76936791 teknologi dna rekombinan
Post on 29-Dec-2014
64 Views
Preview:
TRANSCRIPT
TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN
Khrismawan
PENDAHULUAN
Informasi keturunan diletakkan dalam urutan basa dari molekul-molekul DNA.
Fragmen-fragmen DNA yang informasinya diubah menjadi molekul-molekul yang
fungsional, dikenal sebagai gen. Urutan dari salah satu rantai DNA akan diterjemahkan
melalui suatu proses transkripsi menjadi suatu urutan RNA yang komplementer. Molekul
RNA yang terbentuk, berfungsi sebagai matriks untuk sintesa protein (mRNA) atau
menerima fungsi tersendiri (rRNA, tRNA atau snRNA). Pada eukariot, hanya fragmen-
fragmen gen tertentu yang yang mengandung sandi genetik. Fragmen-fragmen ini disebut
ekson. Diantara fragmen-fragmen ini terdapat fragmen yang tidak mengandung sandi
genetik, yaitu intron. Setelah transkripsi, intron akan dipisahkan dari hnRNA yang
pertama-tama terbentuk. Hal ini terjadi selama proses pematangan RNA yang
memodifikasi kedua ujung RNA. RNA yang matang akan meninggalkan inti sel dan di
dalam sitoplasma terikat dengan ribosom. Ditempat ini urutan RNA akan diterjemahkan
kedalam urutan asam amino (protein) yang sesuai melalui proses translasi. Pada proses
ini berperan tRNA yang mengenali urutan RNA tertentu. Sebelumnya, tRNA diberi
muatan asam amino yang sesuai melalui proses aktivasi asam amino.1, 2
Pada pembelahan sel, informasi genetik akan diteruskan ke sel-sel anak, yaitu
dengan cara membuat salinan dari keseluruhan DNA melalui proses replikasi. Jadi sel-sel
anak mengandung molekul DNA yang identik dengan sel induk.1, 2
KROMATIN
Didalam inti sel eukariotik, DNA berhubungan dengan protein-protein dan
molekul-molekul RNA. Kompleks nukleoprotein ini dikenal sebagai kromatin. Hanya
selama mitosis, kromatin berkondensasi menjadi kromosom yang terlihat dibawah
mikroskop cahaya. Selama interfase, kondensasi kromatin tersebut melonggar secara
menyeluruh. Secara morfologik dapat dibedakan eukromatin yang terbungkus rapat dan
1
heterokromatin yang terbungkus kurang rapat. Heterokromatin adalah tempat proses
transkripsi berlangsung sangat aktif. 1, 3
Protein kromatin terdiri atas protein histon dan bukan histon. Histon merupakan
suatu kelompok protein kecil yang bersifat basa kuat. Urutan asam amino histon pada
semua sel eukariotik adalah sangat serupa. Histon berhubungan langsung dengan DNA.
Protein ini turut membantu organisasi struktural kromatin. Selain itu, asam amino histon
yang bersifat asam dan memungkinkan pengemasan yang rapat dari DNA didalam inti
sel. Jadi 46 molekul DNA genom manusia yang diploid dapat ditempatkan di dalam inti
sel menjadi molekul dengan diameter hanya 10 μm. 1, 3
Setiap dua molekul histon dengan tipe H2A, H2B, H3 dan H4 membentuk suatu
kompleks oktamer yang dibalut oleh 146 pasangan basa DNA dalam kurang lebih 13/4
putaran. Partikel-parikel dengan diameter 7 nm semacam ini dikenal sebagai nukleosom.
DNA yang tidak langsung berhubungan dengan oktamer histon disebut DNA
penghubung. Pada DNA-linker berikatan suatu histon lain yaitu H1. Histon H1
mendukung pembentukan struktur yang berbentuk seperti serabut-serabut dengan
diameter 30 nm, yang dikenal sebagai kumparan. Kumparan sekali lagi membentuk pita
dengan panjang kira-kira 200 nm. Ujung akhir setiap pita semacam ini terikat pada suatu
struktur kerangka protein yang dikenal sebagai kerangka inti.1
Protein bukan histon sangat heterogen.Yang termasuk kelompok ini adalah
protein struktural, begitu juga enzim dan faktor transkripsi. 1
REPLIKASI
A. Cara kerja dari Polimerase DNA
Untuk meneruskan informasi genetika pada perbanyakan sel, sebelum
pembelahan sel harus dibuat satu salinan dari genom. Replikasi DNA dikatalisis
terutama oleh enzim polimerase DNA yang tergantung pada DNA. Enzim ini
memerlukan satu DNA untai tunggal yang disebut sebagai untai cetakan (matrix-
strand) dan mensintesis untuai kedua yang komplementer, sehingga kembali
dihasilkan suatu DNA heliks ganda yang lengkap. Substrat dari polimerase DNA
adalah keempat deoksinukleosida trifosfat yaitu dATP, dGTP, dCTP, dan dTTP.
Setiap basa pada untai cetakan akan berikatan dengan nukleotida yang komplementer
2
melalui pemasangan basa yang spesifik. Kemudian gugus 3’-OH dari nukleotida
terakhir pada untai DNA yang sedang terbentuk bereaksi secara nukleofilik dengan
residu α-fosfat dari nukleotida baru ditambahkan. Reaksi ini menghasilkan suatu
ikatan diester asam fosfat yang baru melalui pelepasan difosfat. Setelah enzim
polimerase DNA bergeser ke basa berikutnya pada untai DNA cetakan, maka
langkah-langkah tersebut akan terulang kembali. Mekanisme yang diterangkan ini
mengungkapkan dengan sendirinya bahwa untai DNA cetakan dibaca dengan arah
3’ 5’.1, 4
Sebagian besar sel mengandung lebih dari satu polimerase DNA. Selain enzim
yang mengkatalisis replikasi sesungguhnya, terdapat polimerase yang berperan pada
proses reparasi atau pada proses replikasi DNA mitokondria pada eukariot.1, 4
B. Replikasi pada E. Coli
Saat ini telah diketahui gambaran yang tepat mengenai proses replikasi pada
prokariot, sementara pada eukariot masih banyak rincian yang belum jelas. Akan
tetapi sudah dapat dipastikan bahwa pada prinsipnya berlangsungnya proses replikasi
pada sebagian besar sel adalah serupa. Disini ditunjukkan suatu skema yang
disederhanakan untuk bakteri Escherichia coli. 1
Pada bakteri, replikasi dimulai pada suatu tempat tertentu dari DNA yang
berbentuk cincin yaitu awal-mula replikasi dan dilanjutkan kedua arah. Hasilnya
terbentuk garpu replikasi yang berjalan berpencaran. Pada garpu replikasi, kedua
untaian direplikasikan secara bersamaan. DNA yang merupakan cetakan diberi warna
biru sedangkan untai yang baru terbentuk berwarna merah atau jingga. 1
Setiap garpu mengandung sedikitnya dua molekul polimerase DNA III dan
serangkaian enzim pembantu. Yang termask enzim pembantu adalah topoisomerase
DNA yang mengendurkan jalinan untaian ganda DNA yang erat, helikase yang
memisahkan untaian ganda DNA menjadi dua untaian tunggal dan protein-protein
yang terikat pada untai tunggal. Karena untai cetakan selalu dibaca dengan arah
3’ 5’ maka hanya satu dari kedua untaian tunggal tersebut yang dapat direplikasi
secara tak terputus (biru tua/merah). Untuk untaian yang kedua (biru muda), arah
pembacaan berlawanan dengan arah pergerakan garpu. Pada untai cetakan tersebut,
3
pertama-tama dibentuk untai yang baru dalam bentuk potongan DNA yang terpisah,
yang kemudian disebut berdasarkan nama dari penemunya yaitu fragmen Okazaki
(hijau/jingga). Setiap fragmen mulai dengan suatu urutan awal yang pendek (primer)
dari RNA (hijau) yang diperlukan agar polimerase DNA dapat berfungsi. Primer
RNA disintesis oleh suatu suatu polimerase RNA yang khusus (primase). Kemudian
primer tersebut akan diperpanjang sekitar 1000 – 2000 komponen deoksinukleotida
oleh enzim polimerase DNA III (jingga). Selanjutnya síntesis fragüen Okazaki
berhenti dan akan dimulai síntesis statu fragüen Okazaki baru pada statu primer RNA
lanilla yang sementara itu telah dibentuk tidak saling berhubungan satu dengan
lainnya dan masih mengandung RNA pada ujung 5’. Setelah garpu replikasi berjalan
dengan jarak tertentu, baru dimulai kerja enzim polimerase DNA I yaitu
menggantikan primer RNA dengan DNA. Akhirnya celah yang tertinggal di antara
dua fragmen Okazaki ditutup oleh suatu enzim ligase DNA. Pada statu heliks ganda
DNA yang terbentuk dengan cara tersebut, hanya satu untaian DNA yang disintesis
baru, artinya replikasi bersifat semikonservatif.1
TRANSKRIPSI
Agar informasi genetik yang disimpan di dalam DNA dapat digunakan, maka
harus disalin ulang dalam bentuk RNA (ditranskripsikan). Dalam hal ini DNA hanya
berfungsi sebagai pola, artinya DNA tidak akan mengalami perubahan melalui proses
transkripsi. Fragmen DNA yang dapat ditranskripsikan ialah yang mengandung sandi
genetik untuk suatu produk tertentu. Fragmen DNA tersebut dinamai gen. Diduga, genom
mamalia mengandung 20.000 hingga 50.000 gen, yang keseluruhannya kurang dari 10%
DNA pada mamalia. Kegunaan fragmen DNA yang bukan gen masih belum jelas.1, 2
A. Transkripsi dan pematangan RNA
Transkripsi dikatalisis oleh enzim polimerase RNA yang tergantung pada
DNA. Enzim ini bekerja serupa dengan polimerase DNA, akan tetapi yang
ditambahkan kedalam untaian yang baru disintesis adalah ribonukleotida bukan
deoksiribonukeotida. Sel eukariotik sekurang-kurangnya mengandung tiga polimerase
RNA. Polimerase RNA I mensintesis suatu RNA dengan koefisien sedimentasi
4
sebesar 45 S, yang berfungsi sebagai prekursor untuk tiga RNA ribosom. Produk
polimerase RNA II adalah hnRNA yang kemudian menjadi mRNA, dan juga
prekursor snRNA. Yang terakhir adalah polimerase RNA III, mentranskripsi gen yang
mengandung sandi genetik untuk tRNA, 5S-rRNA dan snRNA tertentu. Dari
prekursor-prekursor ini kemudian melalui proses pematangan RNA terbentuk
molekul RNA yang dapat berfungsi. Polimerase II dan III dapat dihambat oleh
α-Amanitin, suatu racun jamur. 1
Gambar 1. Mekanisme transkripsiDikutip dari Kopp2
B. Organisasi gen β-Globin
Organisasi gen eukariotik diterangkan dengan contoh gen yang mengandung
sandi genetik untuk rantai β hemoglobin (146 asam amino). Gen tersebut mencakup
hampir 2000 pasangan basa (pb), akan tetapi hanya sekitar 450 pb yang membawa
informasi untuk urutan protein. Tiga daerah yang mengandung sandi genetik atau
ekson (E1-E3, biru tua) dipisahkan satu sama lainnya oleh dua segmen yang tidak
mengandung sandi genetik (intron). Pada ujung 5’ gen terdapat daerah promotor
5
(merah muda) yaitu suatu fragmen sebesar Kira-kira 200 pb dan berfungsi dalam
regulasi transkripsi. Transkripsi mulai pada ujung 3’ daerah promotor dan dilanjutkan
hingga melampaui urutan poliadenilat. Pada gen β-globin transkrip primer yang
terbentuk mempunyai panjang sekitar 1600 basa. Selama proses pematangan RNA,
urutan-urutan intron yang tidak mengandung sandi genetik yang sesuai dilepaskan.
Selain itu, kedua ujung hnRNA dimodifikasi. mRNA dari β-globin masih
mengandung sekitar 40% hnRNA dan sebagai tambahan juga mengandung urutan
pada 3’-terminal yang terdiri atas kira-kira 200 residu AMP.1
C. Jalannya transkripsi
Seperti diketahui bahwa polimerase RNA II berikatan pada ujung 3’ daerah
promotor. Penting untuk pengikatan tersebut adalah suatu daerah promotor yang
dikenal sebagai kotak TATA, yaitu suatu potongan rangkaian basa pendek yang kaya
akan nukleotida A dan T. Kotak TATA bervariasi dari satu gen ke gen lainnya. Suatu
urutan basa yang khas untuk kotak TATA (urutan konsensus) ahíla ...TATAAA…
Untuk interaksi polimerase dengan daerah promotor tersebut mutlak diperlukan lebih
dari satu protein, yang dikenal sebagai faktor transkripsi basal. Factor tambahan
lainnya dapat menstimulasi atau menghambat proses (kontrol transkripsi). Setelah
inisiasi, polimerase RNA bergerak memisahkan satu bagian pendek heliksganda DNA
menjadi untaian tunggal. Nukleosida trifosfat yang komplementer akan berpasangan
dengan basa pada untaian DNA yang kodogenik dan tahap demi tahap diikatkan
pada RNA yang sedang terbentuk. Tak lama setelah proses perpanjangan dimulai,
ujung 5’ dari transkrip dilindungi dengan suatu topi penutup (cap). Setelah mencapai
urutan poliadenilat (urutan basa yang khas : ..AATAAA…), transkrip akan
dilepaskan. Tidak lama kemudian polimerase mengakhiri proses transkripsi dan
berdisosiasi dari DNA.1
PEMATANGAN RNA
A. Kontrol transkripsi
Walaupun setiap sel mengandung genom yang lengkap, Namur sel hanya
menggunakan sebagian kecil dari infromasi genetik yang dikandungnya. Yang selalu
6
ditranskripsikan adalah gen-gen yang mengandung sandi genetik untuk molekul
struktural atau untuk enzim pada metabolismo intermedier. Selain gen-gen yang
dipakai zaherí-hari tersebut, terdapat sejumlah besar gen lainnya yang hanya menjadi
aktif pada beberapa tipe sel tertentu, pada situasi metabolisme tertentu atau selama
diferensiasi. Gen-gen mana yang ditranskripsikan dan mana yang tidak, diatur oleh
suatu sistem regulasi yang unsur-unsurnya baru dikenal secara garis besar saja.1
Pada kontrol transkripsi bekerja sama dua jenis struktur. Daerah promotor
dari sebagian besar gen mengandung beberapa fragmen DNA yang pendek (elemen
kontrol). Pada fragmen tersebut berikatan faktor transkripsi dan dengan demikian
dapat mengatur transkripsi. 1
Karena elemen kontrol semacam ini hanya mempunyai pengaruh pada gen-
gen yang berada bersama-sama dengan elemen kontrol dalam satu DNA, maka
elemen tersebut dinamakan juga elemen cis-aktif. Faktor transkripsi adalah protein,
dengan demikian merupakan produk dari gen yang berlainan dan independen. Karena
itu dikenal juga sebagai faktor trans-aktif. 1
Transkripsi suatu gen hanya dapat berlangsung, bila selain enzim polimerase
RNA tersedia juga protein-protein lainnya yaitu faktor transkripsi basal. Faktor
transkripsi basal yang terpenting diberi tanda dengan huruf A-H. Pada eukariot, yang
pertama-tama terikat adalah faktor TF-IID pada kotak TATA. Faktor-faktor basal lain
dan juga polimerase RNA kemudian menempatkan dirinya pada kompleks tersebut.
Faktor transkripsi lain yang tidak bersifat basal dapat mempengaruhi inisiasi
transkripsi dengan cara mengikatkan diri dengan elemen kontrol yang terletak
berdampingan dengan kompleks dan melalui interaksi dengan kompleks yang basal
dapat mengaktifkan atau menghambat inisiasi kompleks transkripsi. Faktor yang
mengaktifkan misalnya adalah kompleks hormon steroid dengan reseptornya. 1
B. Proses putus Sambung
Setelah transkripsi, urutan-urutan hnRNA yang tidak mengandung sandi
genetik (intron) dilepaskan. Proses ini dinamakan proses putus sambung RNA dan
dikatalisis oleh kompleks RNA-protein yang dikenal sebagai small nuclear
ribonucleoprotein particles (snRNA). Intron pada hnRNA mempunyai urutan-urutan
7
yang khas pada kedua ujungnya. Pada proses putus-sambung, pertama-tama, dengan
bantuan suatu snRNP, gugus OH residu adenosin di dalam ekson menyerbu ikatan
diester asam fosfat pada ujung 5’ daerah intron dan memutuskan ikatan tersebut.
Bersamaan dengan itu terbentuk suatu ikatan baru didalam intron, sehingga intron
menyerupai suatu bentuk lasso. Pada langkah kedua, gugus OH terminal ekson yang
berada pada posisi 5’ menyerbu ikatan pada ujung 3’ intron. Dengan demikian kedua
ekson tersebut diikatkan dan intron dilepaskan.1
Lima jenis snRNP yang berbeda (U1, U2, U4, U5, dan U6) berperan pada
reaksi putus-sambung. Setiap jenis terdiri atas beberapa protein dan satu molekul
snRNA. Selama proses putus-sambung, kompleks yang terdiri atas hnRNA dan
snRNPs membentuk suatu spliceosom. Dianggap bahwa snRNAs didalam spliceosom
berpasangan basa satu dengan yang lainnya dan juga dengan hnRNA, sehingga
memfiksasi dan memberikan orientasi pada gugus yang bereaksi. Proses katalisis
yang berlangsung dengan sendirinya ini berasal dari bagian RNA. Jenis RNAs yang
bersifat katalisis ini dikenal sebagai ribozim.1
C. Modifikasi 5’ dan 3’ dari mRNA
Tak lama setelah dimulainya transkripsi pada eukariot, ujung 5’ RNA yang
sedang terbentuk ditutup oleh suatu struktur yang disebut Topi penutup (cap). Pada
mRNAs, topi penutup tersebut terdiri atas suatu residu 7-metil-GTP. Topi penutup ini
melindungi RNA dari pemecahan oleh enzim 5’-eksonuklease. Setelah berakhirnya
transkripsi, pada ujung 3’ hnRNA ditambahkan suatu ekor poliadenilat yang
terbentuk dari kurang lebih 200 residu AMP. Setelah itu baru mRNA yang matang
meninggalkan inti sel. 1
SANDI GENETIK, AKTIVASI ASAM AMINO
A. Sandi genetik
Sebagian besar informasi genetik yang terkandung di dalam DNA menyandikan
urutan asam amino dari protein-protein yang fungsional. Pada ekspresi protein-
protein tersebut, suatu teks bahasa asam nukleat harus diterjemahkan ke dalam bahasa
8
protein. Atas dasar tersebut maka dikenal istilah tranlasi untuk biosintesis protein.
Aturan yang berlaku untuk penerjemahan tersebut dinamai sandi genetik.1, 2
Karena terdapat 20 asam amino proteinogen, maka bahasa asam nukleat
sekurangnya mengandung kata-kata (kodon) yang sama banyaknya. Didalam abjad
asam nukleat hanya terdapat 4 huruf (A, G, C dan U atau T). Untuk dapat membentuk
20 kata-kata yang berlainan, maka setiap kata harus mempunyai sedikitnya tiga huruf.
Pada kenyataannya kodon terdiri atas masing-masing tiga basa yang berurutan
(triplet).1, 3
Gambar 2. Struktur untaian ganda DNA
Dikutip dari Kopp2
Karena sandi untuk 20 asam amino tersedia dalam 43 = 64 kodon, maka untuk
kebanyakan asam amino terdapat lebih dari satu kodon sinonim. Tiga triplet tidak
mengandung sandi untuk asam amino melainkan memberi sinyal untuk berakhirnya
translasi (kodon berhenti). Kodon khusus lainnya adalah kodon mulai yang menandai
dimulainya penerjemahan. Sandi yang ditunjukkan berlaku hampir universal, hanya
di dalam mitokondria dan pada beberapa mikroorganisme terdapat penyimpangan
dari sandi standar.1
9
B. RNA Transfer
RNAs transfer (tRNAs) berfungsi sebagai anggota penghubung antara tingkat
asam nukleat dan tingkat protein. tRNA adalah molekul RNA kecil, terdiri atas 70-90
basa dan mampu mengenali kodon mRNA tertentu melalui pemasangan pasangan
basa. Bersamaan dengan itu tRNA pada ujung 3’ (urutan: ..CCA) membawa asam
amino tertentu yang berhubungan dengan kodon mRNA yang bersangkutan sesuai
dengan sandi genetik. Penerjemahan yang sesungguhnya diurus oleh enzim-enzim
yang secara selektif memberi tRNA muatan asam amino yang tepat.1
Urutan basa dan struktur tersier Phe-tRNA yang berasal dari ragi adalah khas
untuk semua tRNA. Suatu bagian yang besar dari molekul tersebut mengandung basa
yang tidak lazim terdapat dan mengalami modifikasi.1, 5
C. Aktivasi Asam amino
Kurang lebih 20 ligase asam amino-tRNA yang berbeda didalam sitoplasma
menghubungkan masing-masing satu jenis asam amino dengan tRNA yang
dimilikinya. Aktivasi asam amino berlangsung dalam dua langkah. Pertama, asam
amino akan diikat dan direaksikan dengan ATP, membentuk suatu anhidrida asam
yang kaya energi. Kemudian, gugus 3’-OH terminal tRNA akan mengambil alih
residu amino asil. Jadi pada amino asil-tRNA gugus karboksi asam amino
membentuk ikatan ester dengan residu ribosa adenosin terminal.1, 5, 6
Ketepatan translasi terutama tergantung dari spesifisitas ligase asam amino –
tRNA. Residu asam amino yang salah dimasukkan, tidak dapat dikenali oleh ribosom.
Karena itu, suatu mekanisme koreksi pembacaan didalam pusat aktif ligase mengatur
agar residu amino asil yang salah dimasukkan segera dilepaskan kembali. 1, 6
RIBOSOM, INISIASI DARI TRANSLASI
Seperti halnya aktivasi asam amino, biosintesis protein (translasi) berlangsung
didalam sitoplasma. Proses translasi dikatalisis oleh partikel nukleoprotein yang
kompleks, yaitu ribosom. Ribosom terdiri atas dua subunit dengan besar yang berlainan.
Ribosom tersusun dari RNA ribosom (rRNA) dan banyak protein. Sebagai ganti berat
molekul ribosom dan komponennya, biasanya digunakan koefisien sedimentasinya.
10
Ribosom eukariotik mempunyai koefisien sedimentasi kira-kira sebesar 80 Svedberg
(80 S). Koefisien sedimentasi dari masing-masing subunit adalah 40 S dan 60 S (nilai S
bukan merupakan penjumlahan).1, 6
Ribosom prokariotik terbentuk dengan cara yang serupa, tetapi sedikit lebih kecil
(koefisien sedimentasi: 70 S untuk ribosom lengkap, 30 S dan 50 S untuk subunit-
subunit). Ribosom mitokondria dan kloroplas dapat dibandingkan dengan ribosom
prokariot.1, 6
PROSES PERPANJANGAN DAN PENGAKHIRAN
Setelah inisiasi translasi, rantai peptida yang sedang terbentuk diperpanjang lebih
lanjut dengan residu-residu asam amino (perpanjangan) hingga ribosom pada mRNA
mencapai kodon berhenti dan proses dihentikan (pengakhiran).1
Perpanjangan dapat dibagi menjadi tiga fase. Pertama-tama tempat peptidil (P)
ribosom diisi oleh statu tRNA yang pada ujung 3’ membawa keseluruhan rantai peptida
yang telah terbentuk sampai saat tersebut (kiri atas). Kemudian statu tRNA kedua, yang
bermuatan asam amino yang sesuai (dalam contoh yang ditunjukkan disini adalah
val-tRNAval) dengan antikodonnya yang bersifat komplementer, berikatan pada kodon
mRNA (dalam hal ini GUG) yang terdapat dalam tempat akseptor.1
Gambar 3. Molekul Hexokinase. Suatu enzim utama penghasil energi sel, terdiri 6000 atom. Dikutip dari Kopp2
11
KERJA ANTIBIOTIKA
Antibiótika adalah zat-zat yang dibentuk oleh mikroorganisme dan menghambat
pertumbuhan atau perbanyakan mikroorganisme lain. Diantara antibiótika yang
digunakan untuk terapi infeksi, terdapat substansi yang mempengaruhi transkripsi atau
translasi penyebab penyakit bakterial.1, 7
Yang termasuk penghambat transkripsi misalnya rifampisin yang bekerja terhadap
penyebab tuberculosis. Rifampicin merupakan suatu zat penghambat polimerase RNA
yang tergantung pada DNA. Aktinomisin D dan Daunomisin terikat pada DNA
sehingga mengganggu transkripsi. Antibiotika amino glikosida yaitu Streptomisin
mempengaruhi translasi pada segala tahap. Tetrasiklin mengganggu ikatan tRNA pada
ribosom, sementara kloramfenikol menghambat peptidiltransferase. Yang terakhir
adalah Puromisin menyebabkan pengakhiran biosintesis protein pada tahap yang sangat
dini.1, 7
MUTASI DAN REPARASI
Informasi genetik diletakkan didalam urutan basa DNA. Karena itu perubahan
basa DNA atau urutan-urutannya mempengaruhi secara genotip (bersifat mutagen).
Banyak substansi mutagenik yang juga membahayakan kontrol pertumbuhan sel.
Substansi-substansi tersebut adalah karsinogen. Perubahan gen (mutasi) merupakan salah
satu faktor yang menentukan evolusi biologi. Disamping itu suatu sel yang mempunyai
tingkat kemungkinan terjadinya mutasi yang tinggi diragukan kemampuan hidupnya.
Karena itu sel-sel mempunyai mekanisme reparasi yang memusnahkan kembali sebagian
besar perubahan-perubahan DNA yang terbentuk akibat mutasi.1
A. Bahan-bahan mutagenik
Mutasi dapat terbentuk karena pengaruh fisik dan kimia, tetapi juga oleh
kesalahan yang kebetulan terjadi pada replikasi atau rekombinan DNA.1
Diantara mutagen fisik, yang terutama perlu disebutkan adalah penyinaran
ionisasi. Penyinaran ionisasi menghasilkan radikal bebas (molekul-molekul dengan
elektron yang tidak berpasangan) didalam sel. Molekul-molekul tersebut mampu
12
bereaksi (reaktif) secara ekstrim dan dapat merusak DNA. Juga sinar ultraviolet (UV)
gelombang pendek mempunyai pengaruh mutagenik yang terutama menyerang sel-sel
kulit. Perubahan kimia yang paling sering terjadi akibat penyinaran UV adalah
pembentukan dimer timin. Dua basa timin yang berdampingan saling berikatan secara
kovalen membentuk anyaman seperti jala. Hal ini menyebabkan kesalahan dalam
pembacaan DNA pada replikasi dan transkripsi.1
Dari kelompok besar mutagen kimia, diantaranya asam nitrit (HNO2) dan
hidroksilamin (NH2OH) mendesaminasi basa; keduanya mengubah misalnya sitosin
didalam urasil dan adenin didalam inosin. Senyawa yang mengalkilasi membawa
gugus yang reaktif, yang dapat membentuk senyawa kovalen dengan basa DNA.
Metilnitrosamin membebaskan kation metil (CH3+) reaktif, yang memetilasi gugus
OH- dan NH2- didalam DNA. Zat karsinogenik yang terkenal yaitu benzo(a)piren,
suatu senyawa CH yang bersifat aromatik, pertama-tama didalam organisme akan
diubah kedalam bentuk yang efektif. Melalui hidroksilasi salah satu cincin berulang
kali terbentuk suatu epoksid reaktif, misalnya yang bereaksi dengan gugus amino
guanin.1
B. Pengaruh
Asam nitrit menyebabkan mutasi noktah. Bila misalnya C diubah menjadi U,
maka pada replikasi selanjutnya nukleotida U tersebut akan berpasangan dengan A,
bukan dengan G. Akibatnya perubahan tersebut akan bersifat permanen. Mutasi yang
membuat nukleotida yang dibaca dalam kodon bukan 3 buah, melainkan bergeser
sehingga melebihi (insersi) atau berkurang (delesi) dari jumlah tersebut,
menyebabkan kesalahan pembacaan untuk seluruh bagian DNA, karena bingkai
pembacaan kodon ikut bergeser (mutasi pergeseran bingkai). Penyisipan (insersi)
nukleotida C ke dalam DNA mengakibatkan mRNA yang terbentuk diinterpretasikan
berlainan sehingga dihasilkan suatu urutan protein yang benar-benar baru.1, 8
C. Mekanisme perbaikan
Suatu mekanisme penting untuk melenyapkan kerusakan-kerusakan DNA
adalah perbaikan secara eksisi (1). Pada proses ini suatu nuklease memotong
13
keseluruhan bagian yang mengalami kesalahan DNA pada kedua sisi. Dengan
bantuan urutan dari untai yang berlawanan, bagian yang terpotong tersebut akan
kembali diisi oleh suatu polimerase DNA. Ligase DNA kemudian menutup kembali
celah pada kedua sisi. Dimer Timin dapat dilepaskan dengan cara reaktivasi cahaya
(2). Suatu liase cahaya berikatan pada defek tersebut dan pada pemberian cahaya
enzim tersebut dapat memotong dimer menjadi dua basa tunggal. Mekanisme ketiga
ialah perbaikan melalui rekombinasi (3). Pada proses ini, ditempat terjadinya
kesalahan, DNA tidak direplikasikan. Celah tersebut akan ditutup dengan cara
menggeser segmen yang sesuai dari untaian DNA yang direplikasikan secara tepat.
Celah baru yang terbentuk tersebut akan diisi oleh polimerase dan ligase. Akhirnya
defek semula, dapat dihilangkan dengan cara eksisi.1
TEKNIK GEN
A. Kloning gen
Kemajuan pesat genetika molekuler sejak tahun 1970 terutama didasarkan
atas perkembangan dan peningkatan mutu metode analisis dan manipulasi DNA.
Terkenal sebagai Teknik Gen, mempunyai arti praktis pada berbagai bidang. Teknik
tersebut misalnya menyediakan metode baru untuk diagnosis dan terapi penyakit, dan
juga saat ini memungkinkan perubahan dari sifat-sifat tertentu yang diinginkan pada
suatu organisme. Karena pada teknik semacam ini kemungkinan terjadinya risiko
biologik tidak boleh diabaikan, maka penggunaannya memerlukan penanganan yang
dilakukan dengan penuh tanggung jawab.1, 8
1. Endonuklease Restriksi
Pada sebagian besar cara kerja teknik gen, fragmen-fragmen DNA tertentu
harus diisolasi dan dikombinasikan dengan bagian DNA lainnya. Dalam hal ini
digunakan enzim-enzim, yang juga memotong DNA di dalam sel dan
menyatukannya kembali. Yang sangat penting adalah enzim nuklease restriksi,
suatu kelompok enzim-enzim bakteri yang memotong untaian ganda DNA secara
spesifik di urutan basa tertentu. Sejumlah besar enzim restriksi yang sudah
dikenal, diberi nama dengan singkatan yang menunjukkan organisme asalnya.
14
Misalnya, sebagai contoh diamati disini EcoRI, suatu nuklease yang diisolasi dari
bakteri Escherichia coli. Seperti endonuklease restriksi lainnya, EcoRI memutus
DNA secara palindrom, artinya suatu potongan pendek untai ganda DNA yang
kedua untaiannya mempunyai urutan yang sama, bila masing-masing untaian
dibaca dengan arah 5’ 3’, dalam hal ini adalah urutan 5’-GAATTC-3. EcoRI
adalah suatu protein homodimer yang memutus ikatan diester asam fosfat dari
kedua rantai diantara G dan A. Akibatnya terbentuk ujung-ujung yang menjorok
keluar (AATT) yang bersifat komplementer. Ujung-ujung tersebut masih dijaga
keutuhannya dengan adanya pemasangan basa. Namun demikinan kedua untaian
tersebut dapat dengan mudah dipisahkan, misalnya melalui pemanasan. Bila
fragmen tersebut kemudian didinginkan, ujung-ujung yang menjorok keluar
tersebut dapat kembali berhibridisasi dengan penyusunan yang tepat. Kemudian
dengan bantuan suatu ligase DNA, tempat pemotongan tersebut dapat ditutup.1
2. Kloning DNA
Sebagian besar fragmen DNA, misalnya gen, terdapat didalam sel hanya
dalam jumlah yang sangat kecil. Agar dapat bekerja dengan fragmen-fragmen
tersebut secara eksperimental, maka pertama-tama harus dibuat banyak salinan-
salinannya yang identik (klon). Metode klasik untuk kloning DNA didalm
laboratorium, dengan menggunakan kemampuan bakteri untuk memasukkan dan
memperbanyak fragmen DNA pendek yang berbentuk cincin. Fragmen tersebut
dikenal sebagai plasmid. Pertama-tama fragmen yang akan di kloning dilepaskan
dari DNA asalnya oleh endonuklease restriksi. (Untuk mempermudah, disini
hanya ditunjukkan suatu pemotongan DNA hanya oleh EcoRI, namun pada
prakteknya kebanyakan digunakan dua enzim yang berbeda). Sebagai vektor
diperlukan suatu plasmid, yang hanya mengandung satu tempat pemotongan
EcoRI. Cincin plasmid dibuka melalui pemotongan oleh EcoRI dan digabungkan
dengan fragmen DNA yang telah diisolasi. Fragmen dan vektor mempunyai ujung
menjorok keluar yang sama. Karena itu sebagian molekul berhibridisasi sehingga
fragmen berintegrasi kedalam DNA vektor. Bila kemudian tempat pemotongan
ditutup kembali oleh ligase DNA, maka terbentuk suatu plasmid dengan
15
kombinasi baru (rekombinan). Melalui penanganan awal pada sejumlah besar sel-
sel inang, maka sebagian sel-sel tersebut dapat menerima dan memasukkan
plasmid (proses ini dinamai transformasi). Pada kebanyakan sel, plasmid dapat
bereplikasi bersama-sama dengan genomnya sendiri. Untuk memastikan, bahwa
yang diperbanyak hanyalah bakteri inang yang mengandung plasmid, maka
digunakan plasmid yang mempunyai resistensi terhadap suatu antibiotika tertentu.
Bila bakteri diinkubasi dalam keadaan adanya antibiotika ini, maka yang dapat
memperbanyak diri hanyalah sel-sel yang mengandung plasmid tersebut.
Selanjutnya plasmid tersedbut diisolasi dari sel-sel inang dan setelah pemotongan
dengan EcoRI menghasilkan fragmen DNA yang dikloning dalam jumlah yang
besar.1
B. Analisis urutan DNA
1. Pustaka gen
Pada teknik gen sering diperlukan isolasi fragmen DNA yang belum dikenal
secara rinci, misalnya untuk menentukan urutan nukleotidanya.1
Untuk keperluan tersebut digunakan suatu Pustaka gen. Suatu pustaka
DNA terdiri atas sejumlah besar molekul DNA vektor yang mengandung
fragmen-fragmen yang berbeda dari DNA asing. Misalnya, seluruh molekul
mRNA yang terdapat didalam suatu sel disalin ulang dalam bentuk DNA dan
kemudian fragmen DNA tersebut ( diberi nama copy-DNA atau cDNA)
dimasukkan kedalam molekul vektor. Suatu pustaka DNA genom dibuat dengan
cara DNA total suatu sel dipotong-potong dengan bantuan endonuklease restriksi
menjadi fragmen-fragmen DNA dan kemudian dimasukkan kedalam DNA vektor.
Yang cocok untuk menjadi vektor bagi pustaka gen adalah bakteriofaga (secara
singkat : faga). Faga adalah virus yang menyerang bakteri dan memperbanyak diri
didalam bakteri.1
Teknik ini dimulai dengan cara mengencerkan sejumlah kecil pustaka
DNA (105 hingga 106 faga) dan dicampur dengan bakteri inang, kemudian
dicoretkan secara merata diatas lapisan agar yang mengandung zat-zat makanan.
Bakteri tumbuh sebagai koloni-koloni yang dalam jumlah banyak saling
16
menempel sehingga membentuk suatu lapisan sel yang keruh. Bakteri yang
diserang oleh faga, tumbuh kurang begitu cepat. Karena itu bakteri-bakteri
tersebut membentuk zona bundar dan lebih jernih disekeliling koloninya, yang
dikenal sebagai bercak. Sel-sel didalam bercak hanya mengandung keturunan dari
suatu faga tersendiri yang berasal dari pustaka DNA asalnya. Kemudian dibuat
cetakan dari lempeng agar tersebut dengan cara menempelkan suatu lapisan
membran buatan diatas lempeng agar dan dipanaskan. Akibatnya DNA faga
menempel pada membran. Selanjutnya membran tersebut diinkubasi dengan suatu
fragmen DNA (suatu pelacak gen) yang dapatberhibridisasi dengan fragmen
DNA yang dicari. Pelacak gen akan berikatan pada tempat-tempat tertentu dimana
DNA yang diinginkan menempel pada membran. Ikatan pelacak gen dapat
dibuktikan bila sebelumnya pelacak gen diberi tanda dengan radioaktif atau
dengan cara lain. Selanjutnya dilakukan perbanyakan faga yang berasal dari
bercak positif lempeng asalnya. Melalui pemotongan secara restriksi akhirnya
diperoleh sejumlah besar DNA yang diinginkan.1
2. Analisis urutan DNA
Saat ini penentuan urutan nukleotida DNA kebanyakan dilakukan menurut
metode penghentian sintesis rantai. Pertama-tama dilakukan kloning fragmen
DNA kedalam DNA faga M13. Darai faga M13 dapat dengan mudah diisolasi
untaian tunggal DNA yang bersifat kodogenik berdasarkan sifat-sifat tertentu.
DNA untai tunggal tersebut dihibridisasi dengan suatu fragmen DNA pendek
yang disebut primer. Primer berikatan pada ujung 3’ untaian tunggal DNA
tersebut. Bertitik tolak dari hibrida semacam ini, kemudian untaian DNA kedua
yang masih belum lengkap, dapat dilengkapi didalam tabung reaksi, dengan cara
menambahkan deoksinukleosida trifosfat (dNTP, jadi maksudnya campuran
dGTP, dATP, dTTP dan dCTP) dan polimerase DNA. Selain dNTP ditambahkan
juga satu macam dideoksinukleosida trofosfat (ddNTP) dalam jumlah kecil.
Pemasangan ddNTP kedalam rantai DNA yang sedang terbentuk mengakibatkan
berhentinya sintesis untai DNA tersebut. Hal tersebut kemudian berulang
17
kembali, karena dNTP yang seharusnya dipasang kedalam rantai DNA digantikan
oleh ddNTP yang sesuai. 1
C. PCR, RFLP
1. Reaksi Rantai Polimerase (PCR=Polymerase Chain Reaction)
Reaksi rantai polimerase (PCR) memungkinkan perbanyakan (amplifikasi)
fragmen DNA yang diinginkan tanpa menggunakan enzim restriksi, vektor dan
sel inang. Untuk itu hanya diperlukan dua oligonukleotida (primer) yang masing-
masing berhibridisasi dengan salah satu untaian DNA yang akan diamplifikasi
pada sisi yang berbeda, dan juga keempat deoksinukleosida tifosfat dalam jumlah
yang cukup serta suatu polimerase DNA khusus yang tahan panas. 1
Pertama-tama, untaian ganda DNA dipisahkan menjadi untaian tunggal
melalui pemanasan. Kemudian dibiarkan agak sedikit dingin agar hibridisasi
primer dapat terjadi. Bertitik tolak dari sini, selanjutnya disintesis untaian DNA
komplementer dari awal dalam dua arah. Daur ini, akan diulangi 20-30 kali
dengan campuran reaksi yang sama. Setelah daur yang ketiga akan terbentuk
untaian berganda DNA yang mempunyai panjang yang sesuai dengan jarak antara
kedua primer. Pada setiap daur, jumlah DNA untai ganda tersebut meningkat
sebanyak kurang lebih dua kalinya, hingga akhirnya hampir seluruh fragmen yang
baru disintesis mempunyai panjang yang diinginkan. Pamanasan dan pendinginan
yang terus berulang secara siklik diatur oleh termostat dibawah pengawasan
komputer.1
2. Analisis RFLP
Endonuklease restriksi memotong DNA pada tempat-tempat yang sangat
khas dan sebagian besar merupakan palindrom. Bila suatu basa didalam suatu
tempat pengenalan semacam ini mengalami perubahan karena mutasi, maka
enzim restriksi yang bersangkutan tidak lagi dapat memotong DNA pada tempat
tersebut. Sebaliknya, melalui lutasi dapat terbentuk tempat restriksi yang baru.
Fragmen DNA yang sebanding dari dua individu berbeda yang secara genetik
tidak identik sering menghasilkan fragmen restriksi yang berbeda panjangnya.
18
Efek ini dikenal sebagai polimorfisme dari panjang fragmen restriksi (restriction
fragment length polymorphism, RFLP).1
3. Ekspresi berlebihan dari protein
Untuk terapi penyakit-penyakit tertentu diperlukan protein,misalnya
proteohormon yang terdapat pada organisme hewan dalam jumlah yang
sedemikian kecil sehingga sulit diisolasi. Protein semacam ini dapat dihasilkan
melalui ekspresi berlebihan didalam bakteri atau sel-sel eukariotik. Untuk itu
diisolasi gen yang bersangkutan dari DNA dan disisipkan kedalam suatu plasmid
ekspresi. Plasmid tersebut harus mengandung, selain gen itu sendiri, juga
potongan-potongan DNA lainnya yang dapat memungkinkan terjadi replikasi dan
transkripsi gen tersebut bila plasmid berada didalam sel inang. Setelah
transformasi dan perbanyakan sel inang yang cocok untuk plasmid tersebut,
dilakukan suatu transkripsi gen yang efisien melalui induksi yang terarah. Yang
terakhir, melalui translasi dari mRNA yang terbentuk dihasilkan protein yang
diinginkan dalam jumlah besar.1
19
DAFTAR PUSTAKA
[1] Koolman J, Rohm KH. Atlas Berwarna & Teks Biokimia. 1st ed. Stuttgart: Hipokrates 2001.[2] Kopp P. Genetics. Evidence-based Endocrinology. Second ed. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins:261-76.[3] Ganong WF. The Gonads:Development & Function of the Reproductive System. Review of Medical Physiology. 22 ed. San Francisco: McGraw Hill 2005:411-53.[4] Guyton CA, Hall JE. Textbook of medical physiology. Philadelphia: W.B. Saunders company 1996.[5] Ganong WF. Physiology of reproduction in women. In: DeChenney AH, Pernoll ML, eds. Curent obstetrics & Gynecologic. Connecticut: Appleton & Lange 1994:124-45.[6] Schumm DE. Core Concepts in Clinical Molecular Biology. First ed. Philadelphia - New York: Lippincott - Raven 1997.[7] Speroff L, Glass RH, Kase NG. Clinical Gynecologic Endocrinology and infertility. 7 ed. Baltimore: Lippincott Williams & Wilkins 2005.[8] Abbas AK, Lichtman AH, Pillai S. Cellular and Molecular Immunology. 6th edition ed. Philadelphia: Saunders elsevier 2007.
20
top related