antara ekspresi VEGF tersebut dengan ukuran

tumor pada mencit C3H yang diberi dosis bertingkat dengan yang

tidak secara in vivo.

1.3.2. Tujuan Khusus:

1.3.2.1. Membuktikan adanya perbedaan ekspresi VEGF sel

adenokarsinoma mama mencit C3H pada kelompok yang

diberi ekstrak Nigella sativa dosis bertingkat.

1.3.2.2. Membuktikan adanya perbedaan ukuran tumor

adenokarsinoma mama mencit C3H pada kelompok yang

diberi ekstrak Nigella sativa dosis bertingkat.

1.3.2.3. Membuktikan adanya hubungan antara ekspresi VEGF

dengan ukuran tumor adenokarsinoma mama mencit C3H

pada kelompok yang diberi ekstrak Nigella sativa dosis

bertingkat.

5

Page 6: BAB 1-2 @ fin

I.4. Manfaat penelitian

Hasil dari penelitian ini diharapkan dapat mengetahui efek

pemberian dosis bertingkat ekstrak Nigella Sativa terhadap ekspresi VEGF

dan ukuran tumor, sebagai salah satu suplemen terapi kanker dalam rangka

mengoptimalkan strategi pengobatan kanker payudara.

1.5. Orisinalitas

Penulis Judul / penerbit Hasil

Banerje, Padye Review on molecular and therapeutic

potential of thymoquinone in cancer

Nutr Cancer. 2010;62(7):938-46

Thymoquinone mempunyai efek anti

inflamasi, menghambat proliferasi sel

tumor melalui modulasi sinyal apoptosis,

dan menghambat proses angiogenesis.

Hidayat T Efek Nigella sativa terhadap indeks

mitosis dan ukuran massa tumor pada

adenokarsinoma mencit C3H.(master

thesis). Semarang, Qld:Universitas

Diponegoro;2011.

Pemberian dosis bertingkat Nigella sativa

menurunkan indeks mitosis dan ukuran

massa tumor.

Haryanto C Efek Nigella sativa terhadap NK cell dan

ukuran massa tumor pada

adenokarsinoma mencit C3H. (master

thesis). Semarang, Qld: Universitas

Diponegoro;2012.

Pemberian dosis bertingkat Nigella sativa

meningkatkan NK cell dan menurunkan ukuran

massa tumor.

Ravindran J Thymoquinone poly (lactide-co- Thymoquninone dalam formulasi nanopartikel,

6

Page 7: BAB 1-2 @ fin

glycolide) nanoparticles exhibit

enhanced anti-proliferative, anti-

inflammatory,and chemosensitization

potential. Biochem Pharmacol. 2010 Jun

1;79(11):1640-7.

lebih aktif mensupresi VEGF dibanding

thymoquinone biasa

Tabel.1.Orisinalitas penelitian

Orisinalitas penelitian ini dibanding dengan penelitian dengan obyek Nigella

sativa terdahulu:

1. Variabel yang diukur pada penelitian ini adalah ekspresi VEGF dan ukuran

tumor.

2. Penelitian ini mencari apakah terdapat hubungan antara ekspresi VEGF

dengan ukuran tumor.

BAB II

7

Page 8: BAB 1-2 @ fin

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Nigella sativa

Nigella sativa merupakan salah satu spesies dari genus Nigella yang

memiliki kurang lebih 14 spesies tanaman yang termasuk dalam famili

Ranunculaceae diantaranya adalah : Nigella ciliaris, Nigella damascena,

Nigella hispanica, Nigella integrifolia, Nigella nigellastrum, Nigella orientalis,

dan Nigella sativa.18

Tanaman ini berasal dari Eropa Selatan, Afrika Utara, dan Asia

Selatan. Nama lain Nigella sativa diantaranya adalah : Kalonji (bahasa Hindi),

Kezah (Hebrew), Chamushka (Rusia), Habbatus Sauda’ (Arab), Siyah daneh

(Persian), Fennel Flower / Black Carraway / Nutmeg Flower / Roman

Coriander / Black Onian Seed (English), atau Jintan Hitam (Indonesia).19

Gambar 1. Tanaman Nigella sativa

Dikutip : http//commons.wikimedia.org.

8

Page 9: BAB 1-2 @ fin

Gambar 2. Jintan hitam

Dikutip dari : http//www.trustpass.alibaba.com

Biji Nigella sativa berwarna hitam pekat. Memiliki rasa pahit yang

tajam dan bau seperti buah strawberry. Digunakan terutama pada permen dan

minuman keras. Kandungan kimia jintan hitam terdiri dari minyak atsiri,

minyak lemak, d-limonena, simena, glukosida, saponin, zat pahit, jigelin,

nigelon, dan thymoqinone. Khasiat yang dimiliki jintan hitam ini berasal dari

kandungan kimia yang ada di dalamnya. Biji Nigella sativa mengandung baik

minyak tetap (fixed oil) dan juga minyak esensial, protein, alkaloid dan

saponin. Sebagian besar aktivitas biologis biji ini telah terbukti disebabkan

oleh thymoquinone, komponen utama dari minyak atsiri. Aktivitas farmakologi

dari ekstrak mentah dari bijinya (dan beberapa kandungan aktif, misalnya

minyak atsiri dan thymoquinone) yang telah dilaporkan antara lain

perlindungan terhadap nefrotoksisitas dan hepatotoksisitas.20-22

Aktivitas farmakologi Nigella sativa berupa antiinflamasi, analgesik,

antipiretik, antimikroba dan antineoplastik dengan ciri khas berupa tingkat

toksisitas yang sangat rendah. Pemberian Nigella sativa terbukti tidak

9

Page 10: BAB 1-2 @ fin

menimbulkan efek samping yang signifikan terhadap fungsi hati ataupun

ginjal. Dosis toksik Nigella sativa dalam bentuk serbuk yang diuji pada kelinci

mempunyai batas yang tinggi yaitu 28 g/kg BB. Minyak produk ekstraksi dari

Nigella sativa juga sangat aman, peroral pada tikus, LD50: 28,8 ml/kg. 23

Paparan ekstrak Nigella sativa berkonsentrasi 120-380 μg/ml pada

beberapa jenis sel kanker manusia menunjukkan efek sitotoksik dan berakibat

kematian sel. Studi dengan ekstrak metanolik Nigella sativa terhadap

karsinoma Ehrlich menunjukkan efek sitotoksik 50% pada konsentrasi 1,5

μg/ml, limfoma pada 3 μg/ml dan sarkoma pada 1,5 μg/ml serta karsinoma

epidermal terhambat 60% pada konsentrasi 0,5 μg/ml.21,22

2.2.Thymoquinone

El-Dakhakhny et al. pada tahun 1963. pertama kali berhasil

mengisolasikan oleh Thymoquinone (TQ, C10H12O2, berat molekul: 164,2)

yang merupakan komponen bioaktif utama dari minyak atsiri jintan hitam

(Nigella sativa, famili Ranunculaceae) 22,23.

Thymoquinone menunjukkan efek penghambatan terhadap proliferasi

sel pada berbagai tipe jalur/mekanisme sel kanker. Thymoquinone menyasar

pada (target kerjanya pada) reseptor androgen dan transkripsi faktor E2F-1 dan

menghambat hormon-refrakter kanker prostat 21-24.

LD50 thymoquinone peroral adalah 1000 mg/kg dan intraperitoneal 100

mg/kg. Pengujian toksisitas akut dan subkronik thymoquinone pada mencit,

10

Page 11: BAB 1-2 @ fin

peroral akut LD50 (95% CL) adalah 2.4 g/kg (1.52-3.77). Thymoquinone

diberikan intraperitoneal pada mencit/tikus LD50 bervariasi mulai 10 mg/kg -

90,3 mg/kg. Tanda toksisitas berupa hipoaktif dan kesulitan bernapas. 20-24

Efek manfaat dari penggunaan biji ini dan thymoquinone berkaitan

dengan kemampuan sitoprotektif dan antioksidan. Minyaknya menurunkan

tekanan darah dan meningkatkan respirasi. Perlakuan terhadap tikus coba

dengan ekstrak biji sampai 12 minggu telah dilaporkan dapat menginduksi

perubahan haemogram yang mencakup peningkatan baik packed-cell volume

(PCV) maupun hemoglobin (Hb), dan penurunan konsentrasi kolesterol,

trigliserida dan glukosa di dalam plasma. 23

Gambar.3.-Isopropyl-5-methylbenzo-1,4-quinone (thymoquinone)

Dikutip dari Amin A 22

2.3. Vascular endothelial growth factor (VEGF)

VEGF disebut juga vascular permeability factor (VPF) di mana ini

mempunyai peranan inti pada perkembangan fisiologi dan patologi

neovaskularisasi. VEGF/VPF dideteksi sebagai faktor sekresi oleh sel tumor ke

11

Page 12: BAB 1-2 @ fin

media kultur jaringan atau cairan asites secara in vivo. Faktor ini dikenal sebagi

protein pengikat heparin, dengan berat molekul 34-42kD. VEGF juga

menstimulasi pembelahan sel endotel.25

Analisa dasar asam amino dan komplemen urutan DNA, saat ini diketahui

bahwa VEGF dan VPF adalah protein yang sama, dan VEGF saat ini adalah

terminologi yang umum dipakai untuk mendeskripsikan faktor angiogen.

VEGF adalah glikoprotein pengikat heparin yang bersifat homodimer yang ada

pada sedikitnya empat isoform dalam kaitannya dengan alternatif sambungan

transkripsi primer RNA messenger.26,27

Isoform tersebut didesain sebagai VEGF 121, VEGF 165, VEGF 189,

dan VEGF 205 sesuai dengan nomor asam amino di setiap isi protein.

Permeabilitas vaskuler yang diinduksi oleh VEGF/VPF adalah 50,000 kali dari

akibat induksi histamin yang merupakan standar induksi permeabilitas. Induksi

permeabilitas oleh VEGF memungkinkan difusi protein ke dalam intertistial di

mana terjadi migrasi sel endotel. Terdapat sedikitnya empat anggota lain dari

famili VEGF. VEGF yang telah diterangkan di awal adalah VEGF-A. VEGF –

B selain mempunyai peranan penting dalan vaskulogenesis juga mempunyai

fungsi lain seperti aktivasi enzim invasif pada sel endotel. VEGF-C umumnya

dihubungkan dengan limfangiogenesis, tetapi saat ini ekspresinya dihubungkan

dengan angiogenesis pada beberapa sistem. Peranan dari VEGF-D tidak terlalu

dapat diketahui dengan baik, tetapi protein ini dapat berikatan dengan VEGFR-

2 dan VEGFR-3 dan dapat menginduksi angiogenesis in vivo. Sedikit yang

12

Page 13: BAB 1-2 @ fin

diketahui dari VEGF- E kecuali protein ini dapat berikatan dengan VEGFR-2

dan dapat menginduksi mitosis sel endotel dan angiogenesis.28-30

Reseptor untuk VEGF diekspresikan pada sel endotel dan beberapa sel

tumor. Tiga reseptor VEGF/VPF yang telah teridentifikasi yaitu fms-like

tyrosine kinase -1(Flt-1) , fetal liver kinase 1 (Flk-1)/kinase insert domain

containing receptor (KDR) dan fms-like tyrosine kinase -4(Flt-4). Flk-1/KDR

adalah reseptor berafinitas tinggi dengan domain ekstraseluler yang berisi

domain immunoglobulin-like dan a split tyrosine kinase intracellular domain.

Reseptor ini mempunyai 85% homologi dengan homolog manusia. Flt-1 dan

Flk-1/KDR memperlihatkan peranan penting dalam sistem regulasi untuk

vaskulogenesis dan angiogenesis fisiologis. Interaksi VEGF/VPF dengan Flk-

1/KDR diketahui sebagai interaksi paling penting dalam angiogenesis tumor,

karena peranan esensialnya untuk induksi spektrum luas fungsi VEGF/VPF.

Blokade aktifitas VEGF/VPF yang dimediasi oleh Flk-1/KDR menunjukkan

aktifitas antiangiogenik.26-29

Konsentrasi oksigen yang berkurang mengindikasi diperlukannya

pembuluh darah tambahan untuk kelangsungan hidup tumor. Kondisi tersebut

meningkatkan ekspresi VEGF. Saat sel mengalami kekurangan oksigen akan

diproduksi hipoxia-inducible factor (HIF) yaitu sebuah transcription factor.

HIF akan berakumulasi dan berikatan dengan hypoxia-responsive element

(HRE). Aktivasi ini melibatkan beberapa signal transduction pathways,

termasuk phosphoinositide 3’kinase (PI3K), extracellular regulated kinase

(Erk) 1 / 2 dan jalur protein kinase C (PKC). VEGF dilepaskan dari sel dalam

13

Page 14: BAB 1-2 @ fin

bentuk ikatan homodimer disulfida terglikosilasi. VEGF memicu respon

seluler melalui ikatan pada reseptor tirosin kinase (VEGFRs) pada

permukaan sel, yang menyebabkan reseptor ini mengalami dimerisasi

menjadi aktif melalui transfosforilasi. 41,42

Gambar 4. Struktur molekul VEGF-VEGFR-1

Dikutip dari Ferrara N. 63

Peran penting VEGF terhadap buruknya prognosis pada kanker

payudara telah diketahui. Banyak studi mencatat adanya penurunan overall

survival dan disease free survival pada tumor dengan ekspresi VEGF yang

berlebih. Peningkatan ekspresi VEGF merupakan tahap awal metastasis,

yaitu tahap yang memerlukan pembuluh darah baru dan banyak.

Mekanisme pasti VEGF terhadap perkembangan tumor masih belum

jelas walaupun VEGF telah diketahui mempunyai korelasi dengan buruknya

survival.Inhibisi VEGF diharapkan mencegah terjadi formasi baru pembuluh

darah, serta strategi penghambatan pada Bcl-2 dengan menginduksi apoptosis

juga dapat mencegah sel endotel pembuluh darah tumbuh, akhirnya

menghambat perkembangan tumor dan metastasis,oleh karena itu inhibisi

14

Page 15: BAB 1-2 @ fin

angiogenesis tumor dengan menghambat aksi VEGF adalah strategi terapi

yang rasional. 41,42, 61

2.4. Perkembangan tumor

Proses keganasan dimulai di tingkat onkogen. Secara umum onkogen

tak dapat bergerak sendiri namun harus berkolaborasi dengan onkogen lain

atau dengan hilangnya sifat tumor suppressor. Setelah transformasi, sel-sel

ganas tumbuh dengan progresif dan tak terkontrol karena insensitif pada

sinyal antiproliferasi serta resisten terhadap apoptosis. Sel tumor menginvasi

stroma dan berkomunikasi dengan sel-sel stroma. Sel tumor dan sel induk

bersama-sama memicu pertumbuhan dan metastasis dengan cara

mengaktivasi jalur GF, melancarkan invasi dan angiogenesis. Sebagian besar

onkogen dapat dibagi menjadi empat kelas: faktor transkripsi, growth factors,

reseptor-reseptor, dan signal transducers. Sel tumor tersebut masih avaskular

dan nutrisi dipenuhi melalui difusi sederhana. 31-34,40

Mutasi gen yang meliputi gen antiapoptosis, gen proangiogenesis, dan

proinvasi dipicu oleh faktor transkripsi, faktor nuklear-κB (NF-κB). Faktor

transkripsi teraktivasi bila ada sitokin proinflamasi (TNF), virus, radiasi γ,

komponen dinding sel bakteri (lipopolysaccharide [LPS]), atau agent

kemoterapi. TNF, interleukin (IL-1ß, IL-6, IL-17, dan IL-18), chemokine (IL-

8 atau CXCL8) berperan penting untuk terbentuknya keganasan. Pada proses

TNF mengaktifkan NFκB, produksi VEGF bertambah dan meningkatkan

ekspresi reseptor VEGF yang akhirnya memicu angiogenesis. Makrofag

15

Page 16: BAB 1-2 @ fin

meruapakan penghasil TNF dan sitokin tersebut mengatur keseimbangan

angiogenesis saat perkembangan massa tumor. 35-39

VEGF yang dikeluarkan oleh sel tumor solid yang sedang tumbuh

diperlukan oleh suatu proses angiogenesis. Pembuluh darah baru sangat

diperlukan karena hanya tumor yang berjarak 100 µm dari pembuluh darah

yang dapat hidup. Sel induk melawan metastasis dengan tissue barriers,

mengirim sel imun untuk membunuh tumor, salah satunya adalah makrofag

dan menghambat angiogenesis. 31-37, 40

Terdapat beberapa tahapan yang merupakan suatu proses yang rumit

dalam rangka memunculkan pembuluh darah baru. Tahap pertama adalah

dicernanya membran basal yang mengelilingi pembuluh darah oleh protease

yang disekresi oleh sel endotel. Tahap kedua adalah migrasi sel endotel yang

bersirkulasi ke posisi formasi pembuluh darah, dimana mereka berproliferasi

untuk membentuk tonjolan pembuluh darah. Tahap ketiga adalah proliferasi

dan diferensiasi sel endotel untuk memperpanjang tonjolan dan membentuk

lumen pembuluh darah baru, akhirnya sel endotel mensekresi growth factors,

yang menarik sel pendukung seperti pericytes dan sel otot polos sehingga

terbentuk formasi membran basal. Pembuluh darah baru membentuk

bangunan spesial yang cocok untuk mensuplai jaringan atau organ. 41-44

Aktivitas angiogenik tingkat rendah dapat terdeteksi pada lesi

preneoplatik pada kanker payudara. Aktivitas ini makin progresif ketika

kanker menjadi tingkat neoplastik. Ekspresi VEGF, protein angiogenik,

meningkat karena respon dari hipoksia saat tumor semakin berkembang. 45

16

Page 17: BAB 1-2 @ fin

Apoptosis meruapakan proses kematian sel yang terprogram atau

progammed cell death bermanfaat untuk membuang sel yang tidak berguna

dan berbahaya. Apoptosis diregulasi oleh keluarga gen Bcl, yaitu

proapoptotik (Bax, Bcl-2 antagonist/killer [Bak], Bid, Bim) yang meningkat

serta yang antiapoptotik (Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-W) yang menurun juga tumor

supressor gene p53 yang termutasi. Fosfolipid yang merupakan suatu sinyal

akan dikeluarkan ke ekstraseluler pada membran selnya yang dapat dikenali

oleh sel imun, terutama makrofag. 46,47-49

Beberapa stimulasi yang dapat menginduksi apoptosis, seperti agen

kemoterapi, radiasi, panas, osmotic imbalance, dan nitric oxide (NO).

Bermacam jalur yang mengarah terjadinya apoptosis, yaitu jalur ekstrinsik,

jalur intrinsik, aktivasi kaskade caspase, dan jalur p53. 49-52

Apoptosis diinduksi oleh CTL dan sel-NK yang diinduksi baik oleh

nonsecretory induced, ligand-induced, dan secretory induced dengan

granzyme melalui perantaraan sekresi perforin. 40,53

Saat ini dikenal ± 14 jenis caspase. Dua pertiga dari seluruh jenis

caspase tersebut berperan penting dalam apoptosis. Caspase inisiator

2,8,9,10 diaktifkan oleh dimerisasi dan selanjutnya mengaktifkan caspase 3

dan 7. Caspase ini mentarget protein DNA repair system (seperti [ADP-

ribose]-polymerase [PARP]), protein strukturar/sitoskeletal (seperti lamin,

actin, cytokeratin, dll), dan onkoprotein (terutama protein Rb). Caspase juga

akan mengaktifkan DNAse yang menyebabkan fragmentasi DNA selama

apoptosis sehingga yang akan terjadi adalah melisutnya organel dan inti sel.

17

Page 18: BAB 1-2 @ fin

Proses apoptosis berbeda dengan nekrosis. Sel tidak pecah pada proses ini

sehingga tidak ada komponen intraseluler yang terdispersi ke ekstraseluler

dan mengakibatkan inflamasi seperti halnya proses nekrosis,47, 49,50,54

Proses aktifasi jalur caspase melalui suatu katalisator protease yaitu

FLICE (FADD-like IL-1 converting enzyme) yang terdiri dari FADD (Fas-

associated death domain), pada reseptor CD95/Fas, setelah kontak dengan

fas ligand. Caspase dapat pula diaktifkan oleh granzyme. Caspase juga aktif

melalui reseptor CD95/Fas terjadi bila kontak dengan fas ligand. Fas ligand

ini bisa berasal dari ekspresi protein antigen dari CTL, sitokin TNF, ataupun

metabolit ligand pada reseptor fas. Fas merupakan anggota reseptor tumor

necrosis factor (TNF) yang merupakan bagian jalur apoptosis ekstrinsik47,49

Proses apoptosis dengan jalur secretory induce caspase dilakukan

oleh CTL dan sel-NK dengan granula sitotoksiknya yang berisi protein pore-

forming perforin (cytolysin) dan enzim keluarga dari serine protease yang

disebut granzyme. Granzyme ini terdiri dari granzyme A, B, C, D, E, F, G, H,

K, dan M. Masuknya granzyme ke sitoplasma sel target bermula dari aktifitas

perforin pada sel target. Selanjutnya terjadi induksi apoptosis dengan

mengaktifkan secara langsung caspase dan fragmentasi DNA secara cepat

setelah masuk ke sitoplasma, 48, 55,54

Mitokondria berperan sentral untuk integrasi dan eksekusi bermacam-

macam sinyal apoptotik (misalnya hipoksia, hilangnya GF, kerusakan DNA)

dan menyediakan energi untuk membebaskan protein proapoptotik seperti

cytochrome C. Jalur intrinsik apoptosis menggunakan mitokondria. Keluarga

18

Page 19: BAB 1-2 @ fin

protein Bcl-2 berperan penting pada regulasi di jalur ini. Protein Bcl-2

teraktivasi menempel di membran luar mitokondria untuk membentuk kanal

konduksi, menyebabkan cytochrome C translokasi dari matriks intermembran

ke sitoplasma. Cytochrome bergabung dengan adenosine tri-phosphate

(ATP), apoptotic protease activating factor-1 (Apaf-1) dan procaspase 9

untuk membentuk apoptosome, yang mengaktifkan caspase 9 dan caspase 3

sehingga sel mati. Bax juga berperan penting di proses ini. 47,56

Kerusakan DNA seperti kerusakan double-strand setelah sel terpapar

radiasi, stres atau terkena zat kimiawi mengaktifasi protein p53 yang

merupakan faktor transkripsional. P53 meregulasi gen target seperti Bax dan

Bid. Siklus sel G1 terblok dengan aktivasi transkripsional oleh p53. Hal ini

mencegah pertumbuhan tumor melalui penghentian siklus sel atau induksi

apoptosis. 49,57

TNF merupakan mediator utama respon inflamasi yang menyebabkan

tumor nekrosis in vivo dan meregresi tumor, juga sitotoksik terhadap

beberapa sel normal maupun yang telah bertransformasi, dan memicu

imunitas. TNF adalah protein multifungsi berupa sitokin dan bersinergi

dengan VEGF. Target aktifitas TNF yang paling penting adalah sel endotel.

TNF meningkatkan ekspresi antigen major histocompatibility class I (MHC I

antigen) dan produksi faktor kemotaktik serta sitokin lain. TNF mengubah

fungsi pertahanan dan permeabilitas sel endotel.47

Reseptor dan ikatan dengan ligand diperlukan oleh TNF. Reseptor-

reseptor ini mengaktifkan protein intraseluler yang terkait dalam

19

Page 20: BAB 1-2 @ fin

menginduksi apoptosis. Terdapat dua reseptor TNF dengan berat molekul

55kD (disebut reseptor TNF tipe I [TNF-RI], atau reseptor p55) dan 75 kD

(disebut reseptor TNF tipe II [TNF-RII], atau reseptor p75). Molekul sinyal

di sitoplasma yang berisi death domain dan berperan dalam sinyal TNFR

adalah TNF receptor-associated death domains (TRADD), Fas-associated

death domain (FADD), dan receptor interacting protein (RIP). Tipe kedua

yang berperan dalam sinyal TNFR adalah keluarga molekul yang bernama

TNF receptor-associated factors (TRAFs). TRAFs segera mengaktifkan

faktor transkripsi, yaitu faktor nuklear κB (NF-κB) dan protein aktivasi 1

(AP-1). Saat sitokin berikatan dengan TNF-RI, terjadi rekrutmen protein

adaptasi yang mengaktifkan caspases dan memicu apoptosis. TRADD

kemudian berikatan dengan TNF-R1. Dalam hal ini, peran TNF dapat

bercabang kearah apoptosis atau respon inflamasi-ekspresi gen untuk protein-

protein agar dapat bertahan hidup. Hal ini dimulai pertama-tama saat

TRADD berikatan TNF-R1 tersebut. Kemudian death domain protein FADD

berikatan dengan TRADD dan FADD berikatan dengan caspase 8.

20

Page 21: BAB 1-2 @ fin

Gambar 5 : aktifasi TNFDikutip dari: Gen Ichiro 9

Caspase 8 memulai aktivasi cascade dari caspases sehingga terjadi

apoptosis. Jalur yang lain setelah TRADD berikatan dengan TNF-RI adalah

untuk mentranskripsi gen. TRAF-2 dan RIP-1 dan TRADD berikatan

sehingga kinases IκB aktif, fosforilasi IκB berjalan serta transkripsi gen NF-

κB dan AP-1 terjadi. Hal ini menyebabkan mediator-mediator inflamasi serta

protein-protein pertahanan hidup keluar.62

TNF-RII, merekrut protein-protein TRAFs, menuju domain

sitoplasmik reseptor tersebut. TNF-RII berperan dalam sitotoksisitas,

menghambat hematopoiesis awal dan proliferasi monosit.

TNF mengatur keseimbangan angiogenesis. Sewaktu TNF

mengaktifkan NFκB, produksi VEGF bertambah dan meningkatkan ekspresi

reseptor VEGF. TNF dan VEGF bekerja sama dalam formasi struktur mirip

kapiler selama angiogenesis. Namun TNF juga bersinergi menginduksi

endothelial cell tissue factor yang dapat menghambat perkembangan tumor

melalui aktivitas prokoagulan clot-promoting. TNF menghambat kemampuan

VEGF untuk mengaktifkan salah satu reseptor VEGF bila kondisi normal,

tidak dalam arah perkembangan tumor. 47,62

2.5.Thymoquinone sebagai agent anti pertumbuhan tumor

Thymoquinone menginduksi apoptosis pada jaringan kanker dengan

meningkatkan ekspresi gen apoptosis (caspase dan bax) dan menurunkan

ekspresi gen antiapoptosis (bcl2). Selain itu thymoquinone juga melakukan

21

Page 22: BAB 1-2 @ fin

deaktifasi jalur NFkappa B dengan menginduksi produksi sitokin sehingga

mengkontrol ekspresi onkogen. Senyawa ini juga mencegah enzim

dari kerusakan akibat lingkungan TNF α juga dapat disupresi oleh

thymoquinone.63-66

2.6.Adenokarsinoma mama

Adenokarsinoma mama mengacu pada jenis karsinoma yang

berasal dari jaringan glandular (sel dengan fungsi sekresi), dalam hal

ini duktus dan lobules dari payudara. Berdasarkan gambaran

histologis, World Health Organization (WHO) membuat klasifikasi

kanker payudara sebagai berikut:

1. Kanker payudara non invasif

2. Kanker payudara invasif

Sekitar 80% kanker payudara adalah yang merupakan varietas dari

adenokarsinoma duktus invasif. Terdapat juga beberapa jenis yang jarang yang

merupakan bentuk khusus dari adenokarsinoma mama yaitu sekitar

6%. inflammatory carcinoma  berjumlah sekitar 1% sampai dengan 6% ,

medullary carcinoma  3%-5%. Mucinous carcinoma  3%, tubular carcinoma 

1%-2%, dan cribriform carcinoma  5%-6%. dan papillary carcinoma sebesar

1% - 2%.74-77

22

Page 23: BAB 1-2 @ fin

Gambar 6. Histopatologi adenokarsinoma mama

Dikutip dari : http//www.conganat.org

Terdapat 3 faktor penting yang dapat dikaitkan dengan etiologi terjadinya kanker

payudara secara umum :

a. Faktor genetik

Kanker payudara yang diturunkan diketahui melibatkan gen

breast cancer susceptibility 1 (BRCA1) dan BRCA2.

Kerusakan deoxyribonucleic acid (DNA) dan kehilangan ekspresi

gen BRCA1/2 serta gen p53 karena mutasi dan menyebabkan

defek pada kontrol titik peralihan siklus sel.

b. Hormon

Risiko terkena kanker payudara lebih tinggi bila usia

menarche awal dan usia menopause lambat . Hal ini

dimungkinkan karena tingginya paparan hormon reproduksi

Produksi growth factor (GF) tergantung pada hormon estrogen.

Interaksi antara hormon di sirkulasi, reseptor hormon di sel

23

Page 24: BAB 1-2 @ fin

kanker dan GF autokrin merangsang sel kanker berubah menjadi

lebih progresif.

c. Faktor diet, kebiasaan hidup dan lingkungan.

Faktor ini terdiri dari alkohol, kopi, diet tinggi lemak dan

obesitas. Terdapat relasi linear antara konsumsi alkohol, kopi, diet

tinggi lemak yang berlebih serta obesitas terhadap tingginya

risiko terjadinya kanker payudara. 79

24

Page 25: BAB 1-2 @ fin

25

Page 26: BAB 1-2 @ fin

3.3. Hipotesis

26

Page 27: BAB 1-2 @ fin

3.3.1.Terdapat perbedaan ekspresi VEGF sel kanker payudara

Pada mencit C3H

yang diberi ekstrak Nigella

sativa dosis bertingkat

dibandingkan dengan yang tidak diberi ekstrak Nigella sativa.

. Terdapat perbedaan volume massa tumor pada kanker payudara mencit

C3H yang diberi ekstrak Nigella sativa dosis bertingkat dibandingkan

dengan yang tidak diberi ekstrak Nigella sativa.

27

Page 28: BAB 1-2 @ fin

BAB IV

METODE PENELITIAN

4.1. Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratorik dengan desain

"Post test only control group design". Kelompok penelitian dibagi menjadi 4

yaitu kelompok kontrol (K), Perlakuan 1 (P1), Perlakuan 2 (P2) , Perlakuan 3

(P3) Adapun pembagian kelompok perlakuan adalah sebagai berikut:

K : Kelompok kontrol, mencit yang di inokulasi sel kanker.

P1 : Kelompok perlakuan 1, mencit yang di inokulasi sel kanker, setelah timbul

benjolan, mendapat NS0,175 mL/hari

P2 : Kelompok perlakuan 2, mencit yang di inokulasi sel kanker, setelah timbul

benjolan mendapat NS 0,36 mL/hari

P3 : Kelompok perlakuan 3, mencit yang di inokulasi sel kanker, setelah timbul

benjolan mendapat NS0,7 mL/hari

28

Page 29: BAB 1-2 @ fin

Skema penelitian yang dilakukan adalah sebagai berikut:

Gambar 7: Skema rancangan penelitian

4.2. Sampel Penelitian

Hewan coba adalah mencit strain C3H yang diperoleh dari Laboratorium

Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia.

Kriteria Inklusi :

a. Mencit betina berusia 6 bulan

b. Berat badan 20-30 gram setelah aklimatisasi dan

c. Tidak ada abnormalitas anatomis.

Kriteria Ekslusi :

a. Tidak tumbuh tumor setelah dilakukan inokulasi

b. Selama inokulasi dan perlakuan mencit tampak sakit (gerakan tidak aktif)

Besar sampel menurut WHO tiap kelompok minimal 5 ekor dengan

cadangan 10% tiap kelompok, pada penelitian ini jumlah sampel yang digunakan

tiap kelompok 6 ekor mencit.

29

Page 30: BAB 1-2 @ fin

Randomisasi: 24 mencit yang sudah berhasil diinokulasi dikelompokkan secara

random menjadi 4 kelompok yaitu:

Kelompok K : 6 mencit

Kelompok P1 : 6 mencit

Kelompok P2 : 6 mencit.

Kelompok P3 : 6 mencit

4.3. Waktu dan Lokasi Penelitian

Penelitian dan pengumpulan data dilakukan selama 2 bulan. Perlakuan

pada mencit dan proses pengambilan jaringan dilakukan di Laboratorium

Histologi FK Universitas Indonesia, proses pembuatan blok parafin sampai

pewarnaan dilakukan di Laboratorium Patologi Anatomi FK Universitas Gajah

Mada / RSUP Dr. Sardjito Yogyakarta.

4.4.Variabel Penelitian

4.4.1.Variabel bebas

Sebagai variabel bebas adalah pemberian dosis bertingkat ekstrak Nigella

sativa.

4.4.2. Variabel tergantung

Sebagai variabel tergantung adalah : ekspresi VEGF dan ukuran massa

tumor

30

Page 31: BAB 1-2 @ fin

4.4.3. Definisi operasional

1. Ekstrak Nigella sativa adalah ekstrak yang berasal dari biji Nigella sativa,

yang diekstraksi dengan pelarut etanol dengan menggunakan metoda

sokletasi diberikan dengan dosis bertingkat 0,175 mL/hari, 0,36 mL/hari

dan 0,7 mL/hari, hasil skala variabel : rasio

2. Ekspresi VEGF adalah ekspresi sel endotel pada jaringan tumor yg

terekspresi positif warna cokelat dinilai dengan skala kekuatan ekspresi

kuat, sedang, lemah dengan pengecatan imiunohistokimia yang diukur

secara visual oleh dua orang peneliti diambil dari preparat potongan masa

tumor pembesaran 400 x, pada 10 lapangan pandang, Skala variabel : rasio

1. Perkembangan massa tumor didapat dengan menghitung ukuran

diameter tumor menggunakan alat caliper tumor (CaliProR)

sebelum dan setelah pemberian ekstrak, diukur diameter terbesar

tumor. Satuan cm.Skala variabel : rasio

4.5.Bahan dan alat penelitian

4.5.1 Bahan untuk perlakuan

Hewan coba adalah mencit betina strain C3H dengan umur 6 bulan, dan

berat 20 - 30 gram. Mencit diperoleh dari Laboratorium Patologi Anatomi

Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. Selama percobaan, hewan coba

ditempatkan pada kandang dan diberi pakan dan minum secara ad libitum.

Sebelum perlakuan, mencit menjalani masa adaptasi selama 1 minggu.

31

Page 32: BAB 1-2 @ fin

Adenokarsinoma diperoleh dari mencit donor. Tumor yang mengandung

sel adenokarsinoma dari mencit donor akan ditransplantasikan ke mencit resipien.

Sebelum ditransplantasikan, tumor dari mencit donor akan diisi biopsi dan

dilakukan pemeriksaan histologi untuk mengkonfirmasi jenis tumornya.

Nigella sativa yang digunakan adalah Ekstrak Nigella sativa, diperoleh

dengan cara :

- 1 kg Nigella sativa yang telah dikeringkan ditumbuk halus, kemudian serbuk

dimasukkan ke dalam alat soklet (kapasitas 50mg) dan dilakukan ekstraksi

dengan cara sokletasi menggunakan pelarut etanol dengan siklus 8 – 10 kali.

- Hasil ekstrak dimasukkan dalam labu rotary evaporator dan dilakukan

destilasi vakum hingga menjadi pekat (suhu 40ºC).

- Ekstrak dikeringkan dalam oven dengan suhu 40ºC selama 1 jam untuk

menguapkan etanol.

- Didapatkan hasil 5,5mg ekstrak pada setiap 1 kg bahan (0,55%), dan hasil

ekstrak diencerkan dengan aquabidest.

Dosis yang digunakan adalah disetarakan dengan dosis yang telah digunakan

pada manusia yaitu dari serbuk biji 5 gram 1 x sehari 8, dikalikan konstanta uji

terapi pada hewan coba (mencit) yaitu 0,0026 20 dikalikan konstanta hasil

ekstrak 0,0055, sehingga dosis yang diberikan adalah 5000 x 0,0026 x 0,0055

= 0,0715 mg/hari (0,36 mL). Selain itu juga diberikan dosis 0,035mg (0,175

mL)/hari dan 0,14 mg (0,7 mL)/hari.

32

Page 33: BAB 1-2 @ fin

4.5.2. Bahan transplantasi jaringan tumor pada mencit

a. Alkohol 70 %

b. Larutan Garam fisiologik

c. Es batu

d. Mencit donor bertumor

e. Mencit resipien

4.5.3. Bahan untuk pemeriksaan histopatologi rutin

a. Formalin buffer 10%

b. Alkohol 50%, 70%, 80%, 96%, absolute, xylol

c. Parafin cair (Histoplast)

d. Albumin dan Poly-L-Lysine

e. Bahan pengecatan Hematosiklin eosin

f. Canada balsam dan Entelan

33

Page 34: BAB 1-2 @ fin

4.5.4. Alat transpalntasi jaringan tumor pada mencit

1. Cawan petri ukuran 6 Cm

2. Cawan petri ukuran 15 Cm

3. Cawan ukuran 10 Cm

4. Spuit 1cc

5. Jarum suntik trocar

Gunting bengkok 10 Cm

Alat fiksasi

Pinset anatomi 10 Cm

4.5.5. Alat untuk pengamatan dan dokumentasi sediaan adalah :

- 1 Unit Multi Head Microscope OlympusR

- NikonR Digital Net Camera DN 100 + SD Card

- 1 Unit Personal Computer Intel PentiumR Processor

- Alat caliper tumor (CaliProR)

4.6. Pelaksanaan penelitian

Cara perlakuan

Dua puluh empat ekor mencit betina strain C3H diadaptasi di laboratorium

dengan dikandangkan secara individual dan diberi ransum pakan standard

selama 1 minggu secara ad libitum.

Dua puluh empat ekor mencit tersebut kemudian diinokulasi tumor,

diamati selama 4 hari. Pada kelompok mencit yang berhasil diinokulasi

34

Page 35: BAB 1-2 @ fin

gagal

Berhasil

Mencit dibunuh setelah 3 minggu

24 ekor mencit adaptasi

Inokulasi tumor4 hari

random

K P1 P2P3

ekslusi

Jaringan tumor

Blok parafin

Pewarnaan HE

Inklusi :Mencit betina usia 6 bulan ,

BB 20-30 gram &abnormalitas anatomis(-).

dibagi menjadi 4 kelompok yang ditentukan secara acak. Masing-masing

kelompok dikandangkan secara individual dan mendapatkan pakan standar

yang sama dan minum ad libitum. Kemudian diberikan perlakuan,

perlakuan yang diberikan selama 3 minggu, dan pemberian ekstrak

dilakukan dengan pipet mikro.

Setelah perlakuan selesai, mencit di anaestesi dengan ether

selanjutnya mencit dibunuh dengan cara di dislokasi cervical-nya,

kemudian diambil jaringan tumor. Jaringan tumor diproses menjadi

preparat histologik setelah dibuat blok paraffin.

4.7. Alur kerja

4.8.Prosedur pemeriksaan

4.8.1. Prosedur transplantasi tumor

a. Mencit donor dimatikan dengan eter, kemudian diletakkan terlentang

pada tatakan / alas fiksasi dan keempat kakinya difiksasi dengan jarum.

35

Pewarnaan VEGF

Page 36: BAB 1-2 @ fin

b. Kulit dibagian yang bertumor diusap dengan alkohol 70 %, kemudian

dibuat sayatan dengan gunting lurus, untuk mengeluarkan tumor.

c. Tumor diletakkan di cawan petri kecil yang telah terlebih dahulu

dicuci dengan garam fisiologis dan diletakkan diatas es.

d. Amati bentuk dan keadaan tumor, kemudian ambil/potong jaringan

tumor yang masih baik yaitu bagian yang tanpa nekrosis (biasanya di

daerah tepi jika tumor besar) sebanyak kira-kira yang dapat

menghasilkan bubur tumor paling sedikit 1 ml dan taruh dicawan petri

kecil lainnya. Bersihkan dari jaringan ikat (simpai), jaringan nekrotik

dan darah, kemudian cacah/potong-potong sampai halus dengan

gunting hingga akhirnya terbentuk “bubur tumor” yang partikelnya

dapat melewati jarum trokar. Tambahkan garam fisiologis lebih kurang

sama banyak dengan volume tumor.

e. Bubur tumor disuntikkan subkutan di aksila kanan ke arah jalur susu

(milk streak) mencit dengan dosis 0,2 ml menggunakan spuit insulin

dengan ketepatan 10-1.

f. Sisa tumor yang padat dimasukkan ke dalam botol formalin untuk

dibuat sediaan mikroskopik.

g. Masing-masing mencit diberi nomor ditelinganya (lihat bagan) dan

dimasukkan ke dalam kandang berbeda yang diberi label berisi : jenis

kelompok perlakuan, tanggal transplantasi

36

Page 37: BAB 1-2 @ fin

4.8.2. Prosedur pembuatan preparat histopatologi

a. Fiksasi

Potongan adenokarsinoma dimasukkan dalam larutan formalin buffer

(larutan formalin 10% dalam buffer Natrium asetat sampai mencapai pH

7,0). Waktu fiksasi jaringan 18-24 jam. Setelah fiksasi selesai, jaringan

dimasukkan dalam larutan aquadest selama 1 jam untuk proses

penghilangan larutan fiksasi.

b. Dehidrasi

Potongan adenokarsinoma dimasukkan dalam alkohol koNigella

sativaentrasi bertingkat. Jaringan menjadi lebih jernih dan traNigella

sativaparan. Jaringan kemudian dimasukkan dalam larutan alkohol-xylol

selama 1 jam dan kemudian larutan xylol murni selama 2 x 2jam.

c. Impregnasi

Jaringan dimasukkan dalam paraffin cair selama 2x2 jam.

d. Embedding .

Jaringan ditanam dalam paraffin padat yang mempunyai titik lebur 56-

580C, ditunggu sampai paraffin padat. Jaringan dalam paraffin dipotong

setebal 4 mikron dengan mikrotom. Potongan jaringan ditempelkan pada

kaca obyek yang sebelumnya telah diolesi polilisin sebagai perekat.

Jaringan pada kaca obyek dipanaskan dalam incubator suhu 56-580C

sampai paraffin mencair.

e. Pewarnaan jaringan dengan VEGF

37

Page 38: BAB 1-2 @ fin

1. Xylol 1 menit 11. Air 15 detik

2. Xylol 2 menit 12. Alkohol 80% 15 detik

3. Xylol 2 menit 13. Alkohol 96% 30 detik

4. Alkohol 100% 2 menit 14. Alkhol 100% 45 detik

5. Alkohol 96% 2 menit 15. Xylol 1 menit

6. Alkohol 80% 2 menit 16. Xylol 1 menit

7. Air 1 menit

8. Mayer VEGF 7,5 menit

9. Air 7,5 menit

10. Eosin (0,5%)-Alkohol-Asam asetat 1 menit

4.9. Analisis data

Data hasil penelitian diolah dan disajikan dalam bentuk tabel dan

grafik. Analisa data meliputi uji hipotesis dan analisis deskriptif. Pada analisa

deskriptif jumlah limfosit, disajikan dalam bentuk tabel rerata, SD, median dan

grafik box plot. Apabila data berdistribusi normal dilakukan uji One Way Anova

untuk melihat adanya perbedaan pada kedua kelompok perlakuan. Besarnya

perbedaan masing-masing kelompok perlakuan dianalisis lebih lanjut dengan Post

Hoc Test Bonferroni dan Tamhane. Apabila data tidak berdistribusi normal

dilakukan uji Kruskal-Wallis untuk melihat adanya perbedaan pada kedua

kelompok perlakuan. Besarnya perbedaan masing-masing kelompok perlakuan

dianalisis lebih lanjut dengan Mann-Whitney U Test. Untuk melihat adanya

38

Page 39: BAB 1-2 @ fin

korelasi masing-masing variabel yang diukur, dianalisis dengan menggunakan uji

korelasi Pearson’s product moment (distribusi normal) atau Spearman’s rho

(distribusi tidak normal). Semua analisis statistik tersebut dilakukan dengan

menggunakan program komputer SPSS 10.05 for windows. Nilai signifikan

pada penelitian ini adalah apabila variabel yang dianalisis memiliki nilai p ≤

0,5.

4.10. Persyaratan Etik

Implikasi etik pada hewan, pengelolaan binatang coba pada penelitian

ini mengikuti animal ethics. Hal yang perlu dilaksanakan sesuai dengan etik

antara lain perawatan dalam kandang, pemberian makan minum (ad libitum),

aliran udara dalam ruang kandang, perlakuan saat penelitian, menghilangkan rasa

sakit, pengambilan unit analisis penelitian, dan pemusnahannya.

39