artikel-sudarko

5/10/2018 artikel-sudarko - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/artikel-sudarko 1/14

MODIFIKASI ASETILKOLINESTERASE

DENGAN MUTASI KOMBINASI SECARA IN SILICO

UNTUK BIOSENSOR ORGANOFOSFAT

Sudarko, Devit Suwardiyanto, dan A.A. Istri Ratnadewi2)

Jurusan Kimia, FMIPA, Universitas Jember

ABSTRAK

Pengawasan lingkungan dari pestisida yang mempengaruhi kesehatan

manusia dan ekosistem, telah menjadi pusat perhatian karena penggunaan pestisida di dunia. Deteksi pestisida di lingkungan dapat dilakukan dengan biosensor yang menggunakan asetilkolinesterase. Dalam penelitian ini telahdilakukan modifikasi asetilkolinesterase Torpedo californica secara in silico(simulasi komputer). Modifikasi ini bertujuan untuk meningkatkan sensitifitas dankespesifikan terhadap organofosfat. Modifikasi asetilkolinesterase dilakukansecara in silico dengan program Modeller 6.2 dan untuk mengetahui efek modifikasi terhadap sensitifitas dan kespesifikannya digunakan programAutoDock 3.0. Strategi yang digunakan untuk memperoleh mutan yaitu dengankombinasi mutan tunggal yang diharapkan dapat meningkatkan sensitifitas enzimterhadap organofosfat. Dalam penelitian ini tidak dapat memperoleh

asetilkolinesterase yang lebih sensitif dan spesifik terhadap organofosfat.Kesulitan prediksi efek mutasi terhadap inhibisi organofosfat terjadi karenaadanya dua model pengikatan organofosfat yang dipengaruhi oleh konsentrasi.

Namun dengan strategi ini diperoleh mutan yang lebih sensitif dan spesifik terhadap karbamat. Hasil terbaik untuk peningkatan sensitifitas dan kespesifikankarbamat terjadi pada mutan F330A dengan peningkatan k i sebesar 0,42 untuk karbaril dan 0,31 untuk karbofuran.

Kata kunci: asetilkolinesterase, biosensor, insektisida, pemodelan homologi,docking .

1



MODIFICATION ACETYLCHOLINESTERASE WITH

COMBINATION MUTATION BY IN SILICO

FOR BIOSENSOR ORGANOPHOSPHATE

Sudarko, Devit Suwardiyanto, dan A.A. Istri Ratnadewi

Department of Chemistry, Faculty of Mathematics and Natural SciencesUniversity of Jember

ABSTRACT

To detect traces of insecticides in environment using biosensors, weengineered Torpedo c. acetylcholinesterase (AChE) by in silico to increase itssensitivity and spesifity to organophosphate. The mutant made by homology

program using MODELER 6.2 modules of TRITON 3.0. To show the effect of modification, we use AUTODOCK 3.0 program. Mutant ACHe was obtainsthrough the combination of several mutations that increase sensitivity toorganophosphate. Two types of insecticides that used in this research, isorganophosphate and carbamate. Carbamate will be use as comparator for lookingspecification AChE to organophosphate. In this research, AChE that moresensitive to organophosphate cannot be obtains. The difficulty of predicting the

effect mutation, because there are two binding models that influence byconcentration. Nevertheless, the use of these strategies allowed us to obtain AChEwhich more sensitive to carbamate. The best result that increase sensitivity andspecifity to carbamat are mutant F330A. Mutant F330A increase the inhibitionconstant about 0.42 for carbaryl and 0.31 for carbofuran.

Key words: Acetylcholinesterase, biosensor, insecticide, homology modeling,docking.

2



PENDAHULUAN

Pengawasan lingkungan dari pestisida yang mempengaruhi manusia dan

ekosistem, telah menjadi pusat perhatian. Organofosfat dan karbamat merupakan

pestisida yang banyak digunakan dan memiliki kemampuan untuk menggantikan

organoklorin seperti DDT, aldrin, lindane, dan lain-lain. Pestisida ini memiliki

persistansi lingkungan yang rendah dibanding organoklorin, tetapi memiliki

tingkat keracunan yang lebih tinggi (Kok et al., 2002).

Biosensor berdasar inhibisi pada aktifitas beberapa enzim telah digunakan

untuk pengukuran polutan dalam lingkungan (Kuswandi and Mascini, 2005). Hal

ini, karena sistem sensor tersebut telah mampu memberikan cara analisis suatu

polutan secara cepat, mudah dan handal pada jumlah renik. Dalam pengembangan

biosensor, penggunaan enzim sangat bermanfaat dan menjanjikan (Kuswandi and

Narayanaswamy , 1998; Wolfbies and Li, 1993).

Dari penelitian yang telah dilakukan Kovarik et al (2003) dapat diketahui

bahwa subtitusi residu F338A dan Y337A (penomoran berdasarkan

asetilkolinesterase tikus), menghasilkan peningkatan konstanta inhibisi

organofosfat sebesar dua kali lipat. Mutasi yang sama dapat dilakukan pada

asetilkolinesterase Torpedo c., yaitu pada F331 dan Y334 (Barril et al., 2001).

Modifikasi asetilkolinesterase Drosophila m. untuk deteksi insektisida

yang dilakukan oleh Boublik et al (2002), menunjukkan bahwa mutasi F330L,

Y370A, dan F371I dapat meningkatkan sensitifitas enzim terhadap organofosfat.

Subtitusi residu F371I menghasilkan sensitifitas yang lebih tinggi dibanding

subtitusi residu F371A. Mutasi yang sama dapat dilakukan pada

asetilkolinesterase Torpedo c., yaitu pada residu F290, Y330, dan F331.

Salah satu strategi untuk meningkatkan kinerja asetilkolinesterase untuk

biosensor organofosfat adalah dengan meningkatkan kespesifikan dan sensitifitas

enzim terhadap organofosfat. Pada penelitian ini dilakukan modifikasi sisi aktif

asetilkolinesterase secara in silico (simulasi komputer), selanjutnya untuk

mengetahui kespesifikan dan sensitifitas enzim hasil modifikasi tersebut

3



dilakukan uji interaksi antara enzim hasil modifikasi dengan substrat maupun

beberapa jenis inhibitor (heptenofos, diklorfos, karbofuran, karbaril).

METODE PENELITIAN

Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Mei 2005 sampai Juni 2005 di

Jurusan kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas

Jember. Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain; komputer Intel

Xeon 2,4 MHz dual prosessor dengan memori 512 MB dan system operasi Linux

Debian Sarge Testing yang dilengkapi dengan program aplikasi AutoDockTools,

Autodock 3.05 dan TRITON 3.0; serta komputer Intel Pentium 4 2,26 MHz

dengan memori 128 MB dan sistem operasi Microsoft Windows XP Pro, Linux

Debian Sarge Testing yang dilengkapi dengan program aplikasi AutoDockTools,

AutoDock 3.05, Pymol dan ChemOffice 2000.

Preparasi Ligand dan Protein

Ligand dibuat menggunakan ChemOffice 2000. Pertama, struktur 2D

ligand digambar dengan ChemDraw Ultra (modul ChemOffice 200). Kemudian,

struktur 2D diekspor ke struktur 3D dengan Chem3D. struktur 3D diminimalisasi

energinya dengan teori PM3 dalam MOPAC 7 (modul ChemOffice 200). Struktur

mutan dan wild type Torpedo c. dibuat dengan mutasi virtual dari pemodelan

homologi.

Pemodelan Homologi

Struktur X-ray tunggal digunakan sebagai template untuk pemodelan

homologi. Struktur X-ray diperoleh dari protein data bank (E105). Data struktur

dimanipulasi menggunakan MODELLER 6.2 yang terdapat pada TRITON 3.0.

MODELLER mengimplementasikan pendekatan pemodelan menggunakan

perbandingan struktur protein (Sali et al., 1993). Pemodelan dimulai dengan

penataan sequence yang akan dimodelkan (target) dengan struktur protein tiga

dimensi yang telah diketahui (cetakan). Setelah itu dilakukan penghitungan

batasan pada sequence target yang dihitung dari penataannya dengan struktur tiga

dimensi template. Batasan tersebut diperoleh dari analisis statistik hubungan

pasangan-pasangan protein homolog. Analisis ini berdasar pada database penataan

4



105 famili yang termasuk 416 protein yang telah diketahui strukrur tiga

dimensinya (Sali et al., 1994). Dengan penelusuran database, akan diperoleh tabel

mengenai berbagai korelasi, seperti korelasi antara jarak ekivalen Cα - Cα, atau

sudut dihedral dari dua protein yang berhubungan. Selanjutnya, batasan hubungan

dan term energi CHARM memperkirakan stereokimia yang cocok, dan

mengombinasikannya ke dalam fungsi objektif. Terakhir, model diperoleh dengan

mengoptimasi fungsi objektif dalam ruang kartesian (Sali et al., 2004).

Docking

AutoDock merupakan program yang dikembangkan untuk memprediksi

interaksi ligand dengan target biomakromolekul. Dalam AutoDock, ligand pada

awalnya diacak diluar protein, kemudian melakukan translasi, orientasi, dan

konformasi sampai sisi ideal ditemukan (Morris et al., 1998). Program

AUTOTORS menentukan ikatan yang mungkin berotasi pada molekul ligand.

Titik grid yang digunakan dalam penelitian ini sebesar 80x80 dengan spasi grid

3,75 Å yang dipusatkan pada sisi aktif serin. Energi potensial setiap titik grid

dihitung menggunakan program AUTOGRID. Kemudian program AutoDock

menghitung energi interaksi antara konformasi ligand fleksibel dan setiap titik grid melalui kombinasi algoritma pencarian. Tahap translasi yang digunakan

sebesar 0,2 Å dan tahap rotasi 5°. Posisi awal dan sudut dihedral dipilih secara

acak dan terakhir simulasi 150 docking dijalankan untuk memperoleh struktur

kompleks dari ligand yang secara statistik diterima.

AutoDock 3.0 dapat menggunakan algoritma genetik (AG) Lamarckian

sebagai fungsi pencarian untuk simulasi docking . Konsep AG berdasar pada

evolusi biologis. Dalam simulasi docking, penataan ligand didefinisikan dengansebuah set variabel keadaan yang mendefinisikan translasi, orientasi, dan

konformasi ligand. Dalam AG, setiap variabel sesuai dengan genotip dan

koordinat atom sesuai dengan fenotip. Dari gen tersebut, fenotip ligand dapat

dihitung energinya berdasar fungsi energi bebas.

AutoDock menggunakan AG sebagai metode pencarian global dan sebuah

pencarian lokal (PL) adaptive. Pencarian lokal diturunkan dari sebuah algoritma

oleh Solis dan Wets, dimana langkah-langkahnya ditentukan, dan konformasi baru

5



yang diperoleh dievaluasi dengan fungsi energi. Perubahan energi antara dua

konformasi dihitung seperti pada algoritma Monte Carlo. Jika perubahannya lebih

disukai, maka diterima dan sebalikknya jika tidak, maka algoritma akan

mengambil langkah yang berlawanan (Morris et al, 2001).

HASIL DAN PEMBAHASAN

Proses Mutasi in Silico

Mutasi kombinasi mutan tunggal pada asetilkolinesterase, yang meliputi

F288L, F290L, F330A, F331I, dan Y334A dilakukan dengan program

MODELLER. Proses tersebut membutuhkan waktu kurang lebih 40 menit untuk

tiap mutan. Kombinasi kelima macam mutan tunggal tersebut menghasilkan tiga

puluh dua macam mutan termasuk asetilkolinesterase asli (wild type) hasil

optimasi MODELLER.

Efek Mutasi Asetilkolinesterase pada Substrat

Asetilkolin sebagai substrat didocking ke semua mutan dan dibandingkan

hasilnya dengan asetilkolinesterase wild type. Proses perhitungan docking

membutuhkan waktu rata-rata delapan jam tiap perhitungan. Dari hasil docking

diketahui bahwa mutan tunggal dan kombinasinya meningkatkan k 1 substrat (data

hasil docking pada semua mutan tidak ditampilkan pada artikel ini).

Kombinasi mutan tunggal yang dilakukan dalam penelitian ini

menyebabkan bertambah besarnya ruang gorge asetilkolinesterase. Bertambahnya

ukuran ruang menyebabkan energi internal ligand berkurang dan substrat lebih

mudah ke sisi aktif, sehingga k 1 substrat meningkat. Pada beberapa mutan,

perbesaran ruang gorge menyebabkan perubahan orientasi substrat. Dari hasil

docking , beberapa mutan memilki probabilitas pengikatan substrat pada sisi

periperal.

Ikatan asetilkolin seperti pada gambar 1, distabilkan oleh kantung oksi

anion yang terdiri dari residu G118, G119, dan A201. Gugus asetil asetilkolin

terikat pada kantung oksi anion melalui ikatan hidrogen antara gugus karbonil

asetilkolin dengan gugus NH peptida. Gugus ekor kuarterner trimetilamonium

terikat pada sisi anionik yang terdiri dari residu W84, Y130 dan E199. W84 dan

6



Y130 berikatan dengan bagian kation melalui interaksi kation-π dan interaksi

hidrofobik, sedangkan E199 melalui interaksi elektrostatik.

Gambar 1. Model Pengikatan Substrat pada Sisi Aktif Serin

Dari data probabilitas orientasi substrat dapat dikelompokkan substrat

yang memiliki jumlah probabilitas orientasi substrat ke sisi aktif serin dengan

nilai lebih besar dari 50% disajikan pada gambar 2.

0.00

2.00

4.00

6.00

8.00

10.00

12.00

14.00

16.00

18.00

20.00

W i l d

T y p e F 2

8 8 L

F 3 3 0

A F 3

3 1 I

F 2 8 8 L / F

2 9 0 L

F 2 8 8 L / F

3 3 0 A

F 2 8 8 L / Y

3 3 4 A

F 2 9 0 L / F

3 3 0 A

F 2 9 0 L / F

3 3 1 I

F 2 9 0 L / Y

3 3 4 A

F 3 3 0

A / Y 3

3 4 A

F 3 3 1 I / Y

3 3 4 A

F 2 8 8 L / F

3 3 0 A

/ Y 3 3

4 A

F 2 8 8 L / F

3 3 1 I / Y 3 3

4 A

F 2 9 0 L / F

3 3 0 A

/ Y 3 3

4 A

F 2 9 0 L / F

3 3 1 I / Y 3

3 4 A

Mutan

k i

( 1 0 - 5 )

Gambar 2. Grafik K 1 Substrat dengan Probabilitas Lebih Besar dari50%

Efek Mutasi Asetilkolinesterase pada Inhibisi Organofosfat

Data hasil perhitungan docking heptenofos dapat dibuat grafik seperti

pada gambar 3 (grafik hanya menampilkan mutan yang orientasi substratnya ke

sisi aktif serin).

7



0.000

0.200

0.400

0.600

0.800

1.000

1.200

W i l d

T y p e F 2

8 8 L

F 3 3 0

A F 3

3 1 I

F 2 8 8 L / F

2 9 0 L

F 2 8 8 L / F

3 3 0 A

F 2 8 8 L / Y

3 3 4 A

F 2 9 0 L / F

3 3 0 A

F 2 9 0 L / F

3 3 1 I

F 2 9 0 L / Y

3 3 4 A

F 3 3 0 A / Y 3

3 4 A

F 3 3 1 I / Y

3 3 4 A

F 2 8 8 L / F

3 3 0 A

/ Y 3 3

4 A

F 2 8 8 L / F

3 3 1 I / Y 3

3 4 A

F 2 9 0 L / F

3 3 0 A

/ Y 3 3

4 A

F 2 9 0 L / F

3 3 1 I / Y 3

3 4 A

Mutan

k i (

1 0 - 5 )

Gambar 3. Grafik Konstanta Inhibisi Heptenofos

Dari gambar di atas diketahui bahwa mutan F290L/F330A memilki k i yang

lebih tinggi dari wild type. K i heptenofos pada mutan F290L/F330A mengalami

peningkatan k i sebesar 0,105 x 10-5 terhadap k i wild type. Akan tetapi mutan

tersebut tidak dapat digunakan karena terjadi peningkatan k 1 substrat yang cukup

besar, yaitu sebesar 4,44 x 10-5.

Mutan F290L/F330A memiliki orientasi pengikatan heptenofos pada sisi

periperal, seperti pada gambar 4. Heptenofos membentuk ikatan hidrogen denganresidu S122 dan terjadi interaksi dipol-dipol induksi antara gugus C=O residu N85

dan Y70 dengan gugus –CH3 organofosfat.

Gambar 4. Ikatan Heptenofos pada Mutan F290L/ F330A

Data hasil perhitungan docking diklorfos dapat dibuat grafik seperti pada

gambar 5 berikut:

8



0

5

10

15

20

2530

35

40

45

W i l d

T y p e F 2

8 8 L

F 3 3 0

A F 3

3 1 I

F 2 8 8 L / F 2

9 0 L

F 2 8 8 L / F

3 3 0 A

F 2 8 8 L / Y

3 3 4 A

F 2 9 0 L / F

3 3 0 A

F 2 9 0 L / F

3 3 1 I

F 2 9 0 L / Y

3 3 4 A

F 3 3 0

A / Y 3

3 4 A

F 3 3 1 I / Y

3 3 4 A

F 2 8 8 L / F

3 3 0 A

/ Y 3 3

4 A

F 2 8 8 L / F

3 3 1 I / Y 3

3 4 A

F 2 9 0 L / F

3 3 0 A

/ Y 3 3

4 A

F 2 9 0 L / F 3

3 1 I / Y

3 3 4 A

Mutan

k i (

1 0 - 5 )

Gambar 5. Grafik Konstanta Inhibisi Diklorfos

Dari gambar 5 diketahui bahwa mutan F290L/F330A/Y334A memiliki k i

yang lebih tinggi dari wild type. Konstanta inhibisi diklorfos mutan

F290L/F330A/Y334A mengalami peningkatan sebesar 4,2 x 10-5 terhadap k i wild

type. Akan tetapi pada mutan tersebut juga terjadi peningkatan k 1 substrat yang

cukup besar, yaitu 65,75 x 10-5. Model pengikatan diklorfos pada mutan

F290L/F330A/Y334A seperti pada gambar 6.

Gambar 6. Ikatan diklorfos pada mutan F290L/F330A/Y334A

Dari hasil docking diperoleh probabilitas terbesar pengikatan organofosfat

terjadi pada sisi periperal dan hanya beberapa run (ulangan) yang menghasilkan

orientasi organofosfat ke sisi aktif. Pada asetilkolinesterase wild type yang

diinhibisi diklorfos, diperoleh tiga belas run dari 150 run yang menunjukkan

orientasi ligan ke sisi aktif. Sedangkan yang mengunakan inhibitor heptenofos

diperoleh dua belas run dari 150 run. Probabilitas pada mutan lainnya juga

menunjukkan kecenderungan pengikatan ke sisi periperal. Hal tersebut

9



menunjukkan bahwa organofosfat juga dapat langsung memfosforilasi sisi

katalitik tanpa berikatan dengan sisi periperal terlebih dahulu walaupun dengan

probabilitas yang kecil.

Secara keseluruhan, pemodelan inhibisi organofosfat pada

asetilkolinesterase dengan AutoDock tidak dapat memprediksi pengaruh mutasi.

Hal tersebut disebabkan inhibisi organofosfat memiliki lebih dari satu tahap

inhibisi dan dipengaruhi oleh konsentrasi. AutoDock memiliki keterbatasan tidak

dapat memprediksi model inhibisi yang dipengaruhi oleh konsentrasi. AutoDock

hanya dapat memprediksi probabilitas terbesar keadaan akhir model pengikatan

suatu ligand pada makromolekul.

Ada dua macam model inhibisi organofosfat, yaitu fosforilasi irreversibel

pada sisi aktif dan interaksi reversibel pada sisi periperal (Friboult et al , 1990).

Pengikatan organofosfat pada asetilkolinesterase juga dipengaruhi oleh

konsentrasi organofosfat. Pada konsentrasi rendah organofosfat menyerang sisi

periperal. Ketika sisi periperal telah jenuh, organofosfat akan menyerang sisi aktif

serin (Kardos and Sultatos, 2000).

Model kinetika inhibisi organofosfat pada sisi periperal asetilkolinesterase

dapat diilustrasikan pada gambar 7. Konstanta kecepatan k +1 dan k -1 menjelaskan

ikatan reversibel AB ke sisi periperal, dan dua titik sebelah kiri asetilkolinesterase

menunjukkan ikatan reversibel AB ke sisi periperal. k i’ menunjukkan perubahan

k i sebagai hasil adanya ikatan pada sisi periperal. Sedangkan k 3 menunjukkan

reaktifasi enzim (Kardos and Sultatos, 2000).

AB

ABAB

B

AB + AChE AChE-A AChE

+ +

AB + AB AChE AChE-A AChE

k i k 3

k -1k +1

k i' k 2

+

Gambar 7. Kinetika Inhibisi Organofosfat pada Asetilkolinesterase(Kardos and Sultatos, 2000).

Dengan mendocking ulang kompleks ligand yang telah terikat pada sisi

periperal asestilkolinesterase akan diperoleh kompleks organofosfat yang terikat

10



di sisi periperal dan sisi aktif sekaligus. Organofosfat kedua memiliki probabilitas

100% masuk ke sisi aktif asetilkolinesterase dengan nilai k i sebesar 1,31 x 10-5

untuk heptenofos dan 4,14 x 10-5 untuk diklorfos. Hal tersebut sesuai dengan

asumsi Kardos and Sultatos (2000) bahwa organofosfat dapat membentuk

kompleks AB--AChE-A.

Efek Mutasi Asetilkolinesterase pada Inhibisi Karbamat

Dari hasil docking karbaril dan karbofuran pada semua asetilkolinesterase

mutan dan wild type dapat dibuat grafik seperti pada gambar 8. Untuk

memperoleh mutan yang spesifik untuk karbamat, perlu dibandingkan konstanta

inhibisi karbaril dengan karbofuran. Mutan yang memiliki peningkatan konstanta

inhibisi yang hampir sama bersifat spesifik untuk karbamat.

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

W i l d

T y p e

F 2 8 8 L

F 3 3 0

A F 3

3 1 I

F 2 8 8 L / F

2 9 0 L

F 2 8 8 L / F

3 3 0 A

F 2 8 8 L / Y

3 3 4 A

F 2 9 0 L / F

3 3 0 A

F 2 9 0 L / F

3 3 1 I

F 2 9 0 L / Y

3 3 4 A

F 3 3 0

A / Y 3

3 4 A

F 3 3 1 I / Y

3 3 4 A

F 2 8 8 L / F

3 3 0 A

/ Y 3 3

4 A

F 2 8 8 L / F

3 3 1 I / Y 3

3 4 A

F 2 9 0 L / F

3 3 0 A

/ Y 3 3

4 A

F 2 9 0 L / F

3 3 1 I / Y 3

3 4 A

Mutan

k i (

1 0 - 5 )

Karbaril

Karbofuran

Gambar 8. Grafik Perbandingan Konstanta Inhibisi Karbarildengan Karbofuran

Jika dibandingkan dengan k 1 substrat maka mutan yang paling bagus

adalah F330A dan F331I. Pada mutan F331I k 1 karbaril meningkat dari 1,42x10-5

ke 1,78 x10-5 dan k 1 karbofuran meningkat dari 1,02x10-5 ke 1,45x10-5. Model

pengikatan karbaril pada mutan F331I ditunjukkan pada gambar 9. Atom oksigen

karbonil karbaril berikatan hidrogen dengan residu S200 dan gugus benzil

mengarah pada sisi anionik. Inhibisi karbofuran mengalami perubahan orientasi

ligan. Orientasi ligan berubah dari sisi esterase ke sisi periperal, seperti

ditunjukkan pada gambar 10. Perubahan tersebut disebabkan perbesaran ruang

11



kantung asil dan perubahan kepolaran residu 331. Subtitusi F331I menyebabkan

berkurangnya kepolaran residu tersebut.

Gambar 9. Inhibisi Karbaril pada Mutan F331I

Gambar 10. Inhibisi Karbofuran pada Mutan F331I

Subtitusi residu F330A menghasilkan k 1 yang hampir sama dengan mutan

F331I. Peningkatan k 1 ini sesuai dengan eksperimen secara in vitro yang dilakukan

oleh Boublik et al (2002) pada Drosophila m. Konstanta inhibisi karbaril

meningkat dari 1,42x10-5 ke 1,84 x10-5 dan konstanta inhibisi karbofuran

meningkat dari 1,02x10-5 ke 1,33x10-5. Mutan F330A bersifat lebih spesifik untuk

karbamat dibandingkan dengan mutan F331I. Seperti pada gambar 11 dan 12,

orientasi karbamat tetap pada sisi aktif serin dan tidak menyebabkan perubahan

yang besar pada aktifitas asetilkolinesterase terhadap substrat. Subtitusi F330A

tidak mempengaruhi ruang kantung asil. Gugus CH3 karbofuran berinteraksi

dengan gugus A330 melalui interaksi hidrofobik. Gugus benzil karbaril dan

karbofuran mengarah pada sisi anionik.

12



Gambar 11. Inhibisi Karbaril pada Mutan F330A

Gambar 12. Inhibisi Karbofuran pada Mutan F330A

KESIMPULAN DAN SARAN

Pengaruh modifikasi asetilkolinesterase terhadap inhibisi organofosfat

tidak dapat diprediksi menggunakan AutoDock 3.0 karena organofosfat memiliki

dua model pengikatan, yaitu pengikatan ligand pada sisi periperal dan sisi aktif

serin. Oleh sebab itu perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mempelajari

mekanisme inhibisi organofosfat.

Mutan yang spesifik untuk karbamat yaitu mutan F330A. Mutan F330A

memiliki konstanta inhibisi satu setengah kali lebih besar dibanding dengan

asetilkolinesterase wild type. Dari hasil penelitian ini perlu dilakukan eksperimen

lebih lanjut untuk memperoleh asetilkolinesterase yang lebih spesifik dan sensitif

untuk karbamat, yaiutu dengan subtitusi residu F330A.

Referensi

Barril, X., Kalko, S. G., Orozco, M. and Luque, F. J., 2002. Rational Design of Reversible Acetylcholinesterase Inhibitors. Mini Review in Medicinal

Chemistry. 2:27-36.

13



Boublik, Y., Aguet, P. S., Lougarre, A., Arnaud, M., Villatte, F., Mondacca, S. E.,and Fournier, D. 2002. Acetylcholinesterase engineering for detection of

insecticide residues. Protein Eng. 15: 43-50.Friboult, A., Rieger, F., Goudou, D., Amitai, G., and Taylor, P. 2000. Interaction

of an organophosphate with peripheral site on acetylcholinesterase. Biochemistry, 29: 914-920.

Kardos, S.A., and Sultatos, L.G. 2000. Interactions of the Organophosphates

Paraoxon and Methyl Paraoxon with Mouse Brain Asetilkolinesterase.Toxicological Sciences, 58: 118-126.

Kok, F.N, Bozoglu, F., and Hasirci, V. 2002. Constustion of an

Acethylcholinesterase-Choline oxidase biosensor for aldicarb detection.

Biosensors and Bioelectronics, 17: 531-539.Kovarik, Z., Radic, Z. Berman, H.A., Simeon-rudolf, V., Reiner, E., and Taylor,

P. 2003. Acetylcholinesterase Active Center and Gorge Conformation

Analised by Combinatorial mutations and Enantiomeric Phosphonates. Biochem.J. 373: 33-40.

Kuswandi, B. and Narayanaswamy. R. 1998. A Simple Optical Flow Injection Ammonia sensors. Anal.Lett , 31: 395-410.

Kuswandi, B and Mascini, M. 2005. Enzyme Inhibition Based Biosensor for Environmental Monitoring . Current Enzyme Inhibition, 1: 11-20. BenthamScience Publisher Ltd.

Morris, G. M., Goodsell, D. S., Halliday, R. S., Huey, R., Hart, W. E., Belew, R.K., and Olson, A. J., 1998. Automated Docking Using a Lamarkian

Genetic Algorithm and an Empirical Binding Free Energy Function. J.

Comp. Chem. 19: 1639-1662.

Morris, G. M., Goodsell, D. S., Huey, R., Hart, W. E., Halliday, S., Belew, R., andOlson, A. J. 2001. User’s Guide : AutoDock Version 3.0.5.

Sali, A. and Overington, J. P. 1994. Derivation of rules for comparative protein

modeling from a databse of protein structure aligments. Protein Science,3: 1582-1596.

Sali, Andrej. Webb, B., Madhusudhan, M.S., Shen, M.Y., Renom, M.A.M.,Eswar, N., Alber, F., Oliva, B., Fiser, A., Sanchez, R., Yerkovich, B.,Badretdinov, A., Melo, F., Overington, J.P., and Feyfant, E. 2004 Manual

: MODELLER (A Program for Protein Structure Modeling), Release 7v7.Wolfbies, O.S and Li, H.1993. Flourescence Optical Urea Biosensor with an

Ammonium Optrode as Transducer. Biosensors&Bioelectronics , 8: 161-166

14

artikel-sudarko

Documents