02a analisis senyawa aktif berbasis mikrobiologi dan imunokimia.pdf

37
ANALISIS SENYAWA AKTIF BERBASIS MIKROBIOLOGI DAN IMUNOKIMIA Marlia Singgih Wibowo Sekolah Farmasi ITB

Upload: ferdyan-pratama

Post on 18-Dec-2015

71 views

Category:

Documents


26 download

TRANSCRIPT

  • ANALISIS SENYAWA AKTIF BERBASIS MIKROBIOLOGI DAN IMUNOKIMIA

    Marlia Singgih WibowoSekolah Farmasi ITB

  • ANALISIS SENYAWA AKTIF

    |Analisis Kualitatif|Analisis Kuantitatif

  • Jenis metode analisis

    | Metode fisika| Metode kimia| Metode biokimia| Metode fisiko-kimia| Metode mikrobiologi| Metode berbasis imunologi| Metode molekuler

  • Metode mikrobiologi untukanalisis| Kualitatif :9 Uji langsung terhadap mikroba indikator9 Metode kultur untuk identifikasi makroskopik dan

    mikroskopik9 Metode alternatif (Dye-reduction Test, Electrical

    Methods, ATP Determination)9 Metode Cepat deteksi mikroba spesifik dan toksinnya

    (metode imunokimia, metode biologi molekuler)9 Uji toksisitas9 Uji mutagen

  • |Kuantitatif :9 Angka Lempeng Total (Total Plate Count)9 MPN (Most Probable Number)9 Uji potensi antibiotik9 Uji sterilitas 9 Uji koefisien fenol (uji desinfektan dan

    antiseptik)9 Uji efektivitas pengawet9 Uji endotoksin

  • Uji Mikrobiologi berdasarkanFarmakope Indonesia edisi 4,1995 :

    z Uji Batas Mikrobaz Uji Sterilitasz Uji Efektivitas Pengawetz Penetapan Potensi Antibiotikz Penetapan Aktivitas Vitamin B12z Penetapan Kadar Kalsium Pantotenat

  • Penetapan Potensi Antibiotik

    | Aktivitas (potensi) suatu antibiotik dapatditunjukkan pada kondisi sesuai dengan efekdaya hambatnya terhadap mikroba uji

    | Perbedaan kadar dan potensi| Dua metode umum : cara lempeng dan cara

    tabung| Cara lempeng : menggunakan kertas cakram

    atau selinder baja, efek difusi antibiotik padamedium agar.

    | Cara tabung : turbidimetri, efek larutanantibiotik terhadap turbiditas mikroba

  • Penetapan Aktivitas Vitamin B12

    | Dilakukan menggunakan bakteri ujiLactobacillus leichmanii dengan metodeturbidimetri

    | Pembanding larutan baku SianokobalaminBPFI berkisar antara 0,01 0,04 ng per mL. Blanko menggunakan air.

    | Metode spektrofotometri pada panjanggelombang 530 nm.

    | Penetapan kadar dihitung melalui kurva baku

  • Penetapan Kadar Kalsium Pantotenat

    | Dilakukan menggunakan bakteri ujiLactobacillus plantarum dengan metodeturbidimetri

    | Pembanding larutan baku Kalsium pantotenatBPFI berkisar antara 0,01 0,04 g per mL. Blanko menggunakan air.

    | Metode spektrofotometri pada panjanggelombang 660 nm.

    | Penetapan kadar dihitung melalui kurva baku

  • Metode analisis berbasisimunokimia| Beberapa istilah :z Antigen (Ag)z Antibodi (Ab)z Reaksi Ag-Abz Senyawa label (penanda)z Visualisasi reaksi Ag-Abz Pengukuran kompleks reaksi

  • Bahan yang dapat dianalisisdengan metode imunokimia

    | Mikroba patogen danatau toksin mikroba

    | Toksin tanaman, hewan| Protein spesifik atau

    senyawa lain yang berstruktur spesifik

    | Senyawa obat (narkotik, psikotropik)

    | Senyawa pestisida

  • Antigen| Antigen (Antibody Generator) adalah

    senyawa yang dapat menstimulasiterbentuknya antibodi dalam sistem imunmamalia dan bereaksi spesifik denganantibodi yang dipicunya

    | Sifat Imunogenik : Senyawa yang dapatmemicu sistem imun mamalia

    | Sifat Antigenik : senyawa yang dapatbereaksi spesifik dengan antibodi

    | Syarat : BM tinggi (>5000), struktur kimiakompleks. (bila BM rendah dapat dikonjugasidengan protein carrier agar bersifatimunogenik)

  • Bagaimana antibodi dapatmengenali antigen?

  • Antibodi

    | Hasil reaksi humoral sel B dalamlimpa mamalia

    | Spesifik terhadap antigen yang memicunya

    | Imunoglobulin : IgA, IgD, IgM, IgE, IgG

  • Reaksi Imunologi yang terjadidalam tubuh mamalia

    AgAb Reaksi primer

    Reaksisekunder

    Reaksi tersier(degranulasi,opsonisasi)

    (Fiksasi komplemen, aglutinasi, presipitasi)

    Label

  • Bagaimana penelitimengembangkan analisisimunokimia?

    | Reaksi primer menjadi dasar analisiskarena sangat sensitif

    | Reaksi Ag-Ab sangat spesifik dan kuat| Penggunaan senyawa label untuk men-

    visualisasi reaksi| Penggunaan instrumen analisis fisiko-kimia

    untuk deteksi hasil reaksi

  • Reaksi spesifik Antigen-Antibodi

  • Metode analisis berbasisimunokimia (sesuai labelnya)

    | EIA / ELISA (Enzyme Immuno Assay atau Enzyme Linked-ImmunosorbentAssay)

    | RIA (Radio Immuno Assay)| IFA (Immuno Fluoresence Assay)| LIA (Luminescence Immuno Assay)

  • Senyawa label (penanda)

    | Senyawa yang dikonjugasi padaantigen atau antibodi untuk dapatmem-visualisasi reaksi Ag-Ab

    | Dapat berupa enzim, senyawaberfluoresensi, radioaktif, dll.

    | Reaksi amplifikasi dapat dilakukansehingga dapat diukur secarafisikokimia

  • Beberapa contoh label

    | Enzim : Horse radish peroxidase (HRP), Alkaline Phosphatase (AP)

    | Senyawa berfluoresensi : Fluorescein, Umbelliferon, Tetrametil rodhamin

    | Senyawa Luminescence : Luciferin| Partikel : Tanned erythrocyte,

    senyawa koloid, microsphere , gold, silver

    | Vesikel : liposom

  • Prinsip reaksi pada ELISA

    Antigen

    Antibodi

    KompleksAg-Ab

    Konjugatenzim padaAg-Ab

    Substrat

    Produkberwarna

    Reaksienzimatik

  • Reaksi amplifikasi dalamImunokimia

    Ag

    Ab1 Ab2

    Label1

    Label2

    Label3 Produk

    Substrat

    Diukur secara

    fisikokimia

  • Komponen dalam analisisberbasis imunokimia| Antigen| Antibodi| Media penyangga reaksi| Larutan Dapar pelarut| Larutan Dapar pencuci| Senyawa Label| Substrat| Senyawa penghenti reaksi| Instrumen pendeteksi hasil reaksi

  • Penyangga reaksi (96-well microtiter plate)

  • Suatu larutan atau suspensi antigen (dapat pula dilakukan sebaliknya yaitu dengan memasukkan antibodi terlebih dahulu) dimasukkan kedalam sumur pelat solid, lalu diinkubasi pada suhu tertentu selama waktu tertentu pula (sesuai dengan jenis antigen dan antibodi yang digunakan), laluditambahkan larutan pemblok untuk menghindari ikatan non-spesifik

  • Larutan antibodi B (anti-antigen A) dimasukkan kedalam sumur pelat tersebut setelah proses pencucian. Kompleks A-B akan terbentuk dengan kuat. Suatu konjugat antibodi C (anti-antibodi B) dengan suatu Label (misalnya suatu Enzim)ditambahkan sehingga akan membentuk kompleks A-B-C-Enz.

  • Penambahan substrat tertentu akan menyebabkan terbentuknya warna dan reaksi warna dihentikan dengan penambahan senyawa lain agar warna yang terbentuk stabil pada saat pengukuran.

  • Warna yang terbentuk diukur intensitasnya dengan menggunakan alat spektrofotometer. Konsentrasi yang terukur akan sebanding dengan antigen yang terikat pada reaksi yang terjadi

  • Tahapan dalam metoderadioimunokimia

  • Tahapan dalam EIA

  • Alat yang digunakan a.l : mikropipet

  • Contoh analisis denganmetode imunokimia| Deteksi morfin dalam darah| Deteksi hormon dalam urin (test

    kehamilan)| Deteksi toksin mikroba patogen

  • Sumber kesalahan dalamanalisis imunokimia| Kesalahan Random/Acak

    (imprecision)| Kesalahan sistemik (inaccuracy)

  • Kesalahan acak| Pipeting : masalah desain pipet itu sendiri, cara

    menggunakan dan hal teknis dalam penggunaanpipet (volume yang dikeluarkan, dll)

    | Pemisahan padatan dari cairan : proses pembtknendapan yang tergantung pada waktu, kecepatan, suhu, dll, pencucian yang tidak sempurna, dll.

    | Kondisi Reaksi Biokimia : konstanta kesetimbanganantibodi, waktu, suhu

    | Jumlah radioaktif : untuk proses RIA| Intensitas fluoresensi yang terjadi : untuk proses IFA| Kesalahan spektrofotometrik| Stabilitas pereaksi

  • Kesalahan sistemik

    | Kesalahan mempipet : masalah kalibrasialat, bentuk pipet, dll

    | Interferensi dalam reaksi : terjadinya non-specific binding, inhibisi enzim, pendarancahaya, adanya pengaruh enzimendogen, pengaruh obat lain yang digunakan , pengaruh senyawa endogen lainnya (bilirubin, dll)

    | Efek matriks

    ANALISIS SENYAWA AKTIF BERBASIS MIKROBIOLOGI DAN IMUNOKIMIAANALISIS SENYAWA AKTIFJenis metode analisisMetode mikrobiologi untuk analisisUji Mikrobiologi berdasarkan Farmakope Indonesia edisi 4,1995 :Penetapan Potensi Antibiotik Penetapan Aktivitas Vitamin B12 Penetapan Kadar Kalsium PantotenatMetode analisis berbasis imunokimiaBahan yang dapat dianalisis dengan metode imunokimiaAntigenBagaimana antibodi dapat mengenali antigen?AntibodiReaksi Imunologi yang terjadi dalam tubuh mamaliaBagaimana peneliti mengembangkan analisis imunokimia?Reaksi spesifik Antigen-AntibodiMetode analisis berbasis imunokimia (sesuai labelnya)Senyawa label (penanda)Beberapa contoh labelPrinsip reaksi pada ELISAReaksi amplifikasi dalam ImunokimiaKomponen dalam analisis berbasis imunokimiaPenyangga reaksi (96-well microtiter plate)Suatu larutan atau suspensi antigen (dapat pula dilakukan sebaliknya yaitu dengan memasukkan antibodi terlebih dahulu) dimasukLarutan antibodi B (anti-antigen A) dimasukkan kedalam sumur pelat tersebut setelah proses pencucian. Kompleks A-B akan terbenPenambahan substrat tertentu akan menyebabkan terbentuknya warna dan reaksi warna dihentikan dengan penambahan senyawa lain agWarna yang terbentuk diukur intensitasnya dengan menggunakan alat spektrofotometer. Konsentrasi yang terukur akan sebanding deTahapan dalam metode radioimunokimiaTahapan dalam EIAAlat yang digunakan a.l : mikropipetContoh analisis dengan metode imunokimiaSumber kesalahan dalam analisis imunokimiaKesalahan acakKesalahan sistemik