Analisa Polimorfisme Promoter Gen apo A1 (-75 G/A) dan gen apoB (G4154), Pada Retinopati Diabetik DM Tipe-

2

Ririn Nislawati, Tenri Esa, Reini Meilani

Fakultas Kedokteran Universitas Hasanuddin, Makassar.

Prevalensi Diabetes Mellitus

Di Indonesia prevalensi DM ditahun 2010 diperkirakan 4,6%.

Prevalensi DM di Indonesia :

20021994

1998 2010

2,5

3,5

4,0

4,6

Zainal A : PIT- Perdami Medan 2006

Komplikasi Diabetes mellitus

DM : asimptomatik dalam waktu lama

Retinopati Diabetik : datang dengan penurunan visus, oleh karena itu perlu deteksi dini faktor-faktor risiko sebelumnya.

Retinopati Diabetika (RD)

• Disfungsi yang bersifat progresif, pada pembuluh darah retina akibat hyperglikemia kronik

• Merupakan komplikasi mikrovaskuler dari DM-1 / DM-2

• Awalnya bersifat asimptomatik, jika tidak diterapi dapat berakibat pada penurunan tajam penglihatan hingga kebutaan

Prevalensi retinopati diabetika ( DM tipe 1 dan DM tipe-2).

WESDR study mengatakan :

• Penderita DM 25 kali lebih besar kemungkinannya untuk menjadi buta dibandingkan non diabetes.

• Durasi DM berhubungan secara langsung dengan prevalensi retinopati.

• Bertanggungjawab terhadap 12% dari kasus baru kebutaan akibat retinopati setiap tahun.

• Setelah 20 tahun, 99% penderita DM tipe 1 dan hampir 80% penderita DM tipe 2 menderita retinopati.

• Sekitar 3,6% penderita DM tipe 1 dan 1,6% penderita DM tipe-2 mengalami kebutaan;

Klasifikasi retinopati diabetik

I. NPDR : Nonproliferative diabetic retinopathy

Perdarahan intra retina (blot-dot) Hard exudate

Pelebaran pembuluh darah

Normal

Perdarahan pre-retina

Neovaskularisasi

NeovaskularisasiPada optik disc

Jaringan proliferasidd

III. Edema Makula

II. PDR : Proliferative diabetic retinopathy)

Hard Exudate

Diabetes Mellitus

- faktor hyperglikemia- faktor dislipidemia- faktor komplikasi lainnya- faktor genetik

Retinopati diabetikDisfungsi endotel & kehilangan perisit Hyperlipidemia / dislipidemia peningkatan viskositas darah ekstravasasi cairan dan lipid (hard exudat) perdarahan dan edema retina kebutaan

DDD

D

Keterlibatan lipid dan polimorfisme promoter gen apo A1 dan gen apoB pada retinopati diabetika masih menimbulkan kontroversi - membutuhkan eksplorasi lebih lanjut

Disruption of the vascular Unit of the Retina by Diabetes.

Normal pattern Disruption of vascular unit

Apo A1 dan polimorfisme promoter gen apo A1

Apo A1 :1. komponen protein utama HDL2. Memiliki efek anti inflamasi ,

antioksidan & anti trombotik

3. Media transportasi kolesterol 4. Kadar rendah apoA1 dan HDL memicu terjadinya

retinopati

4. Polimorfisme promoter gen apoA1 -75 (M1-) (G/A)

Menurunkan kadar apoA1 dan HDL

Apo A1 dan HDL (plasma)

Anti inflamasi, anti oksidasi, anti trombotik, anti

aterogenik

Bersifat protektif, good cholesterol

Polimorfisme promoter gen apoA1

Apo A1 dan HDL (plasma) menurun

Apo A1 adalah komponen protein

utama HDL

CVD dan penyakit

vaskuler lainnya

Apo B dan polimorfisme gen apo B

Apo B :

1. komponen utama LDL, dan VLDL dan Lp(a)

2. Memiliki efek aterogenik

3. Kadar tinggi apoB dan LDL efek destruktif terhadap sel-

sel vaskular arteri termasuk arteri retinal.

4. Polimorfisme gen apo B exon 29 G/A (Gln4154Lys) :

Meningkatkan kadar apoB dan LDL memicu

terjadinya retinopati lebih berat

Apo B dan LDL (plasma)

Bersifat aterogenik, bad cholesterol

Polimorfisme gen apoB

Ketidakmampuan berikatan apoB dgn LDL

Apo B adalah ligan dari reseptor LDL partikel utk LDL

clearence

Peningkatan kadar apo B dan LDL dalam plasmaCVD dan

penyakit vaskuler lainnya

Apolipoprotein dan Retinopati diabetika ?

• Apolipoprotein telah banyak dilaporkan memiliki keterkaitan dengan beberapa komplikasi makrovaskular diabetes.

• Masih sedikit laporan tentang polimorfisme promoter gen apoA1 (-75 G/A) dan gen apoB (Glu4154Lys) dan pengaruhya terhadap dislipidemia pada retinopati diabetika

• Bagaimana hubungannya dengan retinopati diabetika sebagai komplikasi mikrovaskuler diabetes ? .

Rumusan Masalah

1. Apakah ada hubungan antara polimorfisme promoter gen Apo A1 (-75 G/A) dan gen Apo B (Glu4154Lys) dengan kadar serum Apo A1 dan Apo B pada retinopati diabetika DM tipe-2 ?

2. Apakah ada hubungan antara polimorfisme promoter gen Apo A1 (-75 G/A) dan gen Apo B (Glu4154Lys) terhadap beratnya retinopati diabetika DM tipe-2 ?

Tujuan Umum

Menganalisis hubungan polimorfisme promoter gen apo A1 (-75 G/A), gen apo B Glu4154Lys, dengan kadar serum apo A1 dan apo B serta menilai hubungannya dengan beratnya retinopati diabetik DM tipe-2

Tujuan Khusus Menganalisa hubungan antara polimorfisme

promoter gen apo A1 (-75 G/A) dan gen apo B (Glu4154Lys) dengan kadar apoA1 dan apoB pada retinopati diabetik DM -2

Menganalisa hubungan antara polimorfisme promoter gen apo A1 (-75 G/A) dan gen apo B (Glu4154Lys) dengan NPDR, PDR, DME dan non retinopati diabetik

Manfaat penelitian Manfaat keilmuan / teoritik :

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan kontribusi ilmiah dan konsep jelas tentang hubungan polimorfisme promoter gen apo A1 (-75 G/A) dan gen apo B (Glu4154Lys), dengan perubahan kadar apoA1 dan apoB pada retinopati diabetik DM-2.

  Manfaat aplikasi (klinis) : Diharapkan dengan pemeriksaan genotype promoter gen apo A1 (-75 G/A) dan gen apo B (Glu4154Lys) dapat memberi nilai prognostik terhadap beratnya retinopati diabetika, sehingga menjadi acuan dalam penanganan selanjutnya

Desain Penelitian

Penelitian observasional dengan rancangan cross sectional study

Seleksi subyek penelitian dari poliklinik endokrin metabolik dan poliklinik mata RSWS, RSP Unhas dan Klinik CEC, makassar

Pemeriksaan lab : GDP, profil lipid dan apoA1, apoB di lab RSWS dan unit penelitian Unhas

Analisis genotipe polimorfisme promoter gen apoA1 (-75) dan gen apoB secara PCR-RFLP di Unit penelitian RSP Unhas

kriteria inklusi : Penderita retinopati diabetika Berusia 30 – 70 tahun Mengalami diabetes > 5 tahun Bersedia menandatangani informed concent

 kriteria Ekslusi :Hipertensi berat (tensi >170 / 100 mmHg)Menderita katarakRiwayat menderita penyakit jantung, ginjal, gangguan hati, dan anemia beratSampel tidak memenuhi syarat untuk dianalisis

Penderita DM tipe 2

Retinopati diabetik (grup 1 n=30)

Bukan retinopati diabetik(grup 2 n=30)

Pengambilan darah EDTA

Isolasi DNA dari darah EDTA

Amplifikasi promoter gen apoA1 G/A dengan PCR-RFLP

Elektroforesis gel agarose

Sekuensing produk PCR

Analisis Data

Polimorfisme

ALUR

PENELITIAN

Restriction enzymeMsp1 Allele A :119 dan 285 bp, allele G : 119, 178, and 107 bp.

Restriction enzyme

EcoR1 allele A (digested fragment)253 dan 227 bp allele G (undigested fragment) 480 bp

Pengambilan serum darah

GDP, apoA1, apoB

Amplifikasi exon 29 gen apoB G/A dengan PCR-RFLP

Ekstraksi Genom DNA

Polymerase chain reaction (PCR)

Restirction fragment length

polymorphisms (RFLP)

ApoA : (F) AGGGACAGAGCTGATCCTTGAACTCTTAAG- dan (R) TTAGGGGACACCTACCCGTCAG- GAAGAGCA-

ApoB : (F) 5’-GCTCAc- CCTGAGAGAAGTGTCTFCA-3’; 3’ dan (R) 5’-CATAGTGCAAAGlTCCTC- CCTAGTG-3’

Polimorfisme promoter gen ApoA1 posisi -75 yaitu transisi G/A dideteksi dengan menggunakan enzim Msp. Allele A terpotong menjadi 2 fragment pada 119 dan 285 bp, sedangkan allele G terpotong menjadi 3 fragment pada 119, 178, and 107 bp.

Polimorfisme gen apoB di exon 29 pada posisi 4154 (G/A) dideteksi dengan menggunakan enzim EcoR1 . Allele A ditandai dengan 2 fragment 253 dan 227 bp (digested fragment) dan allele G dengan 1 fragmen : 480 bp (undigested fragment).

STUDI MOLEKULER

Polimorfisme promoter gen ApoA1 (-75 G/A) genotipe : GG, GA, AA

Polimorfisme gen Apo B (Glu4154Lys) genotype : R+R+, R+R-, R-R-

Darah lekosit dari subyek penelitian

Data primer sampel

Hasil Penelitiantabel 1. data Primer Subyek penelitian

No NPDR (n) PDR (n) Non RD (n)

1 jumlah sampel 8 12 4

2 usia (th) 64 55 62

3 ApoA1 (gr/L) 149.5 152.1 164.5

4 ApoB (gr/L) 117.9 108 1515 Genotipe Promoter Gen ApoA1

GG(wild type)

GA (heterozigote)

AA (homozigote) 6 Allele

G

A 7 Genotipe Gen ApoB

R+R+ (wild type)

R+R- (heterozygot)

R-R- (homozygote_ 8 Allele

R+

R-

Hasil Penelitian:tabel 2. Hubungan antara genotipe Promoter gen ApoA1 dengan kadar ApoA1 pada RD dan Non-RD

Genotipe promoter gen ApoA1Rerata kadar ApoA1 pada RD dan Non-RD

Value

NPDR PDR Non RD

1 GG(wild type)

2 GA (heterozigote)

3 AA (homozigote)

Allele

4 G

5 A

ket : RD : Retinopati Diabetik ; Non RD : Non Retinopati Diabetik , diolah dengan statistik Chi square

Hasil Penelitian:tabel 3. Hubungan antara genotipe gen ApoB dengan kadar ApoBpada RD dan Non-RD

Genotipe gen ApoBRerata kadar ApoB pada RD dan Non-RD

Value

NPDR PDR Non RD

1 R+R+(wild type)

2 R+R- (heterozigote)

3 R-R- (homozigote)

Allele

4 R+

5 R-

ket : RD : Retinopati Diabetik ; Non RD : Non Retinopati Diabetik , diolah dengan statistik Chi square

Hasil Penelitian:tabel 4. Hubungan antara genotype promoter gen ApoA1 dan gen ApoB dengan klasifikasi Retinopati Diabetik

no NPDR PDR Non RD Value

1 Genotipe Promoter Gen ApoA1

GG(wild type)

GA (heterozigote)

AA (homozigote)

2 Genotipe Gen ApoB

R+R+ (wild type)

R+R- (heterozygot)

R-R- (homozygote_

ket : RD : Retinopati Diabetik ; Non RD : Non Retinopati Diabetik , diolah dengan statistik Chi square

Kendala-kendala

Pengumpulan sampel : Pasien yang datang ke poli mata RSP unhas

dan RSWS sebagian besar yang telah menderita NPDR dan atau PDR

Pasien dengan Susp. Retinopati diabetik sebagian besar telah berumur >50 tahun, sehingga untuk pemeriksaan fundus terkendala dengan adanya penyakit mata yang menghalangi pemeriksaan fuduskopi untuk menegakkan diagnosa retinopati diabetik, misalnya : katarak senil dan keratitis.

Kendala-kendala Reagen ApoA1 dan ApoB yang baru datang di

bulan oktober dan masih menunggu primer dan enzym untuk PCR yang telah kami pesan melalui rekanan.

Kesimpulan Penelitian telah berjalan 40% Untuk kelompok Diabetik Retinopati (NPDR dan PDR) telah

memenuhi jumlah sampel, sedangkan untuk kelompok non RD masih membutuhkan tambahan sampel dan kami lakukan dengan memperluas cakupan pengambilan sampel di RSWS,RSP Unhas, BKMM dan Celebes Eye Center (ORBITA)

Rerata hasil ApoA1 pada kelompok DR dan Non-DR masih dalam batas normal. Hasil ini tidak sesuai dengan penelitian sebelumnya yang menunjukkan ada hubungan signifikan antara ApoA1 dengan beratnya Retinopati Diabetik

Rerata hasil ApoB pada pasien DR masih dalam batas normal, sedangkan pada Non-DR menunjukkan adanya peningkatan. Masih perlu dianalisa kembali apakah ada hubungannya dengan kecilnya jumlah sampel, kemungkinan terjadinya polimorfisme serta adanya CVD yang belum menunjukkan adanya kelainan pada mata.

TERIMA KASIH

Definisi Operasional dan Kriteria Obyektif Penderita Retinopati Diabetik adalah penderita diabetes yang mengalami komplikasi retinopati

berdasarkan pemeriksaan dan diagnosis oleh klinisi (dokter spesialis mata), dengan menggunakan funduskopi. Diklasifikasikan atas non proliferative diabetic retinopati (NPDR), proliferative diabetic retinopati (PDR) dan diabetic macular edema (DME)

Kriteria obyektif = diagnosis NPDR bila : terdapat tanda-tanda : mikroaneurisme, dot-blot, dan hard exudate, PDR bila terdapat tanda-tanda : neovaskularisasi, iskemia retina, dan perdarahan vitreus; dan DME bila didapatkan edema macula dan hard exudates.

Tes kadar Apolipoprotein A1 (apo A1) Adalah pemeriksaan kadar serum apolipoprotein B dengan metode

immunoturbidimetric assay, pada alat kimia klinik automatic Nilai rujukan normal : Laki-laki : 104 – 202 mg/dl Perempuan : 108 – 225 mg/dl Kriteria obyektif = meningkat jika lebih dari rujukan normal, menurun jika kurang dari rujukan normal.

Tes kadar Apolipoprotein B (apo B)   Adalah pemeriksaan kadar serum apolipoprotein B dengan metode

immunoturbidimetric assay, pada alat kimia klinik automatic Nilai rujukan normal : Laki-laki : 66 – 133 mg/dl Perempuan : 60 – 117 mg/dl Kriteria obyektif = meningkat jika lebih dari rujukan normal, menurun jika kurang dari rujukan normal.

Ratio apo B / apo A1 adalah : perbandingan nilai kadar

apo B terhadap apo A1. Kriteria obyektif = nilai > 1

berarti risiko tinggi untuk mengalami aterosklerosis

Polimorfisme promoter gen apo A1 (-75 G/A)   Adalah identifikasi genotype promoter gen apo A1 pada posisi -75, dengan

metode / tekhnik PCR-RFLP (reaction retstriction fragmen length polimorfism), menggunakan enzim pemotong Mspi

Kriteria obyektif = wild type : genotype GG heterozygote polimorfisme : genotype GA homozygote polimorfisme : genotype AA

Polimorfisme gen apo B exon 29 Glu4154Lys   Adalah identifikasi genotype gen apo B pada exon 29 posisi nukleotida 4154,

dengan metode / tekhnik PCR-RFLP, menggunakan enzim pemotong EcoRi Kriteria obyektif = wild type : R-R- heterozygote polimorfisme : genotype R+R- homozygote polimorfisme : genotype R+R+