Isolasi Dan Karakterisasi Bakteri Resisten Merkuri Di Hilir Kali Mas Surabaya

Atik Widiyanti*, Maya Shovitri1, Nengah Dwianita Kuswytasari

2

Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Institut Teknologi Sepuluh Nopember Surabaya

ABSTRAK

Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan mengkarakterisasi bakteri resisten

merkuri dari sedimen dan air sungai tersebut. Isolasi dilakukan dengan menggunakan medium

Nutrient Agar (NA) yang mengandung 10‰ NaCl dan 10 ppm HgCl2. Dari hasil penelitian

diperoleh 24 isolat bakteri resisten merkuri. Berdasarkan 13 karakter biokimia yang diujikan,

isolat tersebut cenderung masuk ke dalam 9 genus berbeda, yaitu Bacillus, Mycobacterium,

Escherichia, Providencia, Erwinia, Staphylococcus, Micrococcus, Neisseria, Azotobacter.

Kata kunci: merkuri, Hilir Kali Mas, bakteri resisten merkuri

ABSTRACT

This study was aimed to isolate and characterize mercury resistant bacteria from

sediment and water of the river. Isolation was performed using a Nutrient Agar (NA) medium

containing 10‰ NaCl and 10 ppm HgCl2. The study was successfully isolated 24 mercury

resistant bacteria. Based on 13 biochemical tested character they were tended to fall into 9

different genera: Bacillus, Mycobacterium, Escherichia, Providencia, Erwinia, Staphilococcus,

Micrococcus, Neisseria, Azotobacter.

Key word: mercury, the Downstream Mas River Surabaya, mercury resistant bacteria

*Corresponding Author Phone: 085730098675

Email: kita_wyanti@yahoo.com 1,2

Alamat sekarang: Jurusan Biologi, FMIPA

Institut Teknologi Sepuluh Nopember, Surabaya

I PENDAHULUAN

Pencemaran logam berat merkuri

(Hg) pada tanah dan air sangat

membahayakan lingkungan dan kesehatan

manusia. Senyawa merkuri dalam bentuk

Hg(II) dapat terikat pada residu sistein

protein atau enzim manusia atau binatang,

sehingga protein atau enzim kehilangan

aktivitasnya. Selain Hg(II), senyawa merkuri

yang paling berbahaya bagi kesehatan

manusia adalah senyawa organomerkuri,

khususnya metilmerkuri dan fenilmerkuri.

Senyawa ini bersifat sangat reaktif dan

mempunyai mobilitas tinggi dibanding

dengan Hg(O) atau Hg(II). Hal ini

disebabkan gastrointestine manusia mampu

menyerap sekitar 95% senyawa

metilmerkuri, dan senyawa ini juga dapat

menyerang syaraf manusia melalui

peredaran darah (Rugh et al., 2000 dalam:

Nofiani dan Guzrisal, 2004).

Salah satu usaha untuk detoksifikasi

merkuri dapat dilakukan menggunakan

mikroorgansime resisten merkuri. Bakteri

resisten merkuri merupakan bakteri yang

mempunyai gen resisten merkuri mer

operon untuk bertahan pada lingkungan

yang mengadung merkuri (Silver &

Phung,1998). Struktur mer operon berbeda

untuk tiap jenis bakteri. Umumnya struktur

mer operon terdiri dari gen metaloregulator

(merR), gen transpor merkuri (merT, merP,

merC), gen merkuri reduktase (merA) dan

organomerkuri liase (merB) (Liebert et al.,

1999). Beberapa ordo bakteri resisten

merkuri yang terindentifikasi diantaranya

adalah Burkholderiales, Nitrosomonadales,

Rhodocyclales, Altermonadales (Ramond et

al., 2008).

Kali Mas Surabaya merupakan

sungai yang banyak menerima limbah

domestik maupun limbah industri di

sepanjang alirannya. Pada tahun 2009

terukur konsentrasi merkuri di Kali Mas

sebesar 0.105 ppm. Konsentrasi tersebut

melebihi ambang batas minimal yaitu 0.001

ppm yang ditetapkan Pemerintah melalui PP

no. 82 tahun 2001 (Shovitri et al., 2010).

Hilir Kali Mas Surabaya berada di

Pelabuhan Tanjung Perak. Pelabuhan

Tanjung Perak Surabaya merupakan salah

satu pelabuhan pintu gerbang di Indonesia.

Tanjung Perak adalah pusat kolektor dan

distributor barang dari/ke Kawasan Timur

Indonesia, khususnya untuk Propinsi Jawa

Timur. Pelabuhan Tanjung Perak Surabaya

merupakan pelabuhan dengan lalu lintas

kapal yang cukup padat yaitu sekitar 40

kapal yang bersandar tiap harinya.

Ramainya lalu lintas tersebut menimbulkan

kecenderungan meningkatnya volume

buangan kapal (Rezvani, 2006). Selain itu,

di sekitar lokasi pelabuhan Tanjung Perak

Surabaya terdapat industri galangan kapal

seperti beberapa galangan di Tambatan

Nilam, PT. PAL Indonesia dan PT. Dok dan

Perkapalan Surabaya (Rezvani, 2006).

Kondisi tersebut berpotensi meningkatkan

polutan termasuk merkuri. Berdasarkan uji

pendahuluan, diketahui bahwa salinitas

rerata di hilir Kali Mas Surabaya adalah

10‰.

II METODOLOGI

Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilakukan pada bulan

Januari-Mei 2011 di Laboratorium

Mikrobiologi dan Bioteknologi Jurusan

Biologi ITS. Analisa kandungan merkuri

dilakukan di Laboratorium Kwanti/Analisa

Makanan Universitas Surabaya (UBAYA).

Pengambilan Sampel

Sampling dilakukan dengan

mengambil air dan sedimen di hilir Kali Mas

Surabaya pada koordinat S: 07o11’57.8” dan

E: 112o44’06.8” (Garmin, Etrex 12

Channel®, Taiwan). Botol film steril

dimasukkan ke dalam kolom air dengan arah

mulut berlawanan dengan arus sungai. Tutup

botol dibuka di dalam air dan dibiarkan

terisi air hingga penuh kemudian ditutup

pada posisi masih di bawah kolom

air.Sedimen diambil dengan Ekman Bottom

Grab yang dimasukkan ke dalam kolom air

hingga mencapai dasar sungai. Selanjutnya

Ekman Bottom Grab ditarik. Botol steril

dimasukkan ke dalam tumpukan sedimen,

tutup botol dibuka di dalam tumpukan

sedimen dan sedimen dimasukkan ke dalam

botol film hingga penuh. Kemudian botol

film ditutup pada posisi masih di dalam

sedimen..

Isolasi Bakteri

Sampel air dan sedimen yang telah

diambil dilakukan secara terpisah tetapi

dilakukan dengan metode yang sama yaitu

metode pengenceran bertingkat dan

dilanjutkan dengan metode sebar.

Selanjutnya dilakukan pengenceran

bertingkat. Hngga didaptkan 10-5 untuk

sampel air dan 10-7 untuk sampel sedimen.

Tiga pengenceran terakhir masing-masing

diambil 100 m dengan menggunakan pipet

mikro dan diteteskan ke permukaan medium

padat NA 10‰-HgCl2 10 ppm. Inokulum

kemudian diratakan dengan spatel

Graygalsky. Kultur biakan selanjutnya

diinkubasi dalam inkubator pada suhu 37oC

dan diamati setiap 24 jam selama 2 hari.

Purifikasi Isolat

Koloni yang tumbuh dipurifikasi

sampai diperoleh isolat murni. Satu koloni

isolat bakteri diambil dari cawan petri secara

aseptis dan inokulasikan ke permukaan

medium padat NA 10‰-HgCl2 10 ppm,

dengan metode 16 goresan dan diinkubasi

dalam inkubator pada suhu 37oC selama 24

jam.. Pemindahan koloni isolat dilakukan

sebanyak 5 kali. Untuk mengetahui apakah

dalam tiga kali pemindahan telah didapatkan

isolat murni, maka dilakukan pengamatan

bentuk sel secara mikroskopis dengan cara

pewarnaan sederhana.

Pengamatan Makroskopis dan

Mikroskopis

Pengamatan makroskopis adalah

pengamatan bentuk pertumbuhan koloni

bakteri yang tumbuh dipermukaan medium

padat NA 10‰-HgCl2 10 ppm. Parameter

karakter koloni meliputi:

a. Bentuk koloni (dilihat dari atas):

berupa titik-titik, bulat, berbenang,

tak teratur, serupa akar, serupa

kumparan

b. Permukaan koloni (dilihat dari

samping): rata, timbul-datar,

melengkung, membukit, serupa

kawah

c. Tepi koloni (dilihat dari atas): utuh,

berombak, berbedah, bergerigi,

berbenang

d. Warna koloni : keputih-putihan,

kelabu, kekuning-kuningan atau

hampir bening.

Identifikasi Bakteri

Identifikasi bakteri berdasarkan

sistem Bergey’s Manual of Determinative

Bacteriology. Pada tahap awal identifikasi,

bakteri resisten merkuri dilakukan uji

morfologi dengan pewarnaan gram,

pewarnaan endospora dan pewarnaan tahan

asam.

Pewarnaan Gram

Preparat ulas ditetesi larutan kristal

violet sebanyak 2-3 tetes dan didiamkan

selama 1 menit, kemudian dicuci dengan air

mengalir. Gram’s iodine mordant (Emerck)

diteteskan sebanyak 2-3 tetes diatas

permukaan preparat lalu didiamkan selama 1

menit, kemudian dicuci dengan air mengalir.

Selanjutnya preparat ditetesi etil alkohol

95% setetes demi setetes sampai kristal

violet tercuci. Kemudian dicuci dengan air

mengalir kembali. Berikutnya preparat

ditetesi safranin selama 45 detik dan dicuci

dengan air mengalir, kemudian dikeringkan

dan diamati dengan mikroskop.

Pewarnaan Endospora

Preparat ulas ditempatkan pada rak

pewarna. Preparat ulas ditutup penuh dengan

kertas saring. Kemudian zat warna hijau

malakit diteteskan dengan pipet Pasteur ke

permukaan kertas saring secara merata dan

selanjutnya dipanaskan selama 5 menit dan

didinginkan. Setelah preparat dingin, kertas

saring saring dibuang dan preparat dibilas

dengan air yang mengalir dan

dikeringanginkan. Kemudian preparat

diwarnai dengan safranin selama 1 menit

dan dibilas dengan air yang mengalir dan

dikeringanginkan. Setelah itu ditutup dengan

gelas penutup. Preparat diamati di bawah

mikroskop dengan pembesaran 1000x

dengan minyak imersi yang diteteskan di

luar atas kaca penutup.

Pewarnaan Tahan Asam

Preparat ulas ditempatkan pada rak

pewarna. Karbol fuchsin diteteskan pada

preparat ulas. Selanjutnya dipanaskan

selama 5 menit. Preparat. Kemudian

didingin anginkan, lalu dicuci dengan air

mengalir dan dikering anginkan. Setelah itu

ditetesi alkohol asam setetes demi setetes.

Selanjutnya dicuci dengan air dan dikering

anginkan. Preparat kemudian ditetesi

metilen blue dan dibiarkan selama 2 menit.

Preparat dicuci dengan air dan dikeringkan.

Preparat diamati di bawah mikroskop

dengan pembesaran 1000x.

Uji Biokimia

Uji Fermentasi Karbohidrat

Karbohidrat yang digunakan adalah

glukosa, laktosa dan manitol. Medium

fermentasi antara lain 1% glukosa (Difco,

USA), 0.5% laktosa (Difco, USA), dan 0.5%

manitol (Difco, USA) yang masing-masing

dilarutkan ke dalam 100 ml medium cair

pepton water (Oxoid, Inggris)-10‰ NaCl

serta indikator bromthymol blue 0,1%

sebanyak 1 ml (EG-Kennzeichnung,

Jerman). Selanjutnya medium fermentasi

tersebut dimasukkan ke dalam tabung reaksi

yang telah berisi tabung Durham sebanyak 3

ml. Sebanyak satu ose isolat bakteri

diinokulasikan ke dalam medium

fermentasi tersebut secara aseptis dan

diinkubasikan selama 24 jam pada suhu

37°C (Noviani, 2002; Collins and Lyne,

1985).

Uji Pembentukan Indol

Satu ose isolat bakteri diinokulasikan

secara aseptis ke 3 ml medium cair Trptic

Soy Broth-10‰ NaCl dalam tabung reaksi.

Kemudian diinkunbasi selama 24 jam pada

suhu 370C dan setelah itu ditambahkan

dengan Kovacs reagent (Merck, Jerman)

(Cappuccino & Sherman, 2001). Hasil uji

positif ditandai dengan terbentuknya warna

merah.

Uji Produksi H2S Dan Gas

Isolat bakteri resisten merkuri

dinokulasikan secara aseptis ke medium

Triple Iron Sugar Agar (TSIA)-10‰ NaCl

dengan jarum inokulasi yang ujungnya

tajam yang telah mengandung isolat bakteri.

Selanjutnya, diinkubasi selama 24-48 jam

(Cappuccino & Sherman 1983). Uji positif

produksi H2S ditandai dengan terbentuknya

warna hitam pada medium. Uji positif

pembentukan gas ditandai dengan

terbentuknya gas di dasar medium, sehingga

medium naik ke atas.

Uji Motilitas

Uji motolitas ini dapat diperoleh dari

uji produksi H2S dan gas seperti yang telah

diuraikan pada paragraf sebelumnya. Uji

positif ditandai terbentuknya sebaran pada

daerah bekas inokulasi (tusukan) artinya

bakteri melakukan aktivitas bergerak

(motil).

Uji Kebutuhan Oksigen

Sebanyak 3 gram agar dan 29.5 gram

medium thioglycollate (Oxoid, CMO173®,

Inggris) dan 10 mg NaCl dilarutkan ke

dalam 1 liter akuades dan dipanaskan di atas

pemanas sampai agar larut dan homogenkan.

Kemudian medium dipindahkan ke dalam

tabung reaksi sebanyak 7 ml dan disterilisasi

dalam autoklaf pada suhu 121°C selama 15

menit dan tekanan 1,5 atm. Setelah

dikeluarkan dari autoklaf, tabung reaksi

yang berisi medium langsung dimasukkan

ke dalam bak yang berisi air yang telah

diatur suhunya setinggi 50°C untuk

mencegah terjadinya pemadatan agar.

Setelah suhu medium teradaptasi pada suhu

50°C, kemudian sebanyak satu ose isolat

bakteri berumur 24 jam di inokulasikan ke

dalam medium tersebut secara aseptis.

Tabung reaksi kemudian diputar dengan

bantuan telapak tangan, agar bakteri

terdistribusi merata di dalam agar. Setelah

masa inkubasi selama 48 jam pada suhu

37°C, pola pertumbuhan dari isolat bakteri

diamati.

Oksidase Fermentasi (OF)

Satu ose biakan bakteri yang

berumur 24 jam diinokulasikan pada 2

tabung ± 7 ml medium basal OF (Difco®,

USA)-10‰ NaCl, dengan karbohidrat yang

digunakan adalah 1% glukosa. Salah satu

tabung tersebut ditetesi dengan minyak steril

± 1 ml, lalu diinkubasi pada suhu 37oC

selama 24 jam. Hasil positif ditandai dengan

perubahan medium menjadi kuning.

Uji Penggunaan Sitrat

Satu ose biakan bakteri

diinokulasikan pada 5 ml medium padat

miring Simmons Citrat Agar (Difco®,

USA)-10‰ NaCl dalam tabung reaksi dan

indikator Bromthymol blue secara aseptis

lalu diinkubasi pada suhu 37oC selama 24

jam (Cappuccino &Sherman 1983). Hasil

positif ditandai dengan adanya pertumbuhan

bakteri dan medium pertumbuhan berubah

warna dari hijau menjadi biru. Sedangkan

hasil negatif sebaliknya (Cappuccino and

Sherman, 2001).

Uji Katalase

Sebanyak satu tetes H2O2 3%

diteteskan ke atas kaca objek steril

kemudian sebanyak satu ose isolat bakteri

digoreskan secara aseptis. Hasil positif

ditandai dengan timbulnya gas atau

gelembung udara di sekitar goresan bakteri

tersebut (Harley and Prescott, 2002).

Uji Oksidase

Satu ose isolat bakteri yang berumur

24 jam dioleskan ke permukaan kertas

oksidase (Oxoid, Inggris) secara aseptis.

Hasil uji positif apabila setelah 5 detik

terbentuk warna ungu pada kertas oksidase

tersebut (Harley, 2002).

Uji Ornithin Decarbaoxylase

Satu ose isolat bakteri yang berumur

24 jam diinokulasikan pada tabung reaksi

yang berisi medium ornithin broth. Bagian

atas medium kemudian ditetesi dengan

minyak steril. Selanjutnya diinkubasi pada

suhu 370C selama 24 jam. Hasil positif

ditandai dengan terbantuknya warna ungu-

biru. Hasil negatif terbentuk warna kuning.

Rancangan Percobaan dan Analisis Data

Data yang diperoleh dianalisa secara

deskriptif. Isolat bakteri yang telah

dipurifikasi, dideskripsikan karakteristik

secara makroskopis, mikroskopis dan

karakter biokimia sesuai dengan buku

panduan Bergey’s Manual of Determinative

Bacteriology.

III PEMBAHASAN

Nutrient Agar (NA) mengandung

NaCl sebesar 10‰ dan HgCl2 sebesar 10

ppm. Salinitas medium NA dikondisikan

sama dengan rerata salinitas di hilir Kali

Mas Surabaya, supaya tidak terjadi tekanan

osmotik yang menyebabkan sel bakteri lisis.

Medium dikondisikan mengandung 10 ppm

merkuri, karena menurut Canstein et al.,

(2002) isolat bakteri yang dapat tumbuh

pada medium sintesis dengan minimal 5

ppm HgCl2 merupakan isolat bakteri resisten

merkuri tinggi. Dalam penelitian ini

diperoleh 24 isolat bakteri, yang terdiri dari

13 isolat bakteri dari sedimen dengan kode:

S1Hg, S2Hg, S3Hg, S4Hg, S5Hg, S6Hg,

S7Hg, S8Hg, S9Hg, S10Hg, S11Hg, S12Hg,

dan S13Hg, serta 11 isolat bakteri dari air

dengan kode: A1Hg, A2Hg, A3Hg, A4Hg,

A5Hg, A6Hg, A7Hg, A8Hg, A9Hg, A10Hg

dan A11Hg. Jumlah isolat yang didapat dari

sedimen lebih banyak daripada dari air. Ini

mungkin karena disedimen kandungan

merkuri lebih banyak daripada di air. Hal

tersebut berkaitan dengan berat atom

merkuri yaitu sebesar 200.58 g/mol,

sehingga relatif cenderung mengendap di

sedimen. Gambar 1 menunjukkan

kemurnian dan bentuk sel ke-24 isolat

bakteri resisten merkuri. Berdasarkan

pewarnaan Gram dan bentuk sel ke-24

isolat bakteri dikelompokkan menjadi 4

kelompok besar, yaitu: 1).Bakteri Gram

Positif Basil, 2).Bakteri Gram Negatif Basil,

3).Bakteri Gram Positif Kokus, 4).Bakteri

Gram Negatif Kokus.

Gram Positif Basil

Isolat bakteri yang termasuk Gram

positif basil adalah: S1Hg, S3Hg, A7Hg.

Hasil uji biokimia ke-3 isolat bakteri

tersebut cenderung masuk ke dalam 2 genus

yang berbeda, yaitu Bacillus spp. (S1Hg,

S3Hg) dan Mycobacterium spp. (A7Hg)

(Gambar2)

Gram Negatif Basil

Isolat bakteri yang masuk dalam

kelompok bakteri Gram negatif basil adalah:

S4Hg, S11Hg, S13Hg, A5Hg, A10Hg.

Berdasarkan kunci identifikasi bakteri ke-5

isolat bakteri cenderung berasal dari 3 genus

yang berbeda, yaitu Escherichia (A5Hg),

Providencia (S4Hg, S11Hg, S13Hg) dan

Erwinia (A10Hg) (Gambar 3).

Gram Positif Kokus

Isolat Bakteri yang termasuk dalam

Gram positif kokus adalah: S2Hg, S5Hg,

S7Hg, S10Hg, A8Hg, A11Hg. Berdasarkan

kunci utama identifikasi bakteri dari 6 isolat

bakteri tersebut cenderung masuk dalam 2

genus yang berbeda yaitu Staphylococcus

(S2Hg, S10Hg, A8Hg, A11Hg) dan

Micrococcus (S5Hg, S7Hg) (Gambar 4).

Gram Negatif Kokus

Isolat bakteri yang masuk dalam Gram

negatif kokus adalah: S6Hg, S8Hg, S9Hg,

S12Hg, A1Hg, A2Hg, A3Hg, A4Hg, A6Hg,

A9Hg. Dari 10 isolat tersebut, 9 isolat

bakteri cenderung masuk dalam genus

Azotobacter (S6Hg, S8Hg, S9Hg, A1Hg,

A2Hg, A3Hg, A4Hg, A6Hg, A9Hg),

sedangkan 1 isolat bakteri masuk kedalam

genus Neisseria (S12Hg) (Gambar 5).

V KESIMPULAN

Dari hilir Kali Mas didapatkan 24

isolat bakteri yang tahan terhadap HgCl2 10

ppm dan NaCl 10‰. Berdasarkan karakter

mikroskopis, makroskopis dan 13 karakter

biokimia yang diuji, ke-24 isolat bakteri

tersebut cenderung masuk ke dalam 9 genus

yang berbeda, yaitu: Bacillus,

Mycobacterium, Escherichia, Providencia,

Erwinia, Staphylococcus, Micrococcus,

Azotobacter dan Neisseria.

DAFTAR PUSTAKA

Canstein HV, Li Y, Leonhauser J, Haase E,

Felske A, Deckwer WD, dan

Dobler IW, 2002. Spatially

Oscillating Activity and Microbial

Succession of Mercury-Reducing

Biofilms in a Technical-Scale

Bioremediation System. Appl.

Environ. Microbiol. 68: 1938-

1946

Cappuccino, J.G. & Sherman, N. 1983.

Microbiology: A Laboratory

Manual. Addison-Wesley:

California.

Harley, J.P. and L.M. Prescott. 2002.

Laboratory Exercises in

Microbiology, 5th Edition. The Mc

Graw Hill Companies : New York

Holt, J.G., N.R. Krieg, P. Sneath, J. T.

Staley and S.T. Williams. 1994.

Bergey’s Manual of

Determinative Bacteriology. 9th

Edition. Williams and Wilkins

Pub: USA.

Liebert, C.A., Hall, R.M. and Summers,

A.O. 1999. Transposon Tn21,

flagship of the floating genome.

Microbiol.Mol. Biol. Rev. 63:

507-522.

Nofiani dan Gusrizal. 2004. Bakteri Resisten

Merkuri Spektrum Sempit dari

Daerah Bekas Penambangan Emas

Tanpa Izin (PETI) Mandor,

Kalimantan Barat. Jurnal Natur

Indonesia. 6(2): 67-74