LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA ASAM AMINO DAN PROTEIN

Kelompok 6 (Senin) Elda Yulia Mamora (1006756572) Erna Pujiningtyas (1006659464) Satrio Ang Jaya (1006683886) Tri Amelia (1006758104)

DEPARTEMEN FARMASI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS INDONESIA 2011 I. Prinsip Asam amino merupakan golongan zat amfoter karena dapat bereaksi dengan asam maupun basa. Identifikasi protein umumnya berdasarkan reaksi warna. II. Tujuan Percobaan ini dilakukan untuk mengetahui cara mengidentifikasi sifat dan reaksi dari asam amino dan protein. III. Teori Dasar Protein adalah molekul besar (berat molekulnya dapat sampai beberapa juta).Terdapat di semua makhluk hidup. Protein tersusun atas kira-kira 20 macam asam amino yang berikatan satu sama lain dengan ikatan peptida yang dibentuk antara gugus karboksil asam amino dengan gugus amino dari asam amino berikutnya. Protein pada umumnya diklasifikasikan atas daya larut dan komposisi kimianya. a. Simple protein Merupakan protein yang hanya mengandung 1--asam amino atau derivatnya. Contoh : albumin, globulin, glutelin, protamin, albuminoid, histon, dan lainlain. b. Conjugated protein Merupakan protein yang bergabung dengan zat lain yang bukan protein. Zat yang bukan protein ini disebut gugus prostetik. Contoh : nukleoprotein, glikoprotein, fosfoprotein, lipoprotein, metaloprotein, dan lain-lain.

Asam amino dan protein secara umum mempunyai sifat-sifat fisik yang sama. Sebagai contoh : asam amino dan protein memiliki gugus asam dan basa. Kelarutan protein dalam air juga berbeda, tergantung dari banyaknya ion positif dan ion negatif yang terdapat di dalam protein. Protein apabila dihidrolisis akan terurai menjadi beberapa jenis asam amino. Aktivitas biologis dari protein tergantung dari bentuk tiga dimensi asam amino penyusunnya. Destruksi atas bentuk tiga dimensi suatu protein disebut denaturasi. Bentuk tiga dimensi tergantung atas ikatan hidrogen, ikatan inter-ionik / jembatan garam, dan ikatan disulfida. Suatu agen/zat-zat tertentu yang dapat berinterferensi dengan ikatan hidrogen, ikatan intertonik dan ikatan disulfida dapat mendenaturasi protein. Perubahan-perubahan yang terjadi pada protein akibat dari denaturasi, antara lain adalah berkurangnya daya larut enzim, hilangnya aktivitas protein (khususnya untuk enzim dan hormon), berubah atau hilangnya antigen. Asam amino dapat digolongkan menjadi 7 golongan atas dasar struktur rantai samping R. Rumus umum asam amino COOH H2N C H R

Golongan tersebut adalah : 1. 2. 3. 4. Asam amino dengan rantai samping alifatik misalnya glisin, alanin, Asam amino dengan rantai samping yang mengandung gugus hidroksil Asam amino dengan rantai samping yang mengandung sulfur misalnya Asam amino dengan rantai samping yang mengandung gugus asam valin, leusin, isoleusin. misalnya serin, treonin dan tirosin sistein dan metionin. atau amida, misalnya asam aspartat, asparagin, asam glutamate, glutamine.

5. 6. 7.

Asam amini dengan rantai samping yang mengandung gugus basa Asam amino dengan rantai samping yang mengandung cincin aromatic Asam imino misalnya prolin, 4-hidroksiprolin

misalnya arginin, lisin dan histidin misalnya fenilalanin, tirosin, triptofan Asam amino yang tidak terdapat dalam molekul protein antara lain adalah beta-alanin, taurin, gama-aminobutirat, ornitin, dan sitrulin. Sifat-sifat asam amino antara lain : 1. Kristal putih yang larut dalam air, asam atau basa kuat. 2. Beberapa mempunyai rasa manis, ada yang mempunyai rasa tawar dan ada pula yang pahit. 3. Mempunyai atom C simetris (kecuali glysin), sehingga mempunyai sifat optis aktif. 4. Bersifat amfoter. 5. Pada pH isoelektrik, asam amino tidak bergerak dalam medan listrik. Asam amino yang diperlukan dalam tubuh dibagi atas 2 kelompok : 1. Asam amino essensial yaitu asam amino yang mutlak harus ada dalam makanan karena tidak dapat disintesis oleh tubuh. Contoh : triptofan, fenilalanin, lisin, treonin, valin, metionin, isoleusin. 2. Asam amino non-essensial yaitu asam amino yang dapat disintesis oleh tubuh sendiri. Asam amino ini juga terdapat dalam makanan sebagai sumber nitrogen.

IV. Bahan :

Alat dan Bahan Putih telur Fenol 2 % Serbuk albumin Urea

Albumin 2 % Kasein 0,2%

aquadest Pereaksi millon H2SO4 pekat Larutan Hopkins-cole Larutan (NH4)2SO4

Larutan Ninhidrin 0,1% NaOH 10% Larutan CuSO4 HNO3 pekat

Larutan HgCl2 2 %

alkali

pekat

(NaOH atau NH4OH)

Pb-asetat 2 % FeCl3 2 %

Alat : Tabung reaksi + rak tabung reaksi Pipet tetes Beaker glass Penangas air Corong Kertas saring Batang pengaduk Gelas ukur Pembakar spiritus Kaki tiga dan kasa

V.

Cara KerjaPrinsip : Reaksi ini disebabkan oleh derivat-derivat monofenol seperti tirosin. Pereaksi yang digunakan adalah larutan ion merkuri / merkuro dalam asam nitrat atau nitrit. Warna merah yang terbentuk mungkin disebabkan oleh garam merkuri dari tirosin yang ternitrasi. Prosedur : Tambahkan 5 tetes pereaksi Millon ke dalam tabung reaksi yang telah berisi 3 ml albumin 2 %, kasein 2 %, fenol 2 %, dan putih telur. Panaskan campuran dengan hatihati. Warna merah menyatakan hasil positif. Jika reagen yang digunakan terlalu banyak maka warna akan hilang pada pemanasan.

a. Test Millon

b.

Test Hopkins-Cole Prinsip : Pereaksi yang digunakan mengandung asam glioksilat. Triptofan berkondensasi dengan aldehida dan dengan asam pekat membentuk kompleks berwarna dari jenis asam 2,3,4,5-tetrahidro-karbolin-4-karboksilat. Prosedur : Campurlah 2 ml larutan albumin 2 %, kasein, dan putih telur dengan larutan Hopkins-cole 1 ml. Tambahkan dengan hati-hati melalui dinding tabung asam sulfat pekat 10 tetes. Amati warna yang terbentuk pada pertemuan kedua cairan.

c.

Test Ninhidrin Prinsip : Semua asam amino alfa bereaksi dengan ninhidrin membentuk aldehid dengan satu atom C lebih rendah dan melepaskan NH3 dan CO2. Di samping itu, terbentuk kompleks berwarna biru yang disebabkan oleh 2 molekul ninhidrin yang bereaksi dengan NH3 setelah asam amino tersebut dioksidasi. Garam-garam ammonium, amina, peptida, dan protein juga bereaksi tetapi tanpa melepaskan CO2 dan NH3.

Prosedur : Dalam tabung reaksi yang berisi 1 ml larutan (NH4)2SO4, albumin 2%, kasein 0,2%, dan putih telur ditambah 0,5 ml larutan ninhidrin 0,1 %. Letakkan pada penangas air mendidih selama 10 menit. d. Test Biuret Merupakan tes umum yang baik untuk protein. Warna yang terbentuk kemungkinan berasal dari kompleks antara ion Cu2+ dengan gugus CO dan NH ikatan peptida dalam suatu alkalis. Prosedur : a. Campurlah 2 ml larutan albumin 2 % dengan 2ml NaOH 10 % dan tambahkan setetes larutan CuSO4. campurlah dengan baik, jika belum terbentuk warna tambahkan lagi setetes atau 2 tetes CuSO4. Ulangi test ini dengan larutan kasein 2 % dan putih telur. b. Isilah tabung reaksi dengan sedikit urea, panaskan diatas api kecil sehingga zat tersebut mencair dan terbentuk gelembung-gelembung gas (hatihati jangan sampai mengarang) perhatikan bau gas tersebut. Larutkan isi tabung tersebut dengan air 2ml dan lakukan tes Biuret seperti di atas. e. Test Xanthoprotein Prinsip : Reaksi ini berdasarkan nitrasi inti bensen yang terdapat dalam molekul protein. Senyawa nitro yang terbentuk berwarna kuning dan dalam lingkungan alkalis akan terionisasi dengan bebas dan warnanya menjadi lebih tua atau menjadi jingga. Prosedur :

Prinsip :

Campurlah 2 ml larutan albumin 2% dengan 1 ml HNO3 pekat. Perhatikan terbentuknya endapan berwarna putih. Panaskan hati-hati, endapan akan larut kembali dan larutan tersebut akan berubah menjadi kuning. Dinginkan di bawah kran dengan hati-hati (tetes demi tetes) tambahkan larutan alkali pekat (NaOH atau NH4OH). Ulangi percobaan dengan larutan kasein, larutan fenol 2% dan larutan putih telur. f. Pengaruh Logam Berat Prinsip : Apabila protein direaksikan dengan logam berat, maka protein akan mengalami koagulasi. Prosedur : Ke dalam 3 ml larutan albumin 2% tambahkan 5 tetes larutan HgCl2 2%. Ulangi percobaan dengan menggunakan Pb asetat 2% dan FeCl3 2%. 7. Koagulasi Protein dengan Pemanasan Prinsip : Protein dengan adanya pemanasan akan terdenaturasi dan akan membentuk endapan koloid. Prosedur : Isilah 2 tabung reaksi dengan 50 mg serbuk albumin. Tambahkan 5 ml air pada salah satu tabung. Letakkan kedua tabung pada penangas air mendidih dengan seringsering mengocoknya selama 15 menit, angkat keduanya, lalu dinginkan dan tambahkan 5 ml air pada tabung yang berisi albumin kering. Kocok keduanya lalu saring, pada filtrat dilakukan reaksi Biuret. VI. HASIL PENGAMATAN, PEMBAHASAN, DAN JAWABAN PERTANYAAN 1. Test Millon Hasil Pengamatan :

Larutan Uji Albumin 2% Kasein 2% Fenol 2% Putih Telur

Pengamatan Terbentuk endapan merah/koagulasi Terbentuk endapan koagulasi Larutan jernih, berwarna pink Terbentuk gumpalan berwarna merah

Hasil + + + +

kasein Putih telur Fenol 2 %

albumin

Jika garam merkuri ditambahkan ke dalam protein, akan terbentuk warna merah yang disebabkan oleh garam merkuri dari tirosin yang ternitrasi. Larutan protein terkoagulasi karena protein mengalami destruksi bentuk dimensi dari rantai polipeptida yang ikatannya akan pecah tanpa mengakibatkan pemecahan ikatan kovalen dari ikatan peptidanya. Pereaksi Millon terdiri dari HgNO3 dalam larutan HNO2 atau dapat juga dikatakan larutan ion merkuri/merkuro dalam asam nitrat/asam nitrit. Reaksi ini positif untuk monofenol dan derivat-derivatnya. Hasil positif ditunjukkan dengan adanya gumpalan putih yang dengan pemanasan berubah menjadi merah. Karena fenol bukan termasuk golongan protein, maka tidak terjadi koagulasi sehingga hanya terbentuk larutan jernih berwarna pink. Sedangkan pada albumin, kasein dan putih telur yang merupakan golongan protein, sehingga dengan adanya logam berat akan terjadi koagulasi.

2. Test Hopkins-Cole Hasil Pengamatan : Larutan Uji Albumin 2% Kasein 2% Putih Telur C Pengamatan Cincin ungu samara-samar larutan bawah Hasil + + +

putih jernih Cincin ungu, larutan bawah putih jernih Cincin ungu dan larutan bawah merah violet

Pereaksi Hopkins-cole terdiri dari asam glikosilat dalam H2SO4 pekat . hasil positif dari test ini ditunjukkan oleh timbulnya cincin ungu yang disebabkan karena adanya triptofan. Warna ungu ini ditimbulkan oleh gugus indol yang terkandung dalam triptofan. Dari hasil percobaan menunjukkan bahwa semua zat uji memberikan hasil yang positif. Sehingga dapat disimpulkan bahwa asam amino triptofan terdapat dalam kasein, albumin dan putih telur. Reaksi :CH2 CH COOH NH2

H

H

N H

+

C C

O H O H H2SO4 -H2O N H

O C OH

H

H

N H

Triptofan

As. glioksilat

As. 2,3,4,5-tetrahidrokarbolin-4-karboksilat

Tidak ada protein yang tidak memberikan hasil positif (semuanya positif). 3. Test Ninhidrin Hasil Pengamatan: Larutan Uji Albumin 2% Kasein 0,2% (NH4)2SO4 Putih Telur Pengamatan Larutan biru keunguan Larutan biru, ada endapan biru Larutan putih jernih Larutan biru keunguan, ada endapan putih di lapisan bawah Hasil + + +

Reaksi ini merupakan reaksi deaminasi serta dekarboksilasi dan menghasilkan gas CO2, gas NH3, hidrindatin dan suatu aldehida yang mempunyai jumlah atom C kurang satu dari asam amino semula. Gas NH3 dibebaskan dan hidrindatin akan bereaksi kembali dengan ninhidrin dan menghasilkan suatu senyawa kompleks diketohidrindilenadiketohidrinamina yang berwarna ungu atau biru. Reaksi:O OH OH + R CH COOH NH2 R C O H + O O OH H + CO2 + NH3

NinhidrinO OH + NH3 + H O O O OH OH

O

HidrindantinOH N O O O + 3H2O

Diketohidrindilena-diketohidrinamin Prolin dan hidroprolin memberikan warna kuning. Semua asam -amino, peptide dan protein akan memberikan warna ungu atau biru dengan ninhidrin. Disamping asam amino, persenyawaan amina yang lain juga akan bereaksi dengan ninhidrin dan menghasilkan senyawa yang berwarna biru. Tetapi pada reaksi yang terakhir ini tidak akan melepaskan CO2. Dari percobaan yang kami lakukan didapatkan albumin 2%, kasein 0,2% dan putih telur memberikan hasil positif, sedangkan (NH4)2SO4 memberikan hasil yang negatif. Hal ini dikarenakan (NH4)2SO4 merupakan garam amonium yang jika bereaksi dengan ninhidrin tidak melepaskan CO2, sehingga hasil yang didapat adalah larutan jernih. Dari hasil tersebut dapat disimpulkan bahwa albumin, kasein dan putih telur termasuk kedalam asam -amino. Warna yang terbentuk adalah ungu atau biru. Gugus yang memberikan hasil positif dalam test ninhidrin adalah asam -amino. Gugus tersebut dimiliki oleh albumin 2%, kasein 0,2 % dan putih telur.

4. Test Biuret

Hasil Pengamatan: Larutan Uji Albumin 2% Kasein 0,2% Putih Telur Urea Pengamatan Larutan berwarna ungu Larutan berwarna biru keunguan, ada partikel-partikel biru muda Lapisan atas berwarna biru keunguan, lapisan bawah berwarna putih Larutan berwarna keunguan, ada partikel-partikel biru muda Hasil + + + +

Putih telur Kasein

Albumin

Urea

Test biuret merupakan reaksi yang spesifik untuk persenyawaan yang memiliki paling sedikit dua ikatan peptide. Pereaksi biuret terdiri atas larutan NaOH 10% dan larutan CuSO4. Apabila protein ditambahkan dengan pereaksi biuret, maka akan dihasilkan larutan berwarna biru keunguan.

Dari hasil percobaan, baik albumin 2%, kasein 0,2% maupun putih telur memberikan hasil yang positif dengan membentuk larutan berwarna biru keunguan. Sehingga dapat disimpulkan bahwa albumin 2%, kasein 0,2%, dan putih telur memiliki sedikitnya 2 ikatan peptide. Sedangkan pada urea, walaupun urea bukan merupakan golongan protein, namun karena urea memiliki gugus NH2 seperti pada protein maka akan terbentuk warna ungu sebagai hasil reaksi antara Cu2+ dengan NH. Oleh karena itu, urea memberikan hasil positif pada uji biuret.pada pemanasan urea akan terbentuk gelembung gas yang mengeluarkan bau menyengat. Bau menyengat tersebut berasal dari gas NH3 (amoniak). Warna yang terbentuk adalah warna biru keunguan. Kelebihan CuSO4 harus dihindari karena Cu2+ berwarna biru intensif. Jika berlebihan, akan mengakibatkan warna ungu terkalahkan, sehingga hasilnya menjadi negatif. Selain itu, Cu merupakan logam berat, sehingga jika penggunaannya terlalu banyak maka albumin akan terdenaturasi membentuk koagulan. Pada suasana alkalis, akan terbentuk Cu(OH)2 dari reaksi : Cu2+ + 2OHCu(OH)2 Ungu

Reaksi pembentukan biuret dari urea O NH2 C NH2 O O C C NH 2 Cu C C NH2 O O Kompleks warna ungu NH3 Amoniak+

CO2

+

NH2

O C H2O

NH2

NaOH

+

CuSO4

+

NH2

O C

5. Test Xanthoprotein Hasil Pengamatan: Larutan uji Albumin 2% Pengamatan Kuning Kesimpulan +

NH2

NH2

NH2

Kasein 0,2% Putih telur Fenol 2%

Kuning Kuning Hijau

+ + -

Reaksi pada Xanthoprotein berdasarkan nitrasi inti benzene yang terdapat di dalam molekul protein dengan pereaksi HNO3 pekat. Senyawa nitro yang terbentuk berwarna kuning dan dalam lingkungan alkalis akan terionisasi dengan bebas dan warnanya menjadi lebih tua (jingga). Asam amino yang memberikan hasil positif terhadap Xanthoprotein adalah asam amino fenilalanin, triptofan, dan tirosin, karena ketiganya mengandung inti benzene.

Fenol Kasein Albumin Putih telur

Aquadest

Kasein berwarna kuning muda, bahkan hampir seperti aquadest

Reaksi:

CH2-CH-COOH + HNO3 (p) NH2 Fenilalanin

NO2

CH2-CH-COOH NH2

p-Nitrofenilalanin

Dari hasil percobaan diperoleh bahwa albumin dan kasein memiliki inti benzene sehingga memberikan hasil positif pada tes ini. Fenol juga memiliki inti benzen, sehingga hasilnya positif dengan warna larutan menjadi kuning kehijauan. Dari warna yang dihasilkan, terlihat bahwa albumin memiliki inti benzen lebih banyak daripada kasein. 6. Pengaruh Logam Berat Hasil Pengamatan: Larutan uji Albumin 2% + HgCl2 Putih telur + HgCl2 Albumin 2% + Pb asetat Putih telur + Pb asetat Albumin 2% + FeCl3 Putih telur + FeCl3 Pengamatan Menggumpal dan berwarna putih susu Menggumpal dan berwarna putih susu Menggumpal dan berwarna putih susu Menggumpal dan berwarna putih susu Albumin tidak menggumpal Putih telur menggumpal

Dari percobaan ini dapat diketahui bahwa protein dapat terkoagulasi sebagai akibat dari denaturasi protein. Denaturasi protein dapat terjadi karena adanya pengaruh dari logam-logam berat seperti Hg2+ dan Pb2+. Jika terjadi denaturasi protein, akan terjadi pula penurunan kelarutan protein dalam air, sehingga terbentuklah gumpalangumpalan putih. Logam berat dalam garam HgCl2 dan Pb asetat dapat berikatan dengan gugus SH dari protein dan dapat membentuk ikatan yang sangat kuat dengan gugus COO - dari asam aspartat dan asam glutamat yang terdapat dalam albumin. Ikatan inilah yang menyebabkan pecahnya ion dalam protein sehingga protein itu sendiri akan mengendap. Putih telur juga mengalami koagulasi dengan logam berat karena mengandung albumin di dalamnya. Sedangkan dengan penambahan FeCl3 tidak menyebabkan koagulasi karena Fe bukan logam berat. Penambahan logam berat baik Hg2+ maupun Pb2+ sama-sama menyebabkan koagulasi dari albumin dan putih telur. Putih telur dapat digunakan sebagai antidotum logam berat karena putih telur mengandung albumin sehingga apabila tubuh keracunan logam berat maka ion logam tersebut akan bereaksi dengan albumin membentuk koagulasi sehingga logam berat tersebut tidak akan mengganggu atau merusak aktivitas enzim lain di dalam tubuh. Hasil Pengamatan: Larutan uji Albumin + air Albumin kering Pengamatan Larutan dan endapan biru keunguan, protein terkoagulasi Larutan biru keunguan, protein tak terkoagulasi

Albumin kering + air

Albumin + air

Pemberian energi berupa panas akan memutuskan ikatan hidrogen dan akan menyebabkan terjadinya koagulasi protein. Pada koagulasi protein, dengan pemberian panas (pemanasan) diperlukan air. Protein yang tanpa air dengan pemanasan akan terjadi denaturasi namun tidak terjadi koagulasi. Koagulasi adalah proses penggumpalan yang tidak selalu menyertai denaturasi. Dari percobaan yang dilakukan dapat diketahui bahwa koagulasi protein memerlukan air. Hal ini terlihat saat praktikum, ketika tabung yang berisi serbuk albumin dilarutkan dengan air, setelah dipanaskan akan menghasilkan koagulan. Sedangkan pada tabung yang berisi albumin tanpa air walaupun dipanaskan tidak terjadi koagulasi. Namun, setelah ditambah air terjadi koagulasi, sehingga terjadi endapan. VII. KESIMPULAN - Test Millon untuk protein dengan gugus monofenol - Test Hopkins-cole untuk asam amino triptofan - Test Ninhidrin untuk asam -amino - Test Biuret untuk test umum protein - Test Xanthoprotein untuk asam amino dengan inti benzene 2. Denaturasi protein dapat terjadi karena

1. Pengujian terhadap asam amino dapat dilakukan dengan :

- Pemanasan pada suhu tinggi - Penambahan asam - Adanya logam berat 3. Kandungan protein: - Albumin: protein (+),gugus monofenol, asam amino triptofan, asam -amino, asam amino dengan inti benzene - Kasein: protein (+), gugus monofenol, asam amino triptofan, asam -amino, asam amino dengan inti benzene - Putih telur: protein (+), gugus monofenol, asam amino triptofan, asam -amino, asam amino dengan inti benzene - Fenol: gugus monofenol, asam amino dengan inti benzene - (NH4)2SO4: tidak ada asam -amino 4. Pengaruh logam berat pada protein: - Albumin: HgCl2, PbAc. - Putih telur: HgCl2, PbAc, FeCl3. VIII. DAFTAR PUSTAKA Murray RF; Granner; Rodwell V. Biokimia Harper edisi 25. Penerbit buku kedokteran. Jakarta:1995. Dra Azizahwati. Penuntun Praktikum Biokimia. Laboratorium Biokimia Jurusan Farmasi FMIPA UI : 2006