Alat-alat dan teknik-teknik yang dipakai dalam rekayasa genetika

Kloning gen Teknologi DNA rekombinan, Rekayasa genetika, Kloning molekulerPrinsip dasarnya adalah memasukkan suatu gen dari suatu organisme ke sel host dengan tujuan memelihara gen tersebut secara terus menerus dan dipelajari.

Langkah kerja dalam kloning DNA

Teknologi DNA rekombinan Berkembang pada awal tahun 1980. Berakar dari ilmu biokimia dan genetika. Terjadi peningkatan pengetahuan yang signifikan tentang dasar molekuler penyakit-penyakit genetik pada manusia. Diterapkan dalam bidang pertanian, peternakan, kedokteran forensik, penelitian penelitian dasar.

Enzim restriksi endonuklease Teknologi DNA rekombinan tidak dapat berjalan tanpa adanya enzim restriksi endonuklease. RE dapat memotong secara simetris ikatan fosofodiester pada untai DNA yang berlawanan pada situs spesifiknya.

Beberapa contoh enzim restriksi

Enzim EcoRI

Sekuens pengenalan 5-GAATTC-3 3-CTTAAG-5 5-GGATCC-3 3-CCTAGG-5 5-AGCT-3 3-TCGA-5 5-CTGCAG-3 3-GACGTC-5

Jenis ujungSticky, 5 overhang Sticky, 5 overhang

End sequences 5-G AATTC-3 3-CTTAA G-5 5-G GATCC-3 3-CCTAG G-5 5-AG 3-TC CT-3 GA-5

BamHI

AluI

Blunt Sticky, 3overhang

PstI

5-CTGCA G-3 3-G ACGTC-5

Enzim restriksi endonuklease

Vektor kloning Suatu wadah yang dipergunakan untuk memperbanyak fragment DNA yang ingin dipelajari, untuk transkripsi, invitro mutagenesis, dan sekuensing DNA insert. Terdiri dari beberapa macam: plasmid (elemen bakteri ekstrakromosom yang dapat bereplikasi sendiri), bakteriophage, cosmid, dll.

Plasmid

Syarat vektor kloning Dapat dipelihara dan direplikasikan di dalam sel host. Mengandung satu atau lebih situs restriksi endonuklease tunggal yang menyediakan pilihan situs insersi yang memungkinkan. Contoh: Pemotongan DNA sumber dan vektor dengan enzim RE yang sama, disatukan dalam tube yang sama, ditambahkan enzim T4DNA ligase DNA diinkorporasikan ke situs spesifik. Membawa gen resisten terhadap antibiotik tertentu.

Sequencing Sequencing: metoda untuk membaca urutan basa-basa nukleotida dari suatu gen. Ada 2 metoda sequencing: - Chain termination method (Sanger et al., 1977): urutan molekul DNA untai tunggal ditentukan dengan sintesis rantai polinukleotida komplementer secara enzimatis. - Chemical degradation method (Maxam and Gilbert, 1977): urutan molekul DNA untai ganda ditentukan dengan menggunakan bahan kimia yang memotong molekul DNA pada posisi nukleotida tertentu. Keunggulan chain terminal method: Lebih mudah dikerjakan secara otomatis menggunakan mesin sekuensing, bahan-bahan yang digunakan tidak toksik.

Chain termination sequencing Prinsip kerja: berdasarkan perbedaan panjang molekul DNA untai tunggal yang dipisahkan dengan elektroforesis gel poliakrilamid. Dengan gel ini dapat dipisahkan sekelompok molekul mulai dari 10 1500 nukleotida ke dalam suatu seri pita DNA. Langkah kerja: 1. Mempersiapkan molekul DNA untai tunggal yang identik sebagai cetakan. 2. Penempelan (annealing) primer pada DNA cetakan.

3. Reaksi perpanjangan rantai dengan bantuan enzim DNA polimerase. 4. Inkorporasi dNTP dan ddNTP pada rantai yang diperpanjang. 5. Elektroforesis pita DNA yang baru disintesis menggunakan gel poliakrilamid. Setelah elektroforesis urutan DNA dapat dibaca langsung dari posisi pita pada gel . Pita yang bergerak paling jauh merupakan pita DNA terkecil.

Sequencing

Automathic chain termination Prinsip: menggunakan label radioaktif untuk melacak nukleotida yang diinkorporasikan. Radioaktif yang digunakan adalah 33P atau 35S karena energi emisinya rendah sehingga dapat menghasilkan resolusi yang tinggi. Label dikaitkan ke ddNTP dengan warna yang berbeda untuk setiap nukleotidanya. Keunggulan: Reaksi sekuensing dapat dilakukan dalam 1 tube dan loading ke-4 molekul nukleotida dilakukan dalam 1 lane gel poliakrilamid karena detektor fluorescent dapat membedakan antara label-label yang berbeda.

Automatic chain termination

Chemical degradation method Prinsip kerja: molekul DNA dihasilkan setelah diberi perlakuan dengan bahan kimia yang memotong secara spesifik pada nukleotida tertentu. Langkah kerja: 1.Denaturasi DNA untai ganda menjadi untai tunggal 2.Pemberian label pada masing-masing ujung DNA untai tunggal. 3. Molekul diberi dimethyl sulfate yang menempelkan grup metil pada cincin purin dari nukleotida G (terjadi modifikasi nukleotida G).

Karena pemberian dimethyl sulfate hanya dalam jumlah kecil maka proses modifikasi berlangsung lambat (1 per nukleotida). Pada stadium ini untai DNA masih utuh. Pemotongan untai DNA akibat pemberian piperidine. Piperidine membuang cincin G yang dimodifikasi dan memotong molekul DNA pada ikatan fosfodiester tepat pada bagian atas dari cincin G yang dibuang. Hasilnya adalah suatu set DNA yang terpotong-potong, ada yang terlabel dan ada yang tidak. Potongan untai DNA yang dihasilkan tidak sama panjang (hasilnya equivalent dengan hasil yang didapat dari metoda chain terminal). Potongan-potongan DNA ini selanjutnya dielektroforesis dalam gel poliakrilamid.

Chemical degradation method

SSCP Metoda untuk mendeteksi mutasi 1 basa pada suatu untai DNA tunggal dari suatu gen. Prinsip kerja: terjadinya perubahan konformasi untai DNA tunggal akibat adanya mutasi yang terdeteksi dari posisi pita DNA dalam gel poliakrilamid.

Langkah kerja: Aplifikasi gen yang akan diamati dengan PCR. Denaturasi DNA untai ganda menjadi untai tunggal. Elektroforesis DNA untai tunggal dalam gel poliakrilamide selama s 4 jam. Visualisasi pita-pita DNA dengan pewarnaan perak nitrat.

SSCP