analitik 1
TRANSCRIPT
Beberapa hal umum yg tdk diperkenankan dalam pengerjaan
mikrobiologi•Makan, Minum, Mengunyah permen
karet dan merokok•Mengaplikasikan kosmetik (lipstik,
bedak dll)•Membiarkan anggota tubuh dengan
luka terbuka•Membiarkan tabung biakan terbuka
Mikrobiologi Mikrobiologi AnalitikAnalitik ???? ????Mikro-biologi :
ilmu tentang mikroba Mikro-biologi : ilmu tentang mikroba
Analitik (Analisa):Menghitung, mendeteksi,
memeriksa
Analitik (Analisa):Menghitung, mendeteksi,
memeriksa Pemeriksaan bahan secara Mikrobiologi: Deteksi, penghitungan dan pengujian mikroba pada suatu bahan tertentu
Sasarannya??
•Mikroba sebagai mikroba bahan uji (Mikroba uji): untuk pengujian berdasarkan respon mikroba terhadap sampel
•Mikroba sebagai kontaminan dalam produk farmasi, pangan dan kosmetik
Tujuan melakukan analisa mikrobiologi
• Menentukan jenis dan sumber kontaminan
• Evaluasi proses sanitasi, penanganan bahan dasar dan proses pengolahan
• Menentukan kualitas mikrobiologis makanan
• Menentukan umur simpan makanan
Sistem Pengawasan Makanan Sistem Pengawasan Makanan Oleh BPOM-RI Oleh BPOM-RI
• Pemberian Nomer Registrasi BPOM-RI - Makanan/Minuman : MD (dalam), ML (import) 12 digits- Obat-obatan : D (dalam), DL (obat import) - Kosmetika : CD (dalam), CL (kosmetik import) - Alat kesehatan : KD (dalam), KL (alat import)- Obat tradisional : TR
• Melakukan uji laboratorium sampel makanan - Uji kandungan (komposisi) gizi - Uji fisika kimia
- Uji mikrobiologi - Uji bahan berbahaya dan beracun
Sources of bacterial contamination
Staff, customersStaff, customersPP PEOPLEPEOPLE
Vegetables, meat, Vegetables, meat, shellfish, watershellfish, water
RR RAW FOODRAW FOOD
Soil, dustSoil, dustEE ENVIRONMENTENVIRONMENT
Insects, rodents, Insects, rodents, animals, birdsanimals, birds
PP PESTSPESTS
Beberapa teknik dasar di dalam analisa:
1. Teknik transfer aseptis2. Agar Slants (Agar miring)3. Teknik Dilusi (pengenceran)5. Teknik Pour-Plate (lempeng tuang)6. Teknik Spread Plate (lempeng sebar)7. Teknik Streak Plate (lempeng gores)
TEKNIK TRANSFER ASEPTISSuatu metode teknik di dalam memindahkan/mentransfer kultur bakteri/fungi dari satu tempat ke tempat lain secara aseptis agar tidak terjadi kontaminasi oleh mikroba lain ke dalam kultur. Teknik transfer aseptis ini sangat esensial dan kunci keberhasilan prosedur mikrobial yang harus diketahui oleh siapapun yang hendak melakukan analisis mikrobiologi.
Sebelum Pelaksanaan:
1. Singkirkan semua barang yg tidak diperlukan dari meja dan ruang kerja
2. Kenakan pakaian atau jas laboratorium yg bersih dan higinis sebelum masuk ke dalam laboratorium
3. Dianjurkan untuk mengenakan masker yg bersih dan higinis
4. Kenakan penutup rambut yang bersih dan higinis
Sebelum dan Setelah Pelaksanaan:
1. Cuci tangan anda dengan bersih dan gunakan antiseptis
2. Sanitasi dan desinfeksi ruang kerja (laboratorium dan sekitarnya) dengan desinfektan yang memadai, termasuk Laminar Air Flow dan Inkubator
3. Sterilisasi semua alat dan bahan sebelum digunakan
Ketika Pelaksanaan Kultur:
1. Jangan berbicara2. Bekerjalah di dekat api (pembakar bunsen) dan di
dalam Laminar Air Flow (LAF)3. Bukalah tabung /cawan di atas api dan jauhkan dari
hidung dan mulut4. Usahakan jangan meletakkan tutup (kapas
penutup) tabung reaksi di atas meja/LAF5. Miringkan tutup cawan petri yg akan dibuka
sebagai penghalang antara kultur dengan mulut/hidung
6. Jangan buka tutup cawan petri tlalu lebar dan lama7. Bekerjalah dengan cepat
Setelah Pelaksanaan :1. Segera tutup semua tabung /cawan yang
masih terbuka2. Singkirkan segera semua peralatan atau
bahan sisa yg sudah tidak digunakan lagi3. Bersihkan dan keringkan segera
tumpahan-tumpahan media yang ada4. Sanitasi dan desinfeksi ulang meja dan
ruang kerja5. Lepas pakaian kerja dan jas laboratorium
sebelum meninggalkan ruang kerja
1) Inoculating (inokulasi) dengan jarum ose
2) Pipetting (mentransfer dengan pipet)
3) Alcohol Flamming (mentransfer dengan forsep yang dibakar dengan alkohol)
Dalam teknik transfer aseptis ada beberapa teknik yang perlu dipahami, yaitu:
Inoculating dengan jarum ose
1. Bakar jarum ose dari bagian pangkal dalam terus hingga ke bagian lup (ujung) sampai berpijar merah.
2. Biarkan selama beberapa detik sampai pijar menghilang, kemudian segera ambil tabung reaksi yang berisi kultur bakteri, buka penutupnya dengan ketiga jari tengah, manis dan kelingking sedangkan jari telunjuk dan ibu jari memegang jarum ose.
3. Bakar bibir tabung reaksi dengan cara memutar tabung sehingga semua bagian bibir tabung terkena api.
4. Segera masukkan jarum ose ke dalam tabung reaksi, lalu segera keluarkan. Usahakan ketika memasukkan jarum ose jangan sampai menyentuh dinding tabung dan lakukan di dekat pembakar bunsen.
5. Bakar kembali bibir tabung reaksi dan segera tutup. Ingat, jarum ose jangan dibakar kembali karena akan membunuh bakteri yang akan diinokulasikan.
6. Ambil tabung reaksi lainnya yang akan diinokulasi, buka tutupnya dengan cara yang sama dengan cara (2) dan bakar bibirnya dengan cara yang sama dengan cara (3)
7. Segera masukkan jarum ose dan inokulasikan ke dalam tabung tadi sebagaimana cara (4).
8. Bakar bibir tabung reaksi dn tutup kembali
9. Bakar kembali jarum ose hingga berpijar
Isolasi dengan cara goresan
Hasil goresan yang baik
Goresan yang berasal dari dua jenis bakteri
Koloni kurang terpisah
Cawan - terkontaminasi
Cara goresan yang salah
Pipetting (mentransfer dengan pipet)
1. Ambil pipet yang telah steril, buka pembungkusnya dan pasang katup karetnya.
2. Bakar ujungnya dibakar atas bunsen selama beberapa detik. Jangan terlalu lama karena dapat merusak ujung pipet.
3. Ambil tabung reaksi yang berisi kultur bakteri, buka penutupnya dengan kedua jari manis dan kelingking sedangkan jari telunjuk, jari tengah dan ibu jari memegang pipet.
4. Segera masukkan pipet ke dalam tabung reaksi, tekan katup karet penghisap tombol [S] lalu segera keluarkan. Usahakan ketika memasukkan pipe t jangan sampai menyentuh dinding tabung dan lakukan di dekat pembakar bunsen.
5. Bakar kembali bibir tabung reaksi dan segera tutup.
6. Ambil tabung reaksi lainnya yang akan diinokulasi, buka tutupnya dengan cara yang sama dengan cara (b) dan bakar bibirnya dengan cara yang sama dengan cara©.
7. Segera masukkan pipet ke dalam tabung tadi, kemudian keluarkan cairan yang telah diinokulasi dari pipet dengan menekan tombol [E].
8. Bakar bibir tabung reaksi dan tutup sebagaimana cara©.
9. Pindahkan pipet dan ganti dengan pipet baru apabila akan melakukan pipetting kembali.
10.Lakukan kembali dengan cara yang sama apabila diperlukan dilusi atau pengenceran.
Alcohol Flamming : Biasanya digunakan untuk meletakkan kertas cakram atau instrumen lain ke dalam cawan petri yang berisi media.
1. Ambil forsep, celupkan ujungnya ke dalam alkohol, lalu segera bakar ujungnya di atas bunsen selama beberapa detik secara mendatar. Ingat, jangan miring
2. Ambil kertas cakram steril atau instrumen lainnya dengan forsep tadi.
1. Ambil tabung reaksi yang berisi zat antimikrobial, celupkan kertas cakram tadi ke dalam cairan di dalam tabung reaksi.
2. Ambil cawan petri yang telah berisi biakan bakteri di dalam agar, buka penutupnya dengan cara memiringkan beberapa derajat hingga hanya pada satu sisi bagian saja yang terbuka. Ingat jangan terlalu lebar membukanya atau me mbuka seluruh tutupnya dari cawan.
3. Segera masukkan kertas cakram steril atau instrumen lainnya dengan forsep secara hati-hati agar tidak merusak permukaan agar. Lakukan di dekat pembakar bunsen.
4. Segera tutup dan bakar kembali bibir cawan.
5. Lakukan kembali dengan cara yang sama apabila diperlukan.
Menggunakan metode pour plate atau spread plate. Inkubasi 48 jam pada 37° C koloni tumbuh dihitung Jumlah yang sebagai jumlah bakteri. Suhu inkubasi Tergantung pada suhu inkubasi yang diinginkan
Plate Count Method
Standard Plate Count (SPC)
Standard di dalam equipment, material dan inkubasi
Equipment – tempat kerja, kabinet, refrigerator, termometer, transfer pipet, botol untuk pengenceran, cawan Petri, timbangan, waterbath, autoclave, inkubator, dll
Penyimpanan sampel suhu 4,4 C, waktu pengujian < 36 jam
Media – Standard method agar (Plate count Agar)Pancreatic digest of casein (tripton) 5,0 gYeast extract 2,5 gGlucose 1,0 gAgar 15,0 gDW s/d 1 literpH (setelah sterilisasi) 7.0 + 0,2
Inkubasi 32 + 1C, 48 + 3 jam untuk mesofilik
Untuk termofilik : 55 + 1 C selama 48 jam
Untuk psikrofilik : 7 + 1 C selama 10 hari
Presence Absence TestingDilakukan untuk memperoleh informasi kualitatif tentang ada tidaknya organisme target atau group organisme. 100 ml sample ditambahkam media mikrobiologi. Dalam metode ini sampel tidak diencerkan karena akan menurunkan selektivitasnya.
Most Probable Number
• MPN merupakan modifikasi dari metode Presence Absence. Jika pd presence absence hanya digunakan 1 sampel, maka pada MPN digunakan pd bbagai tabung dgn jumlah sampel yang diencerkan. Hasil positive dan negatif dari tabung dapat digunakan u/ mperkirakan jum. mikroba
• Untuk menghitungnya dibandingkan dengan tabel MPN
Membrane Filtration
Metoda filtration lebih sederhana dan memberikan hasil kuantitatif yang jauh lebih cepat. Teknik ini biasanya digunakan untuk menguji air minum tetapi mempunyai pada air yang keterbatasan terkontaminasi berat atau mempunyai banyak bakteri non coliform.
SAMPEL
Sampel tidak boleh lebih dari 24 jam. Jika analisa tidak dilakukan dengan segera, maka sampel harus didinginkan dalam
lemari pendingin.
Prosedur Sampling• Gunakan wadah yang steril• Jaga tangan selalu bersih dan kering • Jangan membalik atau menjatuhkan tutup botol• Jangan mengkontaminasi bagian atas ataupun bagian
dalam plastik sampel.• Cuci peralatan sampling sebelum digunakan• Isi didalam wadah tidak lebih dari 2/3 atau 3/4 –nya• Jangan memegang wadah (belum tertutup) melewati
permukaan sampel ketika sampel tersebut dipindahkan
• Dinginkan sampel pada suhu 0-4,4oC• Pindahkan sampel dalam wadah untuk pengiriman ke
laboratorium• Setelah digunakan, kembalikan wadah sampel ke
laboratorium untuk disterilkan kembali
Metode Penghitungan1. Cawan yang dipilih & dihitung ad/yg
mengandung jum. koloni antara 30–300.2. Beberapa koloni yang bergabung menjadi
stu merupakan satu kumpulan koloni yang besar dimana jumlah koloninya diragukan sehingga dapat dihitung sebagai satu koloni.
3. Suatu deretan (rantai) koloni yang terlihat sebagai suatu garis tebal dihitung sebagai satu koloni.
Faktor pengenceran = Pengenceran x Jum. sampel = 10-4 x 1 = 10-4
Jumlah koloni = Jumlah koloni x 1/Fp = (60 + 64)/2 x 1/10-4
= 6,2 x 105
Diperoleh 60 dan 64 koloni masing-masing pada cawan duplo yang mengandung sampel dengan pengenceran 10-4
Kaidah2 Penghitungan1. Hasil yang dilaporkan hanya terdiri dari dua angka
yaituangka pertama di depan koma dan angka kedua dibelakanga koma. Jika angka yang ketiga sama dengan atau lebih besar dari 5, harus dibulatkan satu angka lebih tinggi pada angka yang kedua.
Jumlah koloni per pengenceran
Standart PlateCount
Keterangan
10-1 10-2 10-3
234700
TBUD
28125
TBUD
110
197
2,3 x 103
1,3 x 104
2,0 x 105
28 dan 1 < 30700 > 300;10 <
30TBUD > 300
2. Jika semua pengenceran yang dibuat untuk pembiakan menghasilkan angka kurang dari 30 koloni pada petri, hanya jumlah koloni pada pengenceran yang terendah yang dihitung. Hasilnya dilaporkan sebagai kurang dari 30 dikalikan dengan besarnya pengenceran, tetapi jumlah yang sebenarnya harus dicantumkan dalam tanda kurung.
Jumlah koloni per pengenceran
Standart PlateCount
Keterangan
10-1 10-2 10-3
16 1 0 < 30 x 102
(1,6 x 102)Hitung pengenceran 10-1
3. Jika semua pengenceran yg di dibuat u/ pembiakan mhasilkan angka lebih dari 300 koloni pada petri, hanya jumlah koloni pada pengenceran yg tertinggi yg dihitung, misalnya dengan cara menghitung jumlahnya pada ¼ bagian cawan petri, kemudian dikalikan 4. hasilnya dilaporkan sbg lebih dari 300 dikalikan d besarnya pengenceran, tetapi jumlah yang sebenarnya harus dicantumkan dalam tanda kurung.
Jumlah koloni per pengenceran
Standart PlateCount
Keterangan
10-1 10-2 10-3
TBUD
TBUD
TBUD
325
355
20
> 3,0 x 105
(3,6 x 105)> 3,0 x 104
(3,3 x 104)
Hitung pengenceran 10-3
Hitung pengenceran 10-3
4. Jika cawan dari dua tingkat pengenceran mhasilkan koloni dgn jumlah antara 30 dan 300, & pbandingan antara hasil tertinggi dan terendah dari kedua pengencerantersebut lebih kecil a/ sama dengan 2, maka tentukan rerata dari kedua nilai tersebut dgn mperhitungkan pengencerannya. Jika perbandingan antara hasil tertinggi dan terendah lebih besar dari 2, yg dilaporkan hanya hasil yg terkecil.
Jumlah koloni per pengenceran
Standart Plate count
Keterangan
10-1 10-2 10-3
293
140
41
32
4
2
1,7 x 103
1,4 x 103
Hitung rata-ratanya karenaa 41000/29300 = 1,4 (< 2)Hitung pengenceran 10-1 karena 32000/14000 = 2,3 (>2)
5. Jika digunakan dua cawan petri (duplo) per pengenceran, data yg diambil harus dari kedua cawan tersebut, tdk boleh hanya diambil dari salah satunya, meskipun salah satu dari cawan duplo tsb tdk memenuhi syarat antara 30-300.
Jumlah koloni per pengenceran
StandartPlate Count
Keterangan
10-1 10-2 10-3
175208
1617
10
1,9 x 103 Rerata dari pengenceran 10-1
Jumlah koloni per pengenceran
StandartPlateCount
Keterangan
10-1 10-2 10-3
138162
4243
24 1,5 x 103
Rerata dari pengenceran 10-1, karena perbandingan antara pengenceran10-2 dan 10-3adalah 2,4
290280
3632
41 3,1 x 103
Rerata dari pengenceran 10-1 dan 10-2 karena perbandingan antara kedua pengenceran adalah 1,2.
291305
2527
30 3,0 x 103
Rerata dari pengenceran 10-1, meskipun 305 > 300 (angka yang lain < 30).