Ayu Puspitasari20510036

KIMIA-MIPA ITB

L-Rhamnose Isomerase

L-Rhamnose Isomerase (L-RhI) memiliki nomor Enzim 5.3.1.14

Termasuk dalam : kelas : Isomerase sub kelas : intramolecular

oxidoreductase subsub kelas : aldosa-ketosa isomerisasi

Nama Lain : L-rhamnose aldose-ketose-isomerase

PENDAHULUAN

Berasal dari berbagai mikroorganisme seperti Aerobacter aerogenes, Escherichia coli,Lactobacillus plantarum, Mycobacterium smegmatis, Pseudomonas stutzeri,Bacillus pallidus, Thermoanaerobacterium saccharolyticum NTOU1, dll.

Umumnya digunakan dalam metabolisme fruktosa dan manosa. Kemudian banyak berperan dalam produksi rare sugar dalam jumlah besar.

Substrat Utama adalah L-Rhamnosa yaitu suatu turunan dari manosa. Banyak terdapat sebagai glikosida di tumbuhan,hewan, dan bakteri.

L-RhI dari Eschericia coli hanya spesifik pada subtrat L-Rhamnosa. Efektifitasnya pada reaksi dengan subtrat lain sangat rendah

L-RhI dari Pseudosomonas stutzeri mempunyai spesifisitas substrat yang luas antara lain L-Rhamnosa, L-Manosa, L-Lyxose, D-Ribosa, D-Alosa dalam reaksi isomerisasi aldosa-ketosa.

KARATERISTIK

L-RhI dari Bacillus pallidus Y25 juga mempunyai spesifisitas substrat yang luas antara lain L-Rhamnosa, L-Manosa, L-Lyxose, D-Ribosa, D-Alosa tetapi lebih tahan panas daripada L-RhI dari Pseudosomonas stutzeri dan dari Escherichia coli.

L-RhI dari T. saccharolyticum NTOU1 mempunyai spesifisitas substrat yang luas antara lain L-Rhamnosa, L-Manosa, L-Lyxose, D-Ribosa, D-Alosa tetapi lebih tahan panas daripada L-RhI dari Pseudosomonas stutzeri , Escherichia coli dan Bacillus padillus.

Specific activities dari rekombinan L-RhI terhadap berbagai substrat berbeda sesuai dengan karateristik rekombinan L-RhI.

Perbandingan Parameter Kinetik dari Rekombinan L-RhI dari E. coli, P. stutzeri, B. Pallidus Y25, T. saccharolyticum NTOU1

  E. coli P. stutzeri B. pallidus Y25 T. saccharolyticum NTOU1

substrat KM (mM) kcat (s-1) KM (mM) kcat/KM kcat (s-1) KM (mM) kcat/KM kcat (s-1) KM (mM) kcat/KM

       (mM

-1 . S-1)    

(mM-1 .

S-1)    (mM

-1 . S-

1)L-rhamnosa 2.00 172.00 11.90 14.40 68.00 4.89 13.90 180±4d

3.53±0.39 50.8±5.0

L-lyxose 5.00 100.00 55.50 1.81 31.00 16.10 1.93 240±0345.2±1.

85.30±0.1

6

L-manosa 5.00 89.70 61.70 1.45 76.80 28.90 2.6630.0±0.

558.9±2.

30.51±0.0

1

D-alosa ND 5.02 42.00 0.12 34.50 41.80 0.8333.9±1.

3 121±100.28±0.0

2

D-manosa ND 15.80 38.50 0.41 14.20 34.90 0.4121.5±0.

9 148±130.15±0.0

1

Perbandingan Properti Enzim L-RhI dari E. coli, P. stutzeri, B. pallidus Y25, T. saccharolyticum NTOU1

properti E. coli P. stutzeriB. pallidus

Y25T. saccharolyticum

NTOU1Suhu optimum (oC) 60 60 65 75Stabilitas Suhu (oC) 50 (10 min) 50 (10 min) 60 (60 min) 70 (2 hr)pH optimum 7.6 9.0 7.0 7.0Stabilitas pH NR 5-11 7-10 5-9kofaktor Mn2+, Zn2+ Mn2+ Mn2+, Co2+ Mn2+, Co2+

Berat Molekul 47199 46946 47636 48961byproduct NR Ada Tidak Ada Tidak Ada

Gen L-rhi diklon dari DNA bakteri menggunakan PCR kemudian diekpresikan pada E. coli.

Sel yang mengekspresikan L-RhI kemudian dimurnikan dengan :1. French press disruptor2. Heat Treatment

3. Centrifuge4. Dialisis / Kromatografi Penukar Ion

L-RhI dianalisa dengan SDS-PAGE dan Spektrofotometer Massa

ISOLASI DAN PENENTUAN ENZIM

L-RhI dari Pseudosomonas stutzeri

• 2 ion zinc terikat pada pusat active site.• Zn1 terikat pada O2&O3 dari L-

Rhamnosa,juga pada Asp254, His281, Glu219, Asp327. Zn1 terikat lebih kuat ke bagian aktif dibanding Zn2. Berperan pada pengikatan substrat

• Zn2 terikat pada O1, Asp289,His257, dan 2 molekul air. Berperan pada proses zwitterion

• Terdapat molekul air di sekitar atom C4, C5,C6 substrat

STRUKTUR ACTIVE SITE

Terdapat banyak ruang pada substrat-binding site untuk mengakomodasi banyak jenis substrat

Substrat yang lain yaitu L-manosa, L-lyxose, D-ribosa, dan D-alosa juga mempunyai struktur dan interaksi ikatan hidrogen yang serupa dengan L-rhamnosa sehingga cocok untuk menjadi substrat bagi enzim L-RhI dari Pseudosomonas stutzeri.

Terdapat jaringan ikatan hidrogen di sekitar substrat-enzim yang berperan penting pada reaksi enzimatis.

• Saat Substrat terikat dengan enzim, akan diikuti dengan proses isomerasi.

• Terjadi mekanisme perantara zwitterion yang terdiri dari transfer dua proton dan suatu transfer hidrida.

• Proton pertama ditransfer dari substrat ke Asp327 dan berikutnya proton ditransfer dari Lys221 ke substrat menghasilkan muatan positif pada C1 dan muatan negatif pada O2.

MEKANISME REAKSI ENZIMATIS

Kemudian suatu transfer hidrida dari C2 ke C1 akan menghasilkan produk yaitu isomer dari substrat.

Yang berperan dalam proses enzimatis adalah C1 dan C2.

Inhibitor yang mungkin adalah Ag+, Ba2+, Ca2+, EDTA, Fe2+, Ni2+, dll

SPESIFISITAS SUBSTRAT• Pada L-RhI dari E. coli terdapat suatu kantung

hidrofobik yang unik pada C4, C5, dan C6 pada substrat yang diikatnya. Sedangkan pada L-RhI dari P. stutzeri tidak ada kantung hidrofobik tersebut. Hal ini yang membuat spesifisitas substrat pada L-RhI dari P. stutzeri lebih tinggi daripada L-RhI dari E. coli

METABOLISME FRUKTOSA DAN MANOSA

L-Rhamnosa

Suatu metil pentosaBM 182.17Sumber adalah hewan, tumbuhan dan

bakteriDigunakan dalam industri makanan,

memberikan aroma buah dan juga termasuk aroma daging.

REAKSI ISOMERISASI ALDOSA-KETOSA

ACTIVE DOMAIN

SUBSTRATE-BINDING SITE

SPECIFIC ACTIVITIES

PENDAHULUAN

KARATERISTIK ENZIM

ISOLASI DAN PENENTUAN ENZIM

STRUKTUR ACTIVE SITE

MEKANISME REAKSI ENZIMATIS

SELESAI