pembiakan bakteri dari spesimen klinik dan uji kepekaan

CHERRY SIREGAR, dr, MKes

PEMBIAKAN BAKTERI DARI SPESIMEN KLINIK

TERIMA

baik ( prima) Jenis bahan sesuai dgn lembar

permintaan Jenis permintaan

mikrobiologik ( aerob,anaerob ,microaerofilik)

2. Pengolahan bahan

Dilakukan pengolahan sebelum ditanam

ke media perbenihan.

Tujuan : hasil baik dan tepat

Metoda :

- Sentrifugasi : jk jumlah kuman sedikit

- Pengenceran : jk jumlah kuman banyak

- Pemanasan : kuman berspora

kec.C.perfringens

- zat kimia : meniadakan kuman yang

tidak diinginkan ( kuman TBC)

- Penghancuran :

bahan padat tinja, jar tubuh,

Isolasi & identifikasi kuman

Alur kerja:

Kuman Aerob

Anaerob SAMA

Microaerofilik

Perbedaan :

lingkungan pertumbuhan

jenis perbenihan

Lingkungan pertumbuhan

Mikroaerofilik

Candle jar

Anaerob

Anaerobic jar

Kuman aerob tumbuh di alam

bebas

Kuman anarob bebas O2

Mikroaerofilik O2 rendah dan CO2

tinggi

Suhu : 37 0 C

Waktu pengeraman : anaerob lebih

lama

Langkah-langkah isolasi kuman ( aerob/anaerob)

1.Bahan pemeriksaan

a.Pengamatan mikroskopis :

sediaan hapusan yang diwarnai dgn

pewarnaan Gram

tujuan

morfologi dan sifat gram kuman (kasus

infeksi) c/ C.tetani, N.gonorrhoeae,

S.pneumonia, H.influenzae)

Infeksi : polimicrobial atau

monomicrobial

Pemilihan perbenihan

Cara isolasi

b. Penanaman kuman pada media

perbenihanSpesimen

ose

Media perbenihan

SolidBroth

Selektif yang solid

1-2% agar

Culture Media

Blood agar MacConkey agar Chocolate agar Incubate 35-37°C up to 48 ;CO2 microaerofilik

Lowenstein Jensen medium

U isolasi kuman BTA ( mycobacterium) 8 minggu

Media isolasi untuk spesimen feses

Selective-Differentiating Plating Media MacConkey agar (MAC) Salmonella Shigella agar (SSA) Thiosulfate citrate bile salts sucrose agar

(TCBS)

MEDIA UNTUK ISOLASI KUMAN ANAEROB

Media padat : Nonselektif :

Agar Brucella diperkaya dengan :Darah domba defibrinated 55, Vitamin K, Hemin

Selektif :

Agar Brucella + antibiotik (kanamisin, vankomisin)

Media cair antara lain : Kaldu thioglycolate Kaldu Cook Meat Medium (CMM)

Kaldu Brain Heart Infusion (BHI)

Media semi solid : Media Cary Blair Media Stuart

Digunakan sebagai media transportasi spesimen (bahan pemeriksaan) anaerob.

Penyemaian bakteri pada permukaan medium padat dengan cara goresan (menstreak) secara berulang-ulang

Isolated colony

SOLID

Bakteri dari sediaan ose atau kapas lidi steril medium cair ,digoyang-goyangkan

BROTH

1: Obligate aerobic (oxygen-needing) bacteria gather at the top of the test tube in order to absorb maximal amount of oxygen.2: Obligate anaerobic bacteria gather at the bottom to avoid oxygen.3: Facultative bacteria gather mostly at the top, since aerobic respiration is the most beneficial one; but as lack of oxygen does not hurt them, they can be found all along the test tube.4: Microaerophiles gather at the upper part of the test tube but not at the top. They require oxygen but at a low concentration.5: Aerotolerant bacteria are not affected at all by oxygen, and they are evenly spread along the test tube.

2. Pengeraman

Spesimen yang telah ditanam dieramkan pada inkubator

suasana lingkungan, suhu pengeraman, lama pengeraman disesuaikan kebutuhan kuman ( aerob/anaerob/milroaerofilik)

3. Pengamatan Lakukan pengamatan koloni

Klebsiella

Mc Conkey

E coliMc

ConkeyPPp

E coliMc

Conkey

E coliEMB

PseudomonasMac Conkey

E coliMc

Conkey

pewarnaan Gram

gram positif coccus gram positif bacilli Staphylococcus Spp E.coli

Identifikasi kuman

identifikasi

CEPATEntero-tube

API-20RAPIDIANA

KONVENSIONALReaksi karbohidrat

Reaksi biokimia

Uji kepekaan antimikroba

Identifikasi kuman

CONVENTIONAL METHODE

Beda Staphylococcus dengan streptococcus

1.Gram Stain gram positif :

Staphylococcus : penataan : btk coccus,

anggur

Streptococcus : bentuk coccus rantai

2. Uji katalase

Staphylococcus : (+)

Streptococcus: (-)

3. Pertumbuhan

Staphylococcus :koloni besar, bbrapa hemolitic

Streptococcus: koloni kecil, byk hemolitic α,β

N

o

Organisme Ferme

ntasiM

annitol

Koagula

se

DNAse Novobio

cin

Hemoli

sa

1

2

3

.

Staphylococcus aureus

Staphylococcus

epidermidis

Staphylococcus

saprophyticus

+

-

-

+

-

-

+

-

-

S

S

R

Beta

Beta / O

O

Staphylococcus

Streptococcus sp

Berdasarkan tipe hemolisa”:agar darah

Streptococcus alpha hemolyticus

hemolisa yang tidak sempurna, warna kehijau-

hijauan di sekeliling koloni (green hemolysis)

Streptococcus beta hemolyticus.

Hemolisis sempurnazona bersih di sekeliling

koloni (clear zone)

Streptococcus anhemolyticus (gamma hemolyticus)

-->tidak menunjukkan hemolisa

IDENTIFIKASI Streptococcus sp

Morfologi koloni, hemolisa pada Agar

Darah.

Morfologi bakteri secara mikroskopis

dari sediaan usap yang diwarnai

dengan Gram.

Uji kepekaan terhadap basitrasin

(bacitracin susceptibility test).

Streptococcus

Streptococci On blood agar Growth inhibition disc

S. pyogenes (group A) -hemolytic Sensitive to bacitracin

S. agalactiae (group B) -hemolytic Resistant to bacitracin

S. pneumoniae (pneumococcus) -hemolytic Sensitive to optochin

Viridans -hemolytic Resistant to optochin

Resistensi antibiotik

PENTING !!! morbiditas dan mortalitas Perawatan di rumah sakitPeningkatan penggunanan : uji lab

dan Dx, prosedur u m’kontrol infeksi, AB mahal, memperpanjang lama rawatan di RS

04/12/23 34

1. Metode Uji Kepekaan Antibakteri secara langsung

a. Uji kepekaan antibakteri konvensional

→metode dilusi tabung, dilusi agar, difusi cakram

b. Uji kepekaan antibakteri komersial

→metode mikrodilusi, Tes E, spiral gradient endpoint system

c. Uji kepekaan antibakteri secara otomatisasi

→Sistem vitek, sistem walkaway

Tes kepekaan (susceptibility test) atau uji kepekaan atau tes resistensi

bakteri peka (susceptible) kurang peka (intermidiate)

antimikrobatidak peka (resistant)

Tes Kepekaan : 1. Cara Difusi (Difusion Methods) 2. Cara Pengenceran (Dilution

Methods)

Cara difusi - memakai cakram antibiotik lebih mudah

pengerjaannya• Cara dilusi KHM ( kadar hambat minimal )

kadar atau pengenceran tertinggi dimana pada kadar tersebut antimikroba masih dapat menghambat pertumbuhan bakteri.

KBM/Konsentrasi Bunuh Minimum (MBC) adalah kadar atau pengenceran tertinggi dimana pada kadar tersebut antimikroba dapat mematikan bakteri

1. Tes Kepekaan Cara Difusi : (Kwalitatip)

Metode Kirby-Bauer, paling banyak dipakai di laboratorium

Mueller Hinton ; ketebalan 4 mm ; pH 7,2 – 7,4; Media harus dapat ditumbuhi oleh bakteri yang akan di uji.

CARA PENGERJAAN”1 Beberapa koloni bakteri medium cair (eramkan 2-5

jam pada 36o-37oC  ) 0’5 Mac Farland2 . Cara penyemaian bakteri : Kapas lidi steril dicelupkan

kedalam medium cair yang berisi bakteri (ad.2) lalu disemaikan kepermukaan Lempeng Agar (ad.1) sehingga tersebar merata. Biarkan 3-5 menit (jangan lebih dari 15 menit)

4.Cakram antimikroba diletakkan pada permukaan lempeng agar dengan bantuan pinset steril. Eramkan pada suhu 37 C selama 18-24 jam.

5. HASIL: Mengukur daerah hambatan : zona hambatan di sekitar cakram antimikroba diukur diameternya dengan jangka sorong (kaliper) atau penggaris, lalu disesuaikan dengan tabel. Pengukuran daerah hambatan dalam mm

04/12/23 42

2 Metode Dilusi pada Lempeng Agar

Prinsip : penghambatan pertumbuhan bakteri pada permukaan agar terhadap antibiotik yang dicampurkan ke dalam lempeng agar 2ml Antibiotika + 18ml Medium Mueller Hinton → tuangkan pada lempeng petri(Satu konsentrasi antibiotika, pada 1 lempeng agar)

↓ Pengenceran Antibiotikamemerlukan 1 seri lempeng agar (biasanya 10 agar)Dianggap kurang praktis

04/12/23 43

1.2 Metode Dilusi pada Lempeng Agar

Dapat menentukan nilai MIC terhadap lebih dari 1 isolat bakteri (sampai 32 jenis bakteri)Dianjurkan untuk pemeriksaan N. gonorrhoeae dan N. meningitidisPembacaan Hasil : didapatkan nilai MIC, pada konsentrasi yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri

04/12/23 44

3. Metode Dilusi Cairan / Broth

Prinsip : Menentukan penghambatan pertumbuhan bakteri secara kuantitatif →penentuan nilai Minimal Inhibitory Concentration (MIC)Medium perbenihan : Mueller-Hintonharus optimum untuk pertumbuhan bakteri, kadang-kadang dibutuhkan suplementasiSuspensi Bakteri ≈ larutan Mc Farland 0,5 →diencerkan hingga diperoleh konsentrasi akhir 5x105CFU/ml

Methode Pengenceran Cara Makro dalam seri 12 tabung (Standard Test)Prinsip : Menggunakan 12 tabung reaksi ( 2 tabung terakhir sebagai kontrol).1.Masukkan media cair 1 cc Mueller Hinton Broth.

2.Buatlah larutan antimikroba yang diinginkan konsentrasinya. (misalnya 2 ug/cc)

3.Masukkan 1 cc larutan tersebut ke dalam tabung pertama 4.Pindahkan 1 cc larutan dari tabung ke-2 ke tabung ke-3 dst-nya sedemikian

sehingga sampai ke tabung ke 11. 5.Jadi tabung 1 s/d dengan tabung ke 11 berisi antimikroba dengan

konsentrasi kelipatan 2.6.Lalu buanglah 1 cc dari tabung ke 117.Tabung 11 ditambahkan beberapa tetes formalin (F) , sebagai kontrol

negatip (K -).8.Tabung 12 sebagai kontrol pertumbuhan (K +)9. ditambahkan 1 cc suspensi bakteri yang akan di uji kepekaannya10.Eramkan rak berisi tabung-tabung tersebut dlm inkubator pada suhu 37oC

selama11.Setelah 24 jam keluarkan rak dan perhatikan pada tabung keberapakah cairan

media menjadi keruh (ada pertumbuhan).

04/12/23 46

Pembacaan HasilPembacaan Hasil

MIC adalah nilai konsentrasi antibiotik terendah (μg/ml) yang tidak menunjukkan adanya pertumbuhan bakteri secara mikroskopis

↓tidak adanya kekeruhan pada tabung, larutan jernih

bandingkan dengan larutan kontrol

04/12/23 49

2. Uji Kepekaan Antibakteri Komersial2. Uji Kepekaan Antibakteri Komersial- Perkembangan metode konvensional- Lebih mudah,cepat, akurat

2.1 Metode Mikrodilusi- Prinsip : mirip metode dilusi cairan (Menentukan nilai MIC)- Volume yang digunakan sedikit (0,05-0,1ml)- Panel polistyrene, 80-100 kompartemen → dapat memeriksa

hingga 12-15 antibiotika

Panel polistyrenePenentuan nilai MIC

04/12/23 50

04/12/23 51

04/12/23 52