3. replikasi dna
Post on 27-Dec-2015
81 Views
Preview:
DESCRIPTION
TRANSCRIPT
Oleh :Maman SF., S.Si, M.Biomed.
Departemen Biologi Molekuler Fakultas KedokteranUniversitasPembangunan Nasional
• Sebelum pembelahan sel seluruh molekul DNA harus diduplikasi
• Duplikasi suatu molekul DNA menjadi 2 molekul DNA disebut replikasi
• Terdapat 3 model replikasi DNA:
1.Semikonservatif
2.Konservatif
3.Dispersif
REPLIKASI DNA
Replikasi DNA :
• M.S. Meselson & F.W. Stahl (1958)E. coli medium yang mengandung isotop 15N
(isotop berat) beberapa generasi
medium yang mengandung isotop 14N (isotop ringan)
sentrifugasi gradien densitas
DNA hibrid
DNA berat (15N)DNA ringan (14N)
Replikasi DNA :
Meselson & Stahl – 1958
Denaturasi & Renaturasi DNA :
• DNA dupleks dipanaskan pemisahan dan perubahan sifat fisik DNA
• Denaturasi peningkatan absorbans UV DNA efek hiperkromik
• Titik leleh (melting temperature = Tm) suhu pada saat setengah dari hiperkromasitas maksimum tercapai
Denaturasi & Renaturasi DNA :
Rel
ati
ve
ab
sorb
ance
at
260
nm
Per
cen
t h
yp
erch
rom
icit
y
• Kondisi yang dapat menyebabkan denaturasi: suhu yang tinggi, konsentrasi garam yang rendah, pH tinggi
• Apabila suhu larutan DNA, yang terdenaturasi oleh suhu tinggi, diturunkan sekitar 25 oC di bawah Tm terjadi renaturasi dupleks DNA annealing
Denaturasi & Renaturasi DNA :
• Mekanisme replikasi pada umumnya:– Kompleks duplikasi DNA berjalan
simultan dupleks DNA harus terpisah dan mengalami unwinding
– Berjalan dengan cepat – Akurat untuk menjamin integritas alur
penyampaian informasi genetik
Replikasi DNA :
Replikasi DNA :
• Replikasi DNA sirkular pada prokariota disebut sebagai replikasi (membentuk struktur seperti )
• Struktur menunjukkan adanya pemisahan untai DNA asal yang disertai sintesis DNA komplementer membentuk DNA baru
Replikasi DNA :
• Replikasi DNA dimulai dari suatu tempat khusus yang disebut origin of replications replikasi berjalan ke dua arah menjauhi tempat inisiasi gelembung replikasi
• Replication origins:
– Pada eukaryota: ratusan hingga ribuan banyak gelembung replikasi
– Pada prokariota: hanya satu satu gelembung replikasi
Replikasi DNA :
• Percabangan pada gelembung replikasi disebut garpu replikasi
• Garpu replikasi tempat “tumbuhnya” DNA baru
Replikasi DNA :
Tahap Elongasi
• Arah replikasi: 5’ 3’
• DNA polimerase hanya dapat menambahkan nukleotida pada ujung 3’ untai DNA yang baru perlu primer RNA
Replikasi DNA :
Replikasi DNA :
Replikasi DNA :
• Primer RNA– Mengawali sintesis DNA karena DNA
polimerase memerlukan ujung 3’-OH bebas untuk penambahan nukleotida
– Panjang primer tergantung spesies berkisar 1-60 nukleotida
– Sintesis primer RNA dikatalisis oleh primase dan RNA polimerase
Replikasi DNA :
Primer RNA :– Primase sintesis primer RNA pada lagging
strand– Primase & RNA polimerase bekerja sinergistik
sintesis primer RNA pada leading strand– Setelah sintesis DNA berjalan primer RNA
disingkirkan dan diganti dengan basa DNA oleh DNA polimerase
Replikasi DNA :
Mengawali sintesis DNA dengan RNAMengawali sintesis DNA dengan RNA
• Arah replikasi kedua untai DNA adalah searah kedua untai DNA disintesis dengan cara yang berbeda (semidiskontinu):– Leading strand: sintesis berjalan dari 5’ 3’
secara kontinu sesuai arah garpu replikasi– Lagging strand: sintesis berjalan dari 5’ 3’
secara diskontinu dengan cara “back & fill” disebut fragmen Okazaki
Replikasi DNA :
21
REPLIKASI DNA
Replikasi DNA :
• Fragmen Okazaki:– Pada E.coli: ± 1000-2000 nukleotida
– Pada eukaryota: 100-200 nukleotida
– Disambung oleh DNA ligase
Replikasi DNA :
• DNA ligase– Menyambung fragmen Okazaki– Mengkatalisis pembentukan ikatan
fosfodiester antara ujung 3’-OH pada DNA yang satu dengan ujung 5’-P pada DNA yang lain
– Perlu energi dari hidrolisis:• NAD+ NMN+ + AMP (pada E. coli)• ATP PPi + AMP (pada eukariota)
Replikasi DNA :
Replikasi DNA :
• DNA polimerase mengkatalisis sintesis untai DNA yang baru
• Komponen yang diperlukan untuk reaksi polimerisasi:
– dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
– Mg2+
– Primer RNA (ujung 3’-OH bebas)
– Cetakan (template) DNA
Replikasi DNA :
• Reaksi polimerisasi terjadi melalui serangan nukleofilik ujung 3’ terhadap atom P pada nukleotida trifosfat
• Pada saat nukleotida trifosfat ditambahkan terlepas 2 molekul fosfat yang disertai energi eksorgenik mendorong energi endorgenik untuk pembentukan ikatan antar nukleotida
DNAn + dNTP DNAn+1 + PPi
Replikasi DNA :
Replikasi DNA :
Replikasi DNA Prokariota
Tahap Inisiasi
• Replikasi dimulai pada daerah OriC
• Beberapa protein terlibat pada tahap inisiasi replikasi
Replikasi DNA Prokariota :
DnaA terikat pada situs 9 nt
OriC terbuka pada daerah AT-rich
pengikatan kompleks DnaB (helikase)-DnaC DnaC-DnaC
unwinding DNA
(dipertahankan oleh SSBP)
pembentukan primer RNA
Replikasi DNA
Replikasi DNA Prokariota :
Tahap Inisiasi
Replikasi DNA Prokariota :
Tahap Inisiasi• Protein yang diperlukan pada inisiasi
replikasi DNA:– DnaA membuka heliks DNA pada OriC– DnaB (helikase) unwinding DNA
• memerlukan ATP
Tahap Inisiasi– DnaB (helikase)
• pd prokariota ada 2: helikase II (utk lagging strand) & prot Rep (utk leading strand)
Helikase IIProtein Rep
Leading strand
Lagging strand
3’
5’
5’
3’
Replikasi DNA Prokariota :
Tahap Inisiasi– SSBP (single stranded binding protein)
mempertahankan DNA tetap dalam bentuk untai tunggal• Tidak perlu ATP
Helikase IIProtein Rep
3’
5’
5’
3’
SSBP
Replikasi DNA Prokariota :
– DnaC diperlukan untuk pengikatan DnaB pada OriC
– DnaG (primase) sintesis primer RNA
– DNA girase (DNA topoisomerase II) membentuk negative supercoiled DNA untuk membebaskan tegangan torsional yang disebabkan oleh aktivitas helikase membantu proses unwinding berikutnya
Replikasi DNA Prokariota :
Replikasi DNA Prokariota :
Replikasi DNA Prokariota :
Tahap Elongasi
• Sintesis DNA dikatalisis oleh enzim DNA Polimerase
• Pada prokariota ditemukan 3 tipe DNA polimerasi: DNA polimerase I, II dan III
• Fragmen Okazaki disambung oleh DNA ligase
Replikasi DNA Prokariota :
• DNA Polimerase I– Diisolasi dari E.coli oleh Arthur Kornberg
(1957)
– Merupakan rantai polipeptida tunggal
– BM 103 kD
N C
fragmen kecil fragmen besar (fragmen Klenow)
Eksonuklease 5’3’
Eksonuklease 3’5’
Polimerase
Replikasi DNA Prokariota :
DNA Polimerase I :
– Aktivitas:
• Polimerase 5’ 3’:
–Penambahan basa yang komplementer dengan cetakan
–Mensintesis DNA ± 20 nukleotida
–Kecepatan: 10 nukleotida/detik
–Tingkat kesalahan 1 x 10-4
Replikasi DNA Prokariota :
DNA Polimerase I :
– Aktivitas:
• Proof reading: eksonuklease 3’ 5’
–Diaktifkan oleh nukleotida ujung 3’ yang tidak berpasangan
Hidrolisis oleh eksonuklease 3’ 5’
Replikasi DNA Prokariota :
DNA Polimerase I :
– Aktivitas:
• Proof reading: eksonuklease 3’ 5’
–Mencegah kesalahan selama proses replikasi
–Tingkat kesalahan 1 x 10-4
Replikasi DNA Prokariota :
DNA Polimerase I :
– Aktivitas:
• Koreksi kesalahan: eksonuklease 5’3’
–Memotong hingga 10 nukleotida dari ujung 5’
–Berperan pada:
»Sistem perbaikan DNA pada mutasi akibat UV dan mutagen kimia
»Pemotongan primer RNA
Replikasi DNA Prokariota :
Hidrolisis oleh eksonuklease 5’ 3’
Replikasi DNA Prokariota :
• DNA Polimerase II– BM 90 kD
– Aktivitas:
• Polimerase
• Eksonuklease 3’5’
– Lebih berperan pada perbaikan DNA
– Kecepatan: 5-10 nukleotida/detik
Replikasi DNA Prokariota :
• DNA Polimerase III– Merupakan enzim untuk replikasi DNA
kromosomal
– BM ± 900 kD
– Merupakan suatu holoenzim, terdiri atas >10 subunit protein subunit , , sebagai core enzyme
Replikasi DNA Prokariota :
• DNA Polimerase III
Replikasi DNA Prokariota :
• DNA Polimerase III– Aktivitas utama:
• Polimerisasi –Subunit –Sintesis DNA hingga ribuan nukleotida–Kecepatan: 1000 nukleotida/detik
• Eksonuklease 3’5’–Subunit –Editor utama replikasi DNA ketelitian
replikasi meningkat hingga 200 kali
Replikasi DNA Prokariota :
• DNA Polimerase III– Aktivitas subunit lain:
• Subunit partisipasi pd inisiasi replikasi
• Subunit 2 molekul subunit ini m’cengkram DNA cetakan (sliding clamp)
Replikasi DNA Prokariota :
• DNA Polimerase III– Aktivitas subunit lain:
• Subunit , , , ’, , loader clamp
• Subunit berperan pada interaksi subunit dengan subunit lain
Replikasi DNA Prokariota :
• Koordinasi sintesis leading & lagging strand
Replikasi DNA Prokariota :
• Koordinasi sintesis leading & lagging strand
Replikasi DNA Prokariota :
• Koordinasi sintesis leading & lagging strand– 2 molekul DNA polimerase III didekatkan
oleh subunit – Besar lengkung DNA bertambah saat
sintesis lagging strand– Setelah fragmen Okazaki selesai
disintesis DNA polimerase lagging strand dipindahkan untuk mensintesis fragmen berikut
Replikasi DNA Prokariota :
• Koordinasi sintesis leading & lagging strand
Lodish et al., Molecular Cell Biology, 4th edition
Replikasi DNA Prokariota :
Tahap Terminasi• Pada lokus Ter (T) berseberangan
dengan OriC (Promotor)• Lokus Ter terdiri atas sekuens
GTGTGTTGT berikatan dengan protein Tus terminasi sintesis DNA
• Ikatan protein Tus Ter berinteraksi dengan DnaB menghambat aktivitas helikase DnaB
Replikasi DNA Prokariota :
Replikasi DNA Prokariota :
Tahap Terminasi• Replikasi searah jarum jam: melalui Ter E,
Ter D, Ter A dan berhenti pada Ter C atau Ter B atau Ter F
• Replikasi berlawanan arah jarum jam: melalui Ter F, Ter B, Ter C dan berhenti pada Ter A atau Ter D atau Ter E
Replikasi DNA Prokariota :
Tahap Terminasi
Replikasi DNA Eukariota
• Siklus sel terbagi menjadi 4 fase: fase M, fase G1, fase S, fase G2
• Replikasi DNA eukariota berlangsung pada fase S siklus sel sebelum pembelahan sel pada fase M
Replikasi DNA Eukariota :
Tahap Inisiasi
• Replication origin pada eukariota: ARS (autonomously replicating sequence) terdiri atas 100-200 bp mengandung sekuens kaya-AT
• Protein Origin Recognition Complex (ORC) analog DnaA pada E. coli berikatan dengan ARS
Tahap Elongasi
• Ada 5 tipe DNA polimerase pada eukariota: DNA polimerase , β, , dan
• Sintesis leading dan lagging strand dilakukan oleh enzim polimerase yang berbeda
Replikasi DNA Eukariota :
• DNA polimerase – Terdapat di nukleus; > 250 kD
– Aktivitas:
• Replikasi DNA 5’3’
–Sintesis 100-200 nukleotida lagging strand
–Kecepatan: 50 nukleotida/detik
• Primase
–Sintesis primer RNA: 5-15 nukleotida
Replikasi DNA Eukariota :
• DNA polimerase – Terdapat di nukleus; 170 kD
– Aktivitas:
• Replikasi DNA 5’3’
–Replikasi seluruh cetakan DNA sintesis leading strand
• Eksonuklease 3’5’
–Aktivitas proofread
Replikasi DNA Eukariota :
• DNA polimerase – Terdapat di nukleus; 256 kD
– Aktivitas:
• Replikasi DNA 5’3’
–Tidak membentuk kompleks dengan PCNA
–Berperan pada perbaikan DNA dan sintesis DNA pada celah antar fragmen Okazaki
Replikasi DNA Eukariota :
• DNA polimerase – Aktivitas:
• Eksonuklease 3’5’
–Aktivitas proofread utama
• Eksonuklease 5’3’
–Berperan pada perbaikan kerusakan DNA akibat radiasi UV
Replikasi DNA Eukariota :
• DNA polimerase – Polimerase yang paling kecil (36-38 kD)
– Fungsi: untuk perbaikan DNA
• DNA polimerase – Terdapat di mitokondria; 160-200 kD
– Fungsi: replikasi DNA mitokondria
Replikasi DNA Eukariota :
• DNA polimerase – Sintesis leading strand mendahului sintesis
lagging strand setelah sintesis leading strand mencapai 2/3 dari kromosom mitokondria cetakan lagging strand terpapar mulai bereplikasi dengan arah yang berlawanan
– Leading strand menggantikan cetakan untuk lagging strand D-loop
Replikasi DNA Eukariota :
• Replikasi DNA mitokondria
Replikasi DNA Eukariota :
• PCNA– Merupakan protein trimerik– Hanya terdapat pada nukleus sel yang
berproliferasi– Berperan sebagai clamp kompleks DNA
polimerase - PCNA sintesis leading strand
– Analog subunit DNA polimerase III pada E.coli
Replikasi DNA Eukariota :
• RNase H1 & FEN (Flap Endonuclease-1) – RNase H1 memotong primer RNA
meninggalkan ribonukleotida pada ujung 5’ di dekat DNA disingkirkan oleh FEN
– Celah yang terbentuk akan diisi oleh DNA polimerase
Replikasi DNA Eukariota :
• Replication factor C (RFC)
– Berikatan dengan DNA polimerase – Membantu asosiasi DNA dengan PCNA
• Replication factor A (RFA) = Replication protein A (RPA)
– Analog SSBP pada replikasi DNA prokariota
Replikasi DNA Eukariota :
Replikasi DNA Eukariota :
Replikasi DNA Eukariota :
• Kromosom linier menimbulkan masalah pada akhir replikasi (end replication problem):– lagging strand tidak dapat lengkap
disintesis– kromosom menjadi semakin pendek
setelah setiap kali replikasi
Dapat diatasi dengan telomer
Replikasi DNA Eukariota :
• Pada akhir replikasi terdapat celah (gap) pada ujung lagging strand setelah primer RNA disingkirkan
• Untuk mengatasi masalah ini sel eukariota mereplikasi ujung kromosomnya disebut telomer
Replikasi DNA Eukariota :
Telomer
• Mengandung sekuens berulang pada manusia: 5’-TTAGGG-3’
• Disintesis oleh telomerase
Replikasi DNA Eukariota :
• Telomerase– Merupakan reverse transcriptase
– Mengandung komponen protein dan RNA
– RNA berfungsi sebagai cetakan
– Penambahan telomer mengimbangi pemendekan kromosom akibat replikasi
– Telomere binding protein melindungi ujung kromosom dari nuklease
Replikasi DNA Eukariota :
top related